拉米夫啶耐药及实验室检测

慢性乙肝诊断与治疗中的分子指标杨志军乙型肝炎病毒感染的现状全球约有3.5亿人感染乙型肝炎病毒，中国有1.2亿人感染，其中每年约有1-2%会出现肝硬化或肝癌而死亡HBV病毒颗粒感染肝细胞及DNA复制过程慢性乙肝的诊断HBsAg持续阳性6个月以上HBV-DNA高于105拷贝/毫升ALT持续升高或反复升高慢性乙肝的分类HBeAg阳性乙肝：HBsAg、HBeAg阳性；HBV-DNA高于105拷贝/毫升；ALT持续升高或反复升高HBeAg阴性乙肝：HBsAg、anti-HBe阳性；HBV-DNA高于104拷贝/毫升；ALT持续升高或反复升高诊断慢性乙肝的指标生化指标：ALT免疫学指标：HBsAg（携带指标）、HBeAg（活动指标）病毒学指标：HBV-DNAHBeAg阴性乙肝缺乏病毒活动的免疫学指标，前S1可以弥补这一缺憾，提供HBeAg阴性乙肝患者病毒活动的免疫学指标HBV-DNA检测的基本要求虽然国内HBV-DNA检测都用实时荧光PCR法，但不同厂家的产品定量标准的赋值有差异，从而导致定量结果的差异，而准确的定量结果直接影响到对病人的诊断以及治疗方案的选择复星HBV-DNA试剂是国内唯一一个经过标准品溯源的产品，标准品直接用国家标准定标，从而保证定量结果的准确可靠，能够为慢性乙肝患者的诊断和治疗提供更为客观的依据慢性乙肝治疗的长期目标防止发展成为肝硬化或肝细胞癌在临床上，往往以比较现实的短期目标来代替长期目标慢性乙肝治疗的短期目标病毒抑制：表现为HBeAg血清转换和HBV-DNA阴转肝损伤程度降低：表现为转氨酶恢复正常完全清除病毒：表现为HBsAg消失，HBsAb出现，血清和肝细胞中检测不到HBV-DNA从目前水平来看，不可能完全清除病毒治疗慢性乙肝的药物免疫调节剂：干扰素、PEG干扰素、胸腺肽核苷类似物：拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦等拉米夫定治治疗与转氨氨酶浓度拉米夫定治治疗一年后后的HBeAg阴转转率和HBV-DNA阴转率率：ALT浓度度低于2倍倍正常值高高限：5%ALT浓度度介于2-5倍正常常值高限：：26%ALT浓度度高于5倍倍正常值高高限：64%HBV-DNA定量量检测的临临床应用慢性乙肝诊诊断治疗监测和和疗效评价价跟踪随访预后判断HBV-DNA定量量—慢慢性乙肝的的诊断HBsAg阳性六个个月以上ALT持续续升高或反反复升高HBV-DNA大于于105拷贝/毫升升（HBeAg阳性性）或104拷贝/毫升升（HBeAg阴性性）HBV-DNA定量量—抗抗病毒治疗疗的条件ALT高于于2×ULN（正常常值上限））HBV-DNA大于于105拷贝/毫升升（HBeAg阳性性）或104拷贝/毫升升（HBeAg阴性性）ATL持续续正常的患患者可暂不不进行治疗疗，每隔3-6个月月随访肝功功能、血清清病毒学标标志物和进进行肝细胞胞肝癌监测测ALT水平平在1-2倍ULN之间，需需根据具体体情况(如如肝活检结结果等)，，在告知知患者治疗疗的利与弊弊、了解患患者配合程程度的前提提下，决定定是否实施施治疗。无无论治疗与与否均应密密切随访，，为治疗提提供更为科科学的根据据HBV-DNA定量量—慢慢性乙肝的的治疗监测测治疗前检测测患者的基基线水平（（ALT、、HBV-DNA））治疗开始后后前三个月月每月一次次、以后每每三个月一一次检测ALT、HBV-DNA，对对于HBeAg阳性性患者，还还需检测HBeAg如果治疗期期间HBV-DNA水平降低低两个数量量级，可以以认为治疗疗有效HBV-DNA定量量—疗疗效评价（（1）生化学应答答：完全应应答：2次次监测ALT均复常常(间隔1个月)；；无应答：：ALT未未恢复正常常。值得注注意的是评评价生化学学应答时应应排除其他他药物或疾疾病对ALT升高或或下降的影影响HBV-DNA定量量—疗疗效评价（（2）病毒学应答答：完全应应答按所采采用的HBVDNA检测方方法说明书书上提供的的实验敏感感性和检测测范围确定定，临床上上一般认为为采用国际际公认的检检测方法或或敏感性相相当的检测测方法检测测HBVDNA定定量<105拷贝/毫升升或斑点杂杂交法阴性性为完全应应答；部分分应答为未未达完全应应答标准但但HBVDNA载载量下降大大于2个对对数级；无无应答为未未达上述标标准HBV-DNA定量量—疗疗效评价（（3）血清免疫学学应答：完完全应答为为HBeAg/抗HBe血清清转换；部部分应答为为HBeAg阴转但但未出现抗抗HBe；；无应答为为未达上述述标准。HBV-DNA定量量—综综合疗效评评价（1））完全应答为为疗程结束束时，生化化学、病毒毒学和血清清免疫学所所有指标均均达到完全全应答HBV-DNA定量量—综综合疗效评评价（2））部分应答为为疗程结束束时，生化化学、病毒毒学和血清清免疫学指指标介于完完全应答和和无应答之之间HBV-DNA定量量—综综合疗效评评价（3））无应答为疗疗程结束时时，生化学学、病毒学学和血清免免疫学指标标均为无应应答HBeAg阴性伴HBVDNA活跃跃复制的慢慢性乙型肝肝炎患者不不进行血清清免疫学应应答评价，，但应进行行生化学和和病毒学指指标的疗效效评价HBV-DNA定量量—何何时可以停停药（1））治疗前HBeAg阳阳性的患者者，治疗1年时综合合疗效达到到完全应答答者建议至至少继续用用药6个月月，期间每每3个月1次复查ALT、HBVDNA、HBeAg/抗HBe，仍持续续完全应答答者可停药药观察HBV-DNA定量量—何何时可以停停药（2））治疗前HBeAg阳阳性的患者者，治疗1年时综合合疗效达到到部分应答答者建议继继续用药直直至达到完完全应答后后，再继续续用药至少少6个月，，期间每3个月1次次复查ALT、HBVDNA、HBeAg/抗HBe，仍持续续完全应答答者可停药药观察HBV-DNA定量量—何何时可以停停药（3））治疗前HBeAg阳阳性患者治治疗1年时时综合疗效效仍无应答答可停药观观察，或改改用其他有有效的抗病病毒药治疗疗。对于有有肝脏组织织学检查等等其它临床床指征显示示病情进展展合并肝功功能失代偿偿或肝硬化化的病人，，不宜轻易易停药，并并应加强对对症保肝治治疗HBV-DNA定量量—何何时可以停停药（4））HBeAg阴性伴HBVDNA活跃跃复制的慢慢性乙型肝肝炎患者，，综合疗效效完全应答答者疗程至至少2年；；对于完成成1年治疗疗仍无应答答者可改用用或加用其其他有效治治疗方案案HBV-DNA定量量—治治疗后的随随访无论有否治治疗应答，，都应对患患者定期随随访。建议议停药后的的前3个月月每月1次次、以后每每3～6个个月1次检检测ALT、AST、HBV血清标志志物和HBVDNA，以及及临床表现现和不良反反应。随访访至少6-12个月月。如病情情有变化，，可随时随随访。HBV拉米米夫定耐药药虽然拉米夫夫定治疗慢慢性乙肝疗疗效显著，，但长期使使用拉米夫夫定会出现现耐药现象象使用一年、、二年、三三年、四年年的耐药比比率为：15-32%、38%、56%、67%一旦出现拉拉米夫定耐耐药突变（（YMDD变异），，大多数患患者会在2-4个月月之内出现现HBV-DNA和和ALT反反弹YMDD变变异检测采用实时荧荧光定量PCR方法法，不仅能能够检测出出现的突变变类型（YVDD或或YIDD），而且且能够确定定突变株所所占比例，，对及时调调整治疗方方案具有非非常重要的的意义能够准确稳稳定的检测测到1%的的突变株，，能够更早早发现耐药药突变，尽尽早调整治治疗方案HBV拉拉米夫定耐药药突变检测测试剂原理理PrimerFPrimer

FPrimer

FProbeProbeProbePrimer

HBVPrimer

YIDDPrimer

YVDDHBV检测测I突变检测测V突变检测测YMDD的的定量检测测采用选择性性引物，基基于TaqMan实实时PCR技术，在在三个平行行反应中分分别扩增总总HBV(C管）、、YIDD（I管））、YVDD（V管管），根据据管间Ct值差异计计算突变毒毒株在病毒毒群体中的的比例YMDD的的定量检测测YMDD的的定量检测测YMDD的的定量检测测YMDD的的定量检测测YMDD的的定量检测测与其它方法法的比较Comparisonofresultsobtainedbysequencing,pyrosequencingandreal-timePCRTypes Sequencingpyrosequencingreal-timePCRrtM204 25(36%)24(35%)23(33%)rtM204I26(38%)24(35%) 21(30%)rtM204V18(26%)19(27%) 20(29%)rtM204I+rtM204V 02(3%)5(8%)YMDD变变异定性判判断的临界界值定性判断：：ΔCt<3.5，此时病毒毒群体中突突变株比例例大于10%与测序法比比较，15例标本结结果完全符符合YMDD变变异定性判判断的临界界值Wangetal,WJG,12:1308-1311什么时候开开始检测YMDD变变异拉米夫定治治疗过程中中YMDD变异情况况治疗时间HBVDNA大于104copies/ml例数YMDD变异例数数*<6个月月 61（（17%））6~12个个月2614（54%）12~24个月3826（（68%））24~36个月3838（（100%）*各组之之间两两比比较均有显显著差异（（P<0.05）。。YMDD变变异株的动动态变化YMDD变变异株的动动态变化YMDD检检测试剂——应用方法法对接受拉米米夫定治疗疗的慢性乙乙肝患者进进行耐药监监测治疗前检测测一次（约约有10-20%的的人在治疗疗前就有YMDD变变异）治疗疗开开始始后后第第七七个个月月开开始始，，每每三三个个月月检检测测一一次次慢性性乙乙肝肝的的基基因因分分型型乙肝肝病病毒毒分分八八个个基基因因型型：：根根据据基基因因组组序序列列的的差差异异可可以以分分为为A～～H八八种种亚亚型型，，我我国国以以B型型（（41%））和和C型型（（53%））为为主主不同同基基因因型型病病毒毒感感染染的的病病程程和和后后果果不不同同：：C型型对对肝肝的的损损伤伤比比B型型严严重重，，基基因因型型C比比基基因因型型B更更容容易易发发展展成成为为肝肝硬硬化化不同同的的基基因因型型对对药药物物的的应应答答也也不不一一样样：：基基因因型型B比比基基因因型型C对对干干扰扰素素治治疗疗的的应应答答率率高高HBV基基因因分分型型PCR检检测测试试剂剂运用用多多重重、、多多色色实实时时PCR技术术，，分分别别对对乙乙肝肝病病毒毒（（HBV））各各种种基基因因型型序序列列进进行行分分析析根据据国国内内HBV基因因型型的的特特点点，，设设计计能能检检测测HBVA~D四种种基基因因型型特特异异性性引引物物及及探探针针研制制开开发发具具有有自自主主知知识识产产权权的的乙乙肝肝病病毒毒（（HBV））基基因因分分型型多多重重、、多多色色实实时时PCR检检测测试试剂剂盒盒HBV基基因因分分型型——结结果果判判断断方方法法B管（Ct<36）B管（Ct≥36）C管（Ct<36）B型、C型HBV复合感染2C型HBVC管（Ct≥36）B型HBV非B非C型，或HBV（-）HBV基基因因分分型型——分分型型识识别别率率分型型识识别别率率＝＝（（12+22））/35＝＝97％％样本数百分比B型1234%C型2263%未检出13%总计35100%HBV基基因因分分型型——分分型型灵灵敏敏度度（（1））HBVB型型血血清清样样本本灵敏敏度度约约在在2××103IU/mlHBV基基因因分分型型——分分型型灵灵敏敏度度（（2））HBVC型型血血清清样样本本灵敏敏度度约约在在1××103IU/ml共价价闭闭合合环环状状DNA(cccDNA)检检测测HBVcccDNA是乙乙肝肝病病毒毒前前基基因因组组RNA复制制的的原原始始模模板板只有有彻彻底底清清除除了了cccDNA，，乙乙肝肝的的治治疗疗才才能能算算真真正正有有效效HBVcccDNA可可作作为为评评价价抗抗病病毒毒治治疗疗效效果果新新的的有有效效指指标标HBVcccDNAPCR检检测测试试剂剂运用用实实时时PCR技技术术，，根根据据乙乙肝肝病病毒毒共共价价闭闭合合环环状状DNA（（cccDNA））和和双双链链松松弛弛环环状状DNA（（rcDNA））分分子子结结构构上上的的差差异异，，即即rcDNA负负链链上上的的缺缺口口和和正正链链的的不不完完整整性性，，设设计计一一对对特特异异性性cccDNA的的引引物物，，分分别别杂杂交交于于1500和和2100邻邻近近区区域域(以以EcoRI切切点点为为物物理理起起始始原原点点)，，同同时时设设计计一一条条杂杂交交于于负负链链3’’端端近近缺缺口口处处检检测测探探针针，，研研制制开开发发具具有有自自主主知知识识产产权权的的HBVcccDNA实实时时PCR检检测测试试剂剂盒盒。。HBVcccDNA检检测测试试剂剂原原理理rcDNA不能能被被扩扩增增无荧荧光光信信号号cccDNA能能被被扩扩增增检测到到荧光光信号号P118201590+3200（1）EcoRIP2－EcoRI5‘+P23200(1)5‘3‘15903‘1820－P1阿德福福韦治治疗乙乙型肝肝炎阿德福福韦为为5’-单磷磷酸脱脱氧阿阿糖腺腺苷类类似物物，可可明显显抑制制HBVDNA复复制HBeAg阳性性慢性性乙型型肝炎炎患者者，1、2、3年时时的耐耐药发发生率率分别别为0%、、1.6%、3.1%HBeAg阴性性者1、2、3年的的耐药药发生生率分分别为为0%、3.0%、、5.9%~11%阿德福福韦耐耐药突突变位位点rtN236T、rtA181V恩替卡卡韦治治疗乙乙型肝肝炎拉米夫夫定耐耐药的的病毒毒株对对恩替替卡韦韦敏感感性降降低8至30倍倍；发生YMDD变变异患患者治治疗1年年时对对恩替替卡韦韦耐药药发生生率为为5.8%，并并出现现相关关的位位点变变异。。恩替卡卡韦耐耐