酶化学III-作用机制课件

酶的作用机制和活性调节一、酶的活性部位

1、活性中心的概念

酶是蛋白质，研究表明，酶的特殊催化能力只局限于在大分子的一定区域，也就是说只有少数特异的氨基酸残基参与底物结合及催化作用。这些特异的氨基酸残基比较集中的区域，即与酶活力直接相关的区域称为酶的活性部位(activesite)或活性中心(activecenter)。参与构成酶的活性中心和维持酶的空间构象所必需的基团称为酶分子的必需基团(necessarygroup)组成酶活性中心的氨基酸侧链基团主要有Glu和Asp的-COOH，Lys的ε-NH2，His的咪唑基，Ser的-OH，Cys的-SH，Tyr的侧链基团结合部位催化部位酶活性中心

结合部位：负责与底物结合，决定酶的专一性催化部位：负责催化底物键的断裂形成新键，决定酶的催化性质和催化能力2、活性中心与必需基团

调控部位(Regulatorysite):

酶分子中存在着一些可以与其他分子发生某种程度的结合的部位，从而引起酶分子空间构象的变化，对酶起激活或抑制作用3、活性中心的特点

活性部位在酶分子的总体中只占相当小的部分，通常只占整个酶分子体积的1%~2%几乎所有的酶都由100多个氨基酸残基组成，而活性部位只有几个氨基酸残基所构成，酶分子的催化部位一般只由2~3个氨基酸残基组成，而结合部位的残基数目因不同的酶而异，可能是一个，也可能是数个牛胰核糖核酸酶A124His12His119Lys41溶菌酶129Asp52Glu35木瓜蛋白酶212Cys25His159枯草杆菌蛋白酶275His64Ser221胰凝乳蛋白酶245His57Asp102Ser195酶氨基酸残基数活性中心残基碳酸酐酶258His93—Zn—His95↓His117一些酶活性中心的氨基酸残基

酶的活性部位是一个三维实体

酶的活性中心是一个三维结构，组成活性中心的氨基酸残基在一级结构上可以相距很远，可能位于同一条肽链的不同部位也可能位于不同的肽链上，但通过肽链的折叠，在空间结构上都处于十分临近的位置。活性部位的三维结构是由酶的一级结构决定且在一定外界条件下形成的。酶的高级结构受到影响，酶的活性部位会遭到破坏，表现为酶活力的下降或丧失酶与底物的诱导契合

酶活性部位的柔性或可运动性在研究酶的变性过程中发现，当酶分子的整体构象还没有受到明显影响之前，活性部位已大部分被破坏，因而造成活性的丧失，说明酶的活性部位相对于整个酶分子来说更具柔性，这种柔性很可能正是表现其催化活性的一个必要因素

酶和底物之间的作用力

酶与底物之间通过次级键相互识别和结合

非特异性共价修饰：修饰剂和氨基酸残基的侧链基团反应引起共价结合、氧化或还原等修饰反应非必需基团：修饰后不引起酶活力的变化必需基团：修饰后引起酶活力降低或者丧失必需和非必需基团的鉴别判断必需基团的实验依据：

酶活力丧失程度和修饰剂浓度成一定比例关系

底物或与活性部位结合的可逆抑制剂可保护共价修饰剂的抑制作用例1：DFP或DIFP(二异丙基氟磷酸)对丝氨酸的共价修饰特异性共价修饰：修饰剂专一地修饰酶活性部位的某一氨基酸残基，使其失活例2:TPCK(N-对甲苯磺酰苯丙酰氯甲基酮)TPCK修饰His，使His烷基化(2)、X-射线晶体结构分析法X-射线晶体结构分析可以解析酶分子的三维结构，有助于了解酶活性部位氨基酸残基所处的相对位置和实际状态，以及与活性部位有关的其他基团1965年Phillips等人解析溶菌酶的空间结构及其作用机制

通过三维结构可以看出：活性部位有关氨基酸的排列位置酶-底物复合物中，底物周围氨基酸的排列状况

根据被水解的糖苷键邻近氨基酸分析，确定催化基团为Glu35和Asp52胰凝乳蛋白酶活性部位的分析SerAspHis

Ser195、

His57、

Asp102联在一起形成“电荷中继网”，使得Ser195的羟基具有非常高的亲和性

Ile16是胰凝乳蛋白酶原转变成酶的关键1985年Gardell将羧肽酶A突变：Tyr248Phe248，结果：kcat和天然酶一样，Km值高出6倍说明Tyr248主要参与底物的结合，与催化活性无关1987年Craik将胰蛋白酶突变：Asp102Asn102，导致kcat低5000倍，水解酯的活性仅为天然酶的10-4

说明对蛋白酶的催化活性是必需的定点突变研究活性中心的实例：二、影响酶催化效率的因素(一)底物和酶的邻近效应与定向效应

邻近效应(approximation,proximity)

指两个反应的分子，它们反应的基团需要互相靠近，才能反应定向效应(orientation)

定义：由于活性中心的立体结构和相关基团的诱导和定向作用，使底物分子中参与反应的基团相互接近，并被严格定向定位，使酶促反应具有高效率和专一性特点

定向效应包括：

反应物的反应基团之间(双底物反应基团邻近)酶的催化基团和底物的反应基团

活性中心内的定向使反应变为分子内反应

酶在发挥作用前，必须与底物密切结合

酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、相互变形和相互适应，进而相互结合

酶的构象改变有利于底物结合；底物在酶的诱导下发生变形，处于不稳定状态(过渡态)，易受催化基团进攻

过渡态的底物与酶的活性中心结构最相吻合(三)酸碱催化(acid-basecatalysis)定义：酸碱催化是通过瞬时的向反应物提供质子或者从反应物接受质子从而稳定过渡态，加速反应的一类催化机制

专一的酸碱催化(狭义酸碱催化)

在水溶液中通过高反应性的H+和OH-进行的催化，即强酸强碱的催化。细胞一般处于中性pH条件下，H+和OH-浓度很低，因此细胞环境通常不是专一的酸碱催化总酸碱催化(广义酸碱催化)

通过H+和OH-以及能够提供H+和OH-的供体进行的催化，生理条件不是强酸强碱而是近于中性的环境，因此高反应性的H+和OH-环境不存在，因此广义的酸碱催化指的是细胞内的弱酸弱碱参与的接受H+和提供H+的催化许多酶的活性部位存在几种参与总酸碱催化作用的功能基团，如氨基、羧基、巯基、酚羟基以及咪唑基，它们能在近中性的pH范围内作为质子受体或者供体

影响酸碱催化反应速率的因素：酸或者碱的强度(pK值)质子传递速率例：His的重要性

咪唑基pK约为6.0，在生理pH下,酸和碱形式共存，可接受质子和提供质子质子传递速率十分迅速，其半衰期小于10-10s从进化上推测His不是作为蛋白的结构成分，而是被选择作为酶分子的催化结构而保留下来(四)共价催化(covalentcatalysis)定义：

又称亲核催化(nucleophiliccatalysis)或亲电催化(electrophiliccatalysis)，在催化时，亲核催化剂或者亲电催化剂能够分别放出电子或汲取电子并作用于底物的缺电子中心或负电中心，迅速形成不稳定的共价中间复合物，降低反应活化能，使反应加速

亲核催化

未成键电子对进攻缺电子中心形成共价结合，迅速形成不稳定的共价中间复合物，降低反应活化能，促使产物生成(五)金属离子催化需要金属的酶(1/3的酶)金属酶(metalloenzymes)：

含紧密结合的金属离子，多属于过渡金属如Fe2+

、Fe3+

、Cu2+

、Zn2+

、Mn2+

、Co3+金属激活的酶(metal-activatedenzymes)：

含松散结合的金属离子，通常为碱和碱土金属离子，如Na+

、K+

、Ca2+

、Mg2+金属离子以3种主要途径参与催化过程通过结合底物为反应定向

与底物分子形成络合键，作为金属桥参与催化通过可逆地改变金属离子的氧化态调节氧化还原反应

金属离子价键的变化，作为酶的辅助因子参与电子的转移，如Cu2+

、

Fe3+通过静电稳定或屏蔽负电荷激酶的底物是Mg2+-ATP复合物(六)活性部位微环境的影响

活性部位的疏水环境导致反应活性和反应速率的改变

非极性环境中的介电常数较水介质中要低非极性环境中两个带电荷基团间的静电作用比在极性环境中要显著提高

底物分子与酶的活性部位结合后，被埋没在疏水裂隙中，增强了底物分子与催化基团之间的作用力

疏水环境大大有利于酶的催化作用三、酶活性的调节(一)别构调节(allostericregulation)某些酶分子在活性中心外存在另一配体的结合部位(别构部位)别构部位与配体的结合使酶活性中心构象轻微变化而影响酶的功能

能与别构部位结合的配体称为别构效应剂，具有别构效应的酶称为别构酶

别构效应有别构激活(正协同效应)和别构抑制(副协同效应)

代谢底物经常是别构激活剂，而代谢产物往往是别构抑制剂

别构酶通常是寡聚酶催化亚基调节亚基别构激活别构酶动力学不符合米式方程(二)酶原激活酶原：某些活性酶的无活性前体蛋白酶原激活：无活性的酶原形成活性酶的过程

酶原激活的实质：活性中心的形成或暴露过程

酶原激活的常见形式：切下一段多余的肽链蛋白(酶)原活性蛋白(酶)蛋白(酶)原活性蛋白(酶)胃蛋白酶原胃蛋白酶凝血酶原凝血酶胰凝乳蛋白酶原胰凝乳蛋白酶胰岛素原胰岛素胰蛋白酶原胰蛋白酶纤维蛋白原纤维蛋白羧肽酶原羧肽酶胶原酶原胶原酶弹性蛋白酶原弹性蛋白酶胃蛋白酶原的激活胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活活性最高，但不稳定40%活性胰蛋白酶对胰腺分泌的各种蛋白酶原的激活作用胰蛋白酶原弹性蛋白酶原胰凝乳蛋白酶原羧肽酶原肠激酶六肽弹性蛋白酶胰蛋白酶羧肽酶胰凝乳蛋白酶(三)共价修饰

酶的共价修饰酶蛋白肽链上的一些基团可与某种化学基团发生可逆的共价结合，从而改变酶的活性，这种酶活性的调节方式称为共价修饰，能进行共价修饰的酶称为共价修饰酶共价修饰的特点：

在修饰过程中，酶的活性在无活性(或低活性)和有活性(高活性)两种状态中改变

共价修饰的互变是由不同的酶所催化的

酶活性属于快速调节

有激素信号启动的共价修饰会引起级联放大效应常见的共价修饰形式

磷酸化与去磷酸化(最常见形式)

甲基化与去甲基化

腺苷酰化与去腺苷酰化

尿苷酰化与去尿苷酰化乙酰化与去乙酰化

-SH与-S-S-互变磷酸化腺苷酰化尿苷酰化ADP-糖基化甲基化磷酸化与去磷酸化磷酸化与去磷酸化四、同工酶

(isoenzymeorisozyme)

同工酶

催化相同的化学反应，但其蛋白质分子结构、理化性质和免疫性能等方面都存在明显差异的一组酶

同工酶的特点：

同工酶都是寡聚酶

同工酶存在同一种属或同一个体的不同组织或者同一细胞的不同亚细胞结构中

同工酶是长期进化的产物

同工酶对进化、发育和细胞分化的研究具有重要意义

同工酶可用于疾病的诊断乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)是了解最清楚的同工酶它催化乳酸脱氢生成丙酮酸

LDH是四聚体蛋白，由两种亚基M(肌肉型)和H(心肌型)组成

LDH1H4LDH2H3MLDH3H2