液相色谱的分离机理及色谱柱课件

液相色谱的分离机理及色谱柱液相色谱的分离机理及色谱柱1选HPLC参数时的基本考虑溶解度-选择流动相的条件分子量-在样品预处理或GPC分析时有用样品的基质-考虑如何前处理在基质中样品的含量检测特性-有否紫外吸收?荧光?找出样品中不同组份之间的差异摸索条件的重要线索选HPLC参数时的基本考虑溶解度-选择流动相的条件2极性问题极性问题3液相色谱的分离机理正相反相体积排除离子交换其他不同的分离模式是不同的机理液相色谱的分离机理正相4吸附色谱的分离机理随着样品在固定相上的吸附能力由大到小在色谱柱上的保留由长到短吸附色谱的分离机理随着样品在固定相上的吸附能力由大到小5吸附色谱概述分离基于样品的极性差异。洗脱次序∶一般为正相，即：极性低的先被洗脱常用的流动相∶非极性有机溶剂，如己烷乙酸等为添加剂常用固定相∶硅胶、氧化铝等。吸附色谱概述分离基于样品的极性差异。6分配色谱的分离机理分配色谱的分离机理7分配色谱概述反相色谱的主要类型，基于分子的极性分离洗脱次序：一般为反相，即极性高的先被洗脱常用的流动相：有机溶剂如甲醇、乙腈，水应用添加剂，成为离子对、离子抑制方法常用固定相：碳十八、碳八、胺基等基团反相色谱固定相多为键合相?分配色谱概述反相色谱的主要类型，基于分子的极性分离8键合相色谱柱以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺基等基团联在基质上，作为固定相。优点∶固定相稳定，不易流失应用广泛，可使用多种溶剂消除硅羟基的不良影响缺点∶pH值不能小于3同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同键合相色谱柱以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺9体积排除色谱的分离机理体积排除色谱的分离机理10凝胶色谱概述凝胶渗透（GPC）、凝胶过滤（GFC）分离基于分子在溶液中的体积大小洗脱次序：大分子先被洗脱流动相不参与分离，只起溶剂作用分离效率低色谱行为容易预测凝胶色谱概述凝胶渗透（GPC）、凝胶过滤（GFC）11GPC的校正分子量大于V0或小于Vt的分子不能分离GPC的校正分子量大于V0或小于Vt的分子不能分离12液相色谱柱及分离机理的关系从色谱方法上分正相/反相离子交换分子体积排除亲合从柱子类型上分分配/吸附离子交换凝胶亲合液相色谱柱及分离机理的关系从色谱方法上分从柱子类型上分13液相色谱的方法开发（二）梯度方法液相色谱的方法开发（二）梯度方法14梯度洗脱的特点优点单位时间的分离能力增加检测灵敏度提高缺点仪器设备要求高不适合某些检测方式柱需再生定量分析的重复性较低梯度洗脱的特点优点15如不用梯度：分离不理想如不用梯度：分离不理想16梯度条件的优化梯度条件的优化17检测器检测器18对检测器的要求高灵敏度可重现的设置合适的带宽快速或可变的时间常数宽的线性响应容易使用及保养自我诊断功能对检测器的要求高灵敏度19检测器的种类检测器的种类20衡量检测器的指标灵敏度∶S=△R/△Q△R是检测器响应值的增量△Q是样品量的增量噪音∶没有样品时检测器的最大输出信号漂移∶检测器在一段时间内响应值的变化线性动态范围∶最大线性相应与最小检出限之比最小检测限∶样品产生两或三倍于噪音信号时的浓度信噪比∶S/N注意∶最小检测限不是一个单纯的检测器指标。它实际上是评价整个色谱系统的指标，包括了色谱系统、分离机理、色谱柱在内的综合性指标，信噪比亦如此衡量检测器的指标灵敏度∶S=△R/△Q21紫外-可见光检测器基于样品池(S)中的样品对光产生吸收，有信号差如是可变波长检测器，还有分光系统(光珊)紫外-可见光检测器基于样品池(S)中的样品对光产生吸收，有信22Beer'sLaw-BEER定律光能量∶P0=透过溶剂的光能量P=透过样品的光能量光通量(透过率%)∶T=P/P0吸光度∶A=-log(T)=log(P0/P)吸光度=单位吸光度×流动池长度×溶液浓度即∶A=abcBeer'sLaw-BEER定律光能量∶23同紫外检测器灵敏度有关的因素信号强度(S)从BEER定律可看出样品的种类样品浓度及进样的体积检测池的长度所使用的波长，检测器的

时间常数噪音(N)流动相所使用的波长，灯的能量检测器的时间常数非检测器因素-电噪音，泵脉动等同紫外检测器灵敏度有关的因素信号强度(S)24紫外检测器的溶剂影响不同种类溶剂有其截止波长溶剂的质量好坏对其截止波长有影响为何溶剂质量不好?含紫外吸收的杂质溶解在其中的氧气缓冲液溶质的紫外吸收紫外检测器的溶剂影响不同种类溶剂有其截止波长25示差折光检测器DifferentialRefractiveIndexDetector示差折光检测器DifferentialRefractive26示差检测器的注意事项不能做梯度实验最大的池耐压是100psi流速范围是0.3-10ml/min.示差检测器的注意事项不能做梯度实验27液相色谱的定性及定量技术液相色谱的定性及定量技术28色谱峰定性鉴别每个色谱峰通过比较保留值(通常是保留时间)的方法，找到各色谱峰所对应的组份大多数情况下用比较保留时间来定性 即所谓：保留时间相同，可能是同样的组份保留时间不同，肯定不是同样的组份色谱峰定性鉴别每个色谱峰29用保留时间定性用“标样”的保留值定出被测组份的位置用保留时间定性用“标样”的保留值定出被测组份的位置30进一步的确认标准加入同时用其他方法其他色谱方法（改变机理，如：用不同的色谱柱）其他检测器PDA，光谱图比较、谱库检索MS，质谱图解析、谱库检索其他仪器方法进一步的确认标准加入31定量分析的具体内容确定样品的类型，主要成分/痕量成分使分析条件的分离度（R）大于：1.5色谱峰的定性，峰一致性测定检测限及定量限：确定灵敏度及线性范围用标样建立标准曲线检查方法的准确度及精确度用标样定期检查方法定量分析的具体内容确定样品的类型，主要成分/痕量成分32痕量分析如信/噪比不够，定量的精确度会受影响，因此要：分析前浓缩样品选择高灵敏度检测器用衍生法使色谱体系最优化使用短的微径柱（减少样品的稀释）使用高效色谱柱使k'值尽可能小增加进样体积和浓度使用低流速（N增加）采用梯度淋洗痕量分析如信/噪比不够，定量的精确度会受影响，因此要：33常用的定量方法峰面积百分比法由于检测技术的影响，在液相色谱中不常用外标法在液相色谱中用的最多内标法准确，但是麻烦在标准方法中用的最多常用的定量方法峰面积百分比法34外标法定量配制一系列已知浓度的标样外标法定量配制一系列已知浓度的标样35外标法定量（二）实际色谱图标准曲线外标法定量（二）实际色谱图标准曲线36外标法定量（三）计算公式特点无需各组份都被检出、洗脱需要标样标样及样品测定的条件要一致进样体积要准确外标法定量（三）计算公式37内标法定量（一）配制一系列浓度的标样，其中加有内标样内标法定量（一）配制一系列浓度的标样，其中加有内标样38内标法定量（二）实际色谱图标准曲线内标法定量（二）实际色谱图标准曲线39内标法定量（三）计算公式：特点：无需各组份都被检出、洗脱需要标样，需要内标样结果与进样体积无关内标法定量（三）计算公式：40内标法定量（四）对内标物的要求化学结构与待测组分相似(同系物、异构体)在样品中不存在不与样品中组份发生任何化学反应保留值与待测组分接近浓度（响应值）与待测组分相当其色谱峰与其他色谱峰分离好内标法定量（四）对内标物的要求41峰面积百分比法定量公式：特点：各组分要全部流出、全部被检测，并对检测器的响应值一样简单，液相色谱目前很难做到这点与进样量无关不需标样简单峰面积百分比法定量公式：42可接收的检测范围校正曲线只有在建立这条曲线的浓度范围内有效，高或低于这些点都可能引起计算错误可接收的检测范围校正曲线只有在建立这条曲线的浓度范围内有效，43定量校正曲线曲线A：因在零浓度时仍有色谱峰，

可能有杂质未分开曲线B：在此浓度内，检测器的响应

值是非线性的曲线C：可接受的理想状态，实际情

况应是∶其延长线到零点曲线D：表明有样品的损失，可能是色谱柱的非特征吸附，也可能是样品制备时的损失定量校正曲线曲线A：44高效液相色谱仪的使用、保养

及注意事项高效液相色谱仪的使用、保养

及注意事45色谱柱的使用及保养流动相的转换特别是GPC柱流速(压力)的变化幅度温度的变化幅度专用色谱柱∶样品及溶剂的要求色谱柱的使用及保养流动相的转换46色谱柱的清洗对所做的样品要有充分的了解用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗硅胶柱的一般方法先用甲醇洗去极性杂质用干燥的二氯甲烷、正庚烷100~200ml依次活化键合相柱(烷基)的一般方法20倍柱体积的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次冲洗色谱柱的清洗对所做的样品要有充分的了解47色谱柱的存放存放前的处理除去杂质、盐合适的存放溶剂避免色谱柱床的干枯避免机械震动防止细菌生长注意存放的温度色谱柱的存放存放前的处理48在线的保护装置给色谱柱提供物理的保护除去样品及流动相中的颗粒给色谱柱提供化学的保护防止分析柱被化学污染装置在线过滤器自装填料保护柱预装保护柱在线的保护装置给色谱柱提供物理的保护49在线过滤器防止颗粒在色谱柱头累积优点：基本不影响柱效保护柱可避免化学污染。在线过滤器50色谱泵的保养流动相要过滤常用缓冲液时，停泵前要用水冲洗，并用水冲洗柱塞杆清洗孔拧紧排液阀时，不要太用力，以不渗液为准更换流动相时，要保证两种溶剂的互溶性如不互溶，要用一种中间溶剂过渡，要防止沉淀进液处的砂芯过滤头要经常清洗；避免泵内堵塞或有气泡；每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染；色谱泵的保养流动相要过滤51紫外灯的保养：在分析前、柱平衡得差不多时，打开检测器；在分析完成后，马上关闭检测器。紫外灯的保养：在分析前、柱平衡得差不多时，打开检测器；在分析52流动相方面

除去微粒纯度的要求超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低缓冲液的pH值，在填料的允许范围内缓冲液（盐）的浓度溶剂：色谱纯，并与填料相匹配溶剂中的杂质含量流动相对样品的溶解度有机溶剂或水的比例流动相方面

除去微粒53对流动相的要求:除色谱柱对流动相对的要求外，还有∶与检测器匹配脱气避免卤素离子（不锈钢系统）溶剂的粘度细菌的生长流动相及样品的预处理

对流动相的要求:除色谱柱对流动相对的要求外，还有∶流动相及样54流动相的脱气流动相脱气的目的使色谱泵的输液准确输液均匀准确，并且脉动减小保留时间及色谱峰面积的重现性提高提高检测的性能防止气泡引起的尖峰基线稳定，信噪比增加溶剂的紫外吸收本底降低保护色谱柱减少死体积防止填料的氧化流动相的脱气流动相脱气的目的55流动相脱气的方法加热简单，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流动相组成的变化抽真空同上，一般在溶剂抽滤的同时，也有脱气的效果超声波简单，但效果不理想。通惰性气体（一般用氦气）可保持连续脱气，多用于低压梯度脱气机可保持连续脱气，多用于低压梯度流动相脱气的方法加热56样品方面除去微粒及杂质了解样品在流动相中的溶解度如样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶解度，防止其在流动相中析出了解样品与色谱柱的基质/填料是否相互作用样品方面除去微粒及杂质57样品的预处理样品预处理的目的除去微粒减少干扰杂质浓缩微量的组份提高检测的灵敏度及选择性改善分离的效果有利于色谱柱及仪器的保护样品的预处理样品预处理的目的58样品的预处理重要性占样品分析时间的比例样品预处理所用时间远大于色谱分离的时间占分析的消耗总成本最大消耗大量的溶剂及其他化学品实验的重复性及准确性最差的环节影响实验结果好坏的最重要因素

是决定性的步骤样品的预处理重要性占样品分析时间的比例59样品预处理常用的方法高速离心过滤、超滤选择性沉淀衍生反应液-固萃取/液-液萃取Sep-Pak样品处理小柱其他样品预处理常用的方法高速离心60去除微粒过滤过滤膜/过滤装置有机(0.5m)/无机(0.45m)膜片可更换一次性使用的膜“Cartridge”使用方便简单，交叉污染小有更小内径，可用于微量样品的处理高速离心大于：10,000g去除微粒过滤61进样的注意事项手柄处于Load和Inject之间时，由于暂时堵住了流路，流路中压力骤增，再转到进样位，过高的压力在柱头上引起损坏，所以应尽快转动阀，不能停留在中途。在HPLC系统中使用的注射器针头有别于气相色谱，是平头注射器。一方面，针头外侧紧贴进样器密封管内侧，密封性能好，不漏液，不引入空气；另一方面，也防止了针头刺坏密封组件及定子。进样的注意事项手柄处于Load和Inject之间时，由于暂时62HPLC用水可以通过以下几个方面来得到：1专门的纯水机或超纯水机；2去离子水重蒸；3二次或三次重蒸水；4采用类似家用的纯水机；5市场上瓶装的纯净水或蒸馏水；6其它途径；HPLC用水可以通过以下几个方面来得到：1专门的纯水机或超63常用缓冲液及其pH值常用缓冲液及其pH值64洗针溶剂的注意事项洗针溶剂根据流动相的不同应有不同：洗针溶剂的注意事项洗针溶剂根据流动相的不同应有不同65液相色谱的分离机理及色谱柱液相色谱的分离机理及色谱柱66选HPLC参数时的基本考虑溶解度-选择流动相的条件分子量-在样品预处理或GPC分析时有用样品的基质-考虑如何前处理在基质中样品的含量检测特性-有否紫外吸收?荧光?找出样品中不同组份之间的差异摸索条件的重要线索选HPLC参数时的基本考虑溶解度-选择流动相的条件67极性问题极性问题68液相色谱的分离机理正相反相体积排除离子交换其他不同的分离模式是不同的机理液相色谱的分离机理正相69吸附色谱的分离机理随着样品在固定相上的吸附能力由大到小在色谱柱上的保留由长到短吸附色谱的分离机理随着样品在固定相上的吸附能力由大到小70吸附色谱概述分离基于样品的极性差异。洗脱次序∶一般为正相，即：极性低的先被洗脱常用的流动相∶非极性有机溶剂，如己烷乙酸等为添加剂常用固定相∶硅胶、氧化铝等。吸附色谱概述分离基于样品的极性差异。71分配色谱的分离机理分配色谱的分离机理72分配色谱概述反相色谱的主要类型，基于分子的极性分离洗脱次序：一般为反相，即极性高的先被洗脱常用的流动相：有机溶剂如甲醇、乙腈，水应用添加剂，成为离子对、离子抑制方法常用固定相：碳十八、碳八、胺基等基团反相色谱固定相多为键合相?分配色谱概述反相色谱的主要类型，基于分子的极性分离73键合相色谱柱以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺基等基团联在基质上，作为固定相。优点∶固定相稳定，不易流失应用广泛，可使用多种溶剂消除硅羟基的不良影响缺点∶pH值不能小于3同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同键合相色谱柱以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺74体积排除色谱的分离机理体积排除色谱的分离机理75凝胶色谱概述凝胶渗透（GPC）、凝胶过滤（GFC）分离基于分子在溶液中的体积大小洗脱次序：大分子先被洗脱流动相不参与分离，只起溶剂作用分离效率低色谱行为容易预测凝胶色谱概述凝胶渗透（GPC）、凝胶过滤（GFC）76GPC的校正分子量大于V0或小于Vt的分子不能分离GPC的校正分子量大于V0或小于Vt的分子不能分离77液相色谱柱及分离机理的关系从色谱方法上分正相/反相离子交换分子体积排除亲合从柱子类型上分分配/吸附离子交换凝胶亲合液相色谱柱及分离机理的关系从色谱方法上分从柱子类型上分78液相色谱的方法开发（二）梯度方法液相色谱的方法开发（二）梯度方法79梯度洗脱的特点优点单位时间的分离能力增加检测灵敏度提高缺点仪器设备要求高不适合某些检测方式柱需再生定量分析的重复性较低梯度洗脱的特点优点80如不用梯度：分离不理想如不用梯度：分离不理想81梯度条件的优化梯度条件的优化82检测器检测器83对检测器的要求高灵敏度可重现的设置合适的带宽快速或可变的时间常数宽的线性响应容易使用及保养自我诊断功能对检测器的要求高灵敏度84检测器的种类检测器的种类85衡量检测器的指标灵敏度∶S=△R/△Q△R是检测器响应值的增量△Q是样品量的增量噪音∶没有样品时检测器的最大输出信号漂移∶检测器在一段时间内响应值的变化线性动态范围∶最大线性相应与最小检出限之比最小检测限∶样品产生两或三倍于噪音信号时的浓度信噪比∶S/N注意∶最小检测限不是一个单纯的检测器指标。它实际上是评价整个色谱系统的指标，包括了色谱系统、分离机理、色谱柱在内的综合性指标，信噪比亦如此衡量检测器的指标灵敏度∶S=△R/△Q86紫外-可见光检测器基于样品池(S)中的样品对光产生吸收，有信号差如是可变波长检测器，还有分光系统(光珊)紫外-可见光检测器基于样品池(S)中的样品对光产生吸收，有信87Beer'sLaw-BEER定律光能量∶P0=透过溶剂的光能量P=透过样品的光能量光通量(透过率%)∶T=P/P0吸光度∶A=-log(T)=log(P0/P)吸光度=单位吸光度×流动池长度×溶液浓度即∶A=abcBeer'sLaw-BEER定律光能量∶88同紫外检测器灵敏度有关的因素信号强度(S)从BEER定律可看出样品的种类样品浓度及进样的体积检测池的长度所使用的波长，检测器的

时间常数噪音(N)流动相所使用的波长，灯的能量检测器的时间常数非检测器因素-电噪音，泵脉动等同紫外检测器灵敏度有关的因素信号强度(S)89紫外检测器的溶剂影响不同种类溶剂有其截止波长溶剂的质量好坏对其截止波长有影响为何溶剂质量不好?含紫外吸收的杂质溶解在其中的氧气缓冲液溶质的紫外吸收紫外检测器的溶剂影响不同种类溶剂有其截止波长90示差折光检测器DifferentialRefractiveIndexDetector示差折光检测器DifferentialRefractive91示差检测器的注意事项不能做梯度实验最大的池耐压是100psi流速范围是0.3-10ml/min.示差检测器的注意事项不能做梯度实验92液相色谱的定性及定量技术液相色谱的定性及定量技术93色谱峰定性鉴别每个色谱峰通过比较保留值(通常是保留时间)的方法，找到各色谱峰所对应的组份大多数情况下用比较保留时间来定性 即所谓：保留时间相同，可能是同样的组份保留时间不同，肯定不是同样的组份色谱峰定性鉴别每个色谱峰94用保留时间定性用“标样”的保留值定出被测组份的位置用保留时间定性用“标样”的保留值定出被测组份的位置95进一步的确认标准加入同时用其他方法其他色谱方法（改变机理，如：用不同的色谱柱）其他检测器PDA，光谱图比较、谱库检索MS，质谱图解析、谱库检索其他仪器方法进一步的确认标准加入96定量分析的具体内容确定样品的类型，主要成分/痕量成分使分析条件的分离度（R）大于：1.5色谱峰的定性，峰一致性测定检测限及定量限：确定灵敏度及线性范围用标样建立标准曲线检查方法的准确度及精确度用标样定期检查方法定量分析的具体内容确定样品的类型，主要成分/痕量成分97痕量分析如信/噪比不够，定量的精确度会受影响，因此要：分析前浓缩样品选择高灵敏度检测器用衍生法使色谱体系最优化使用短的微径柱（减少样品的稀释）使用高效色谱柱使k'值尽可能小增加进样体积和浓度使用低流速（N增加）采用梯度淋洗痕量分析如信/噪比不够，定量的精确度会受影响，因此要：98常用的定量方法峰面积百分比法由于检测技术的影响，在液相色谱中不常用外标法在液相色谱中用的最多内标法准确，但是麻烦在标准方法中用的最多常用的定量方法峰面积百分比法99外标法定量配制一系列已知浓度的标样外标法定量配制一系列已知浓度的标样100外标法定量（二）实际色谱图标准曲线外标法定量（二）实际色谱图标准曲线101外标法定量（三）计算公式特点无需各组份都被检出、洗脱需要标样标样及样品测定的条件要一致进样体积要准确外标法定量（三）计算公式102内标法定量（一）配制一系列浓度的标样，其中加有内标样内标法定量（一）配制一系列浓度的标样，其中加有内标样103内标法定量（二）实际色谱图标准曲线内标法定量（二）实际色谱图标准曲线104内标法定量（三）计算公式：特点：无需各组份都被检出、洗脱需要标样，需要内标样结果与进样体积无关内标法定量（三）计算公式：105内标法定量（四）对内标物的要求化学结构与待测组分相似(同系物、异构体)在样品中不存在不与样品中组份发生任何化学反应保留值与待测组分接近浓度（响应值）与待测组分相当其色谱峰与其他色谱峰分离好内标法定量（四）对内标物的要求106峰面积百分比法定量公式：特点：各组分要全部流出、全部被检测，并对检测器的响应值一样简单，液相色谱目前很难做到这点与进样量无关不需标样简单峰面积百分比法定量公式：107可接收的检测范围校正曲线只有在建立这条曲线的浓度范围内有效，高或低于这些点都可能引起计算错误可接收的检测范围校正曲线只有在建立这条曲线的浓度范围内有效，108定量校正曲线曲线A：因在零浓度时仍有色谱峰，

可能有杂质未分开曲线B：在此浓度内，检测器的响应

值是非线性的曲线C：可接受的理想状态，实际情

况应是∶其延长线到零点曲线D：表明有样品的损失，可能是色谱柱的非特征吸附，也可能是样品制备时的损失定量校正曲线曲线A：109高效液相色谱仪的使用、保养

及注意事项高效液相色谱仪的使用、保养

及注意事110色谱柱的使用及保养流动相的转换特别是GPC柱流速(压力)的变化幅度温度的变化幅度专用色谱柱∶样品及溶剂的要求色谱柱的使用及保养流动相的转换111色谱柱的清洗对所做的样品要有充分的了解用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗硅胶柱的一般方法先用甲醇洗去极性杂质用干燥的二氯甲烷、正庚烷100~200ml依次活化键合相柱(烷基)的一般方法20倍柱体积的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次冲洗色谱柱的清洗对所做的样品要有充分的了解112色谱柱的存放存放前的处理除去杂质、盐合适的存放溶剂避免色谱柱床的干枯避免机械震动防止细菌生长注意存放的温度色谱柱的存放存放前的处理113在线的保护装置给色谱柱提供物理的保护除去样品及流动相中的颗粒给色谱柱提供化学的保护防止分析柱被化学污染装置在线过滤器自装填料保护柱预装保护柱在线的保护装置给色谱柱提供物理的保护114在线过滤器防止颗粒在色谱柱头累积优点：基本不影响柱效保护柱可避免化学污染。在线过滤器115色谱泵的保养流动相要过滤常用缓冲液时，停泵前要用水冲洗，并用水冲洗柱塞杆清洗孔拧紧排液阀时，不要太用力，以不渗液为准更换流动相时，要保证两种溶剂的互溶性如不互溶，要用一种中间溶剂过渡，要防止沉淀进液处的砂芯过滤头要经常清洗；避免泵内堵塞或有气泡；每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染；色谱泵的保养流动相要过滤116紫外灯的保养：在分析前、柱平衡得差不多时，打开检测器；在分析完成后，马上关闭检测器。紫外灯的保养：在分析前、柱平衡得差不多时，打开检测器；在分析117流动相方面

除去微粒纯度的要求超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低缓冲液的pH值，在填料的允许范围内缓冲液（盐）的浓度溶剂：色谱纯，并与填料相匹配溶剂中的杂质含量流动相对样品的溶解度有机溶剂或水的比例流动相方面

除去微粒118对流动相的要求:除色谱柱对流动相对的要求外，还有∶与检测器匹配脱气避免卤素离子（不锈钢系统）溶剂的粘度细菌的生长流动相及样品的预处理

对流动相的要求:除色谱柱对流动相对的要求外，还有∶流动相及样119流动相的脱气流动相脱气的目的使色谱泵的输液准确输液均匀准确，并且脉动减小