紫外-可见分光光度法课件

紫外—可见分光光度法紫外—可见分光光度法1目录紫外可见光谱学原理和应用仪器样品处理及测定方法二极管分光光度计的特性目录紫外可见光谱学原理和应用21.基本原理电磁波谱：无线电波、红外线、宇宙射线、x射线、紫外线、可见光波长范围：200-800nm波长和频率：E=hνν=c/λλ越短，E越高短波长的紫外光能量高，这种成份导致了皮肤晒黑。1.基本原理电磁波谱：无线电波、红外线、宇宙射线、x射线、紫3紫外—可见光谱的来源：辐射作用于物质，发生反射、散射、吸收、荧光、磷光、光化学反应。通常测量紫外—可见光谱时我们希望只发生吸收。分子内电子跃迁导致谱带变宽，产生吸收光谱适用含量范围:10-5%～50%紫外—可见光谱的来源：适用含量范围:10-5%～50%42.定性分析：

鉴定谱图和结构同一性的认证

颜色

其他定性信息

蛋白质的熔点测定

酶活性

2.定性分析：鉴定谱图和结构53.定量分析：

朗伯—比尔定律：

A=εb

c(ε为摩尔吸光系数)多组分的分析

叠加性原理：一种混合物在任何波长下的吸光率等与混合物中各组分在该波长下的A之和。

浓溶液的不适用性

化学偏离与仪器偏离几乎所有金属元素的定量分析>0.01mol/L时,粒子相互影响电荷分别改变.ε也改变.浓电解质中有类似效应.化学:缔合,离解,溶剂化,PH变化等仪器:单色光不纯.

峰值处测量可改善3.定量分析：朗伯—比尔定律：几乎所有金属元素的定量分6该方法能分析复杂的混合物和图谱相似的简单混合物。用最小二乘法计算的偏差表明了标准光谱和样品光谱的拟合程度，同时也说明了分析结果的准确性。简单联立方程式最小二乘法偏最小二乘法（PLS）,关键组分的回归法（PCR）,多重最小二乘法（MLS）多组分分析方法该方法能分析复杂的混合物和图谱相似的简单混合物。简单联立方程74.间接测量：

化学衍生法分光广度滴定酶动力学分析4.间接测量：化学衍生法81.仪器设计分光光度计的组成产生一定光谱宽度的电磁辐射光源色散装置：从光源发射宽的电磁波中选择特定的波长样品区域检测器:测量辐射强度1.仪器设计分光光度计的组成9传统的分光光度计

适用于测量光谱中单点吸光度传统的分光光度计

适用于测量光谱中单点吸光度10二极管阵列分光光度计

比较：样品和色散元件的相对位置次序相反，称为反向光路

二极管阵列分光光度计

比较：样品和色散元件的相对位置次序相反11按构型分单光束设计：提供高的光通量，灵敏度高；但光源漂移产生较大误差双光束设计：矫正漂移。斩光器以一定速度旋转，使空白和样品的交替测量每秒进行数次。缺点，降低了光的能量和灵敏度分光束设计：分裂器将光分成两束，同时穿过参比和空白，到达两个分开但一样的检测器，可同时测定样品和空白

双波长设计：同时测定两个波长，如样品中两个同时发生的反应按构型分单光束设计：提供高的光通量，灵敏度高；但光源12紫外—可见分光光度法课件13紫外—可见分光光度法课件142.主要仪器参数（可能影响吸光度测量值准确度及精确度的一些仪器参数）光谱分辨率波长准确度及精确度线性动态范围漂移SBW/NBW≤0.12.主要仪器参数（可能影响吸光度测量值准确度及精确度的一些仪15影响测光准确度和精确度的因素：

杂散光和噪声

杂散光：检测到选定波长带宽以外的任何波长光。

T=(I+Is)/(I0+Is)噪声光子噪声：在测量低浓度低吸光率样品时，影响精确测量两束高强度的光之间的微小差别。电子噪声：是固有的，与测定的光强度无关。在高吸光度样品的信号很小时影响大

影响测光准确度和精确度的因素：

杂散光和噪声

杂散光：检测到16

液体样品固体样品弱吸收强吸收干扰光化学问题液体样品17动力学光谱法固相光谱法多元校正—多组分测定导数光谱法动力学光谱法导数光谱法18Beer定律：A=abc一阶导数：如果控制I0不变，则,而结论：A’信号也正比于c，在原拐点处灵敏度最大高阶导数光谱同样适用Beer定律：A=abc一阶导数：如果控制I0不变，则19导数光谱的特点：

随着导数阶数的增加，峰越来越尖锐，灵敏度提高信噪比随导数的阶数增加而降低原谱一阶导数二阶导数导数光谱的特点：随着导数阶数的增加，峰越来越尖锐，灵敏度20二极管阵列分光光度计的特点二极管阵列光谱学的优点二极管阵列光谱学的缺点快速采集，多波长同时测定，灵敏度高，有统计学意义，很高的稳定性和可靠性，敞开式的样品室分辨率较低，散射光严重，样品会分解二极管阵列分光光度计的特点二极管阵列光谱学的优点快速采21参考文献：

Tonyowen著,现代紫外—可见光谱学基础，1997，12-5965-5123E

张剑荣，戚苓,方惠群编，仪器分析试验，科学出版社，1999

曾永昌，向立人，周在德编，仪器分析，四川大学出版社，1992

G.W.尤因著，华东化工学院分析化学教研组译，化学分析的仪器方法，1986

罗国安，邱家学，王义明编，可见紫外定量分析及微机应用，上海科学技术文献出版社，1988参考文献：

Tonyowen著,现代紫外—可见光谱学基22谢谢大家谢谢大家23紫外—可见分光光度法紫外—可见分光光度法24目录紫外可见光谱学原理和应用仪器样品处理及测定方法二极管分光光度计的特性目录紫外可见光谱学原理和应用251.基本原理电磁波谱：无线电波、红外线、宇宙射线、x射线、紫外线、可见光波长范围：200-800nm波长和频率：E=hνν=c/λλ越短，E越高短波长的紫外光能量高，这种成份导致了皮肤晒黑。1.基本原理电磁波谱：无线电波、红外线、宇宙射线、x射线、紫26紫外—可见光谱的来源：辐射作用于物质，发生反射、散射、吸收、荧光、磷光、光化学反应。通常测量紫外—可见光谱时我们希望只发生吸收。分子内电子跃迁导致谱带变宽，产生吸收光谱适用含量范围:10-5%～50%紫外—可见光谱的来源：适用含量范围:10-5%～50%272.定性分析：

鉴定谱图和结构同一性的认证

颜色

其他定性信息

蛋白质的熔点测定

酶活性

2.定性分析：鉴定谱图和结构283.定量分析：

朗伯—比尔定律：

A=εb

c(ε为摩尔吸光系数)多组分的分析

叠加性原理：一种混合物在任何波长下的吸光率等与混合物中各组分在该波长下的A之和。

浓溶液的不适用性

化学偏离与仪器偏离几乎所有金属元素的定量分析>0.01mol/L时,粒子相互影响电荷分别改变.ε也改变.浓电解质中有类似效应.化学:缔合,离解,溶剂化,PH变化等仪器:单色光不纯.

峰值处测量可改善3.定量分析：朗伯—比尔定律：几乎所有金属元素的定量分29该方法能分析复杂的混合物和图谱相似的简单混合物。用最小二乘法计算的偏差表明了标准光谱和样品光谱的拟合程度，同时也说明了分析结果的准确性。简单联立方程式最小二乘法偏最小二乘法（PLS）,关键组分的回归法（PCR）,多重最小二乘法（MLS）多组分分析方法该方法能分析复杂的混合物和图谱相似的简单混合物。简单联立方程304.间接测量：

化学衍生法分光广度滴定酶动力学分析4.间接测量：化学衍生法311.仪器设计分光光度计的组成产生一定光谱宽度的电磁辐射光源色散装置：从光源发射宽的电磁波中选择特定的波长样品区域检测器:测量辐射强度1.仪器设计分光光度计的组成32传统的分光光度计

适用于测量光谱中单点吸光度传统的分光光度计

适用于测量光谱中单点吸光度33二极管阵列分光光度计

比较：样品和色散元件的相对位置次序相反，称为反向光路

二极管阵列分光光度计

比较：样品和色散元件的相对位置次序相反34按构型分单光束设计：提供高的光通量，灵敏度高；但光源漂移产生较大误差双光束设计：矫正漂移。斩光器以一定速度旋转，使空白和样品的交替测量每秒进行数次。缺点，降低了光的能量和灵敏度分光束设计：分裂器将光分成两束，同时穿过参比和空白，到达两个分开但一样的检测器，可同时测定样品和空白

双波长设计：同时测定两个波长，如样品中两个同时发生的反应按构型分单光束设计：提供高的光通量，灵敏度高；但光源35紫外—可见分光光度法课件36紫外—可见分光光度法课件372.主要仪器参数（可能影响吸光度测量值准确度及精确度的一些仪器参数）光谱分辨率波长准确度及精确度线性动态范围漂移SBW/NBW≤0.12.主要仪器参数（可能影响吸光度测量值准确度及精确度的一些仪38影响测光准确度和精确度的因素：

杂散光和噪声

杂散光：检测到选定波长带宽以外的任何波长光。

T=(I+Is)/(I0+Is)噪声光子噪声：在测量低浓度低吸光率样品时，影响精确测量两束高强度的光之间的微小差别。电子噪声：是固有的，与测定的光强度无关。在高吸光度样品的信号很小时影响大

影响测光准确度和精确度的因素：

杂散光和噪声

杂散光：检测到39

液体样品固体样品弱吸收强吸收干扰光化学问题液体样品40动力学光谱法固相光谱法多元校正—多组分测定导数光谱法动力学光谱法导数光谱法41Beer定律：A=abc一阶导数：如果控制I0不变，则,而结论：A’信号也正比于c，在原拐点处灵敏度最大高阶导数光谱同样适用Beer定律：A=abc一阶导数：如果控制I0不变，则42导数光谱的特点：

随着导数阶数的增加，峰越来越尖锐，灵敏度提高信噪比随导数的阶数增加而降低原谱一阶导数二阶导数导数光谱的特点：随着导数阶数的增加，峰越来越尖锐，灵敏度43二极管阵列分光光度计的特点二极管阵列光谱学的优点二极管阵列光谱学的缺点快速采集，多波长同时测定，灵敏度高，有统计学意义，很高的稳定性和可靠性，敞开式的样品室分辨率较低，散射光严重，样品会分解二极管阵列分光光度计的特点二