生物化学重组DNA技术课件

重组DNA技术

RecombinantDNAtechnology邓益斌重组DNA技术

RecombinantDNAtechno1

主要内容掌握重组DNA技术的定义掌握限制性核酸内切酶的概念熟悉常用工具酶的种类及用途熟悉重组DNA技术的基本步骤主要内容掌握重组DNA技术的定义2第一节重组DNA技术

的定义及步骤

基因重组技术:在体外对不同来源的DNA分子进行共价连接形成重组DNA，再将重组子导入受体细胞，扩增、繁殖和表达。第一节重组DNA技术

的定义及步骤3

基本步骤2.将目的基因与运载体DNA在体外进行重组目的基因运载体DNA限制性核酸内切酶DNA重组体引入宿主细胞筛选出含有重组体的细胞无性繁殖扩增、表达基因产物3.转化或转染4.筛选5.克隆（cloning）基因的表达、检测、分离1.目的基因获得基本步骤2.将目的基因与运载体DNA在体外进行重组目的4一、限制性核酸内切酶选用II型限制酶，能专一识别和切割双链DNA限制酶的命名HaemophilusinfluenzaeRd嗜血杆菌属流感杆菌（种名）株名取H取indHindI第二节重要的工具酶若该微生物有不同的变种和品系，再加上该变种和品系的第一个字母，需大写；从同一种微生物中发现多种限制酶，依据发现的前后顺序用罗马数字表示：例如从淀粉液化芽孢杆菌（Bacillsamyloliquefaciens)H株分离的第一种限制型内切酶，命名为BamHI一、限制性核酸内切酶选用II型限制酶，能专一识别和切割双链5生物化学重组DNA技术［课件］6生物化学重组DNA技术［课件］7三、DNA连接酶：

1.T4噬菌体DNA连接酶：两个不同片段双链DNA存在互补粘性末端（Km=0.6µmol/L)或平末端(Km=50µmol/L)。2.大肠杆菌DNA连接酶四、T4多核苷酸激酶:催化将ATP的γ-磷酸转移到DNA链5’末端五、碱性磷酸酶：催化切除DNA、RNA、dNTP上5’磷酸基团三、DNA连接酶：8重组5’—A3’—TTCGA—AGCTT—3’A—5’目的基因粘性末端运载体DNA粘性末端5’—AAGCTT—3’—TTCGAA—DNA连接酶退火末端转移酶粘端连接平端连接dTTP末端转移酶dATP退火DNA连接酶重组5’—AAGCTT—3’A—5’目的基因粘性末端运9第一部分

获得目的基因

第一部分

获得目的基因

10第一节目的基因的获得原核生物基因组较小,目的基因定位较容易，一般可直接分离获得。即用限制性核酸内切酶将基因组切成若干片段后，用带标记的核酸探针从中筛选、确定、提纯、扩增。真核生物基因组庞大，一个单拷贝仅占整个基因组的10-7~10-5，从中获取某一基因常采用以下几种方法：第一节目的基因的获得原核生物基因组较小,目的基因定位较111.PCR获取目的基因

2.用DNA合成仪人工合成目的基因3.从DNA文库（genelibrary）中筛选出目的基因DNA文库

各种重组DNA分子的集合体，叫DNA文库

cDNA文库

基因组文库

1.PCR获取目的基因2.用DNA合成仪人工合成目的基12将DNA用酶法裂解（鸟枪法）裂解为相当于基因长度的片段分别与质粒重组并引入大肠杆菌即为基因组文库（G-文库）基因组文库：分离纯化基因组DNA筛选目的基因将DNA用酶法裂解（鸟枪法）裂解为相当于基因长度的片段分别与13分离纯化mRNA用oligo-dT亲和层析法提取细胞内总RNA反转录合成cDNA并复制成双链的DNA与质粒重组并引入大肠杆菌即为cDNA文库筛选目的基因核酸杂交法和免疫结合法cDNA文库：分离纯化mRNA反转录合成cDNA并复制成双链的DNA与质粒14一、构建cDNA文库筛选目的基因

1.真核细胞mRNA的分离纯化◆提取细胞内总RNA：裂解、离心去核、抽提RNA◆分离纯化mRNA：oligo-dT纤维亲和层析柱一、构建cDNA文库筛选目的基因1.真核细胞mR15模板：mRNA引物：oligo-dT逆转录酶：依赖RNA的DNA聚合酶底物：dNTP合成方向：5’→3’2.反转录合成cDNA模板：mRNA2.反转录合成cDNA16逆转录酶RNaseHDNA聚合酶mRNA模板杂化双链单链DNAcDNA与载体连接、导入宿主细胞AAA3’AAA3’TTT5’TTT5’3’GGG3’GGG5‘CCCTTT5’AAA3’逆转录酶RNaseHDNA聚合酶mRNA模板杂化双链单链173.构建cDNA文库cDNA两端加接头或衔接头cDNA与载体相连导入宿主细胞进行克隆（来自一个细胞的克隆体）3.构建cDNA文库cDNA两端加接头或衔接头184.筛选目的基因核酸杂交法：用与目的基因互补、带放射性标记的寡核苷酸链为“探针”，与目的基因特异结合并示踪免疫结合法：应用特异性抗体—免疫学探针进行筛选(表达性载体）4.筛选目的基因核酸杂交法：用与目的基因互补、带放射性标19第二节获得目的基因方法的选择原则一、根据获得目的基因的目的二、根据目的基因本身特点三、根据实验室设备条件第二节获得目的基因方法的选择原则一、根据获得目的基因的目20第二部分

重组体的构成、导入和筛选

第二部分

重组体的构成、导入和筛选

21第一节基因克隆的载体载体分为克隆载体（cloningvector）和表达载体（expressionvector），是携带目的基因进入宿主细胞扩增和表达的工具。常用质粒DNA、噬菌体DNA或病毒进行适当改建而成。基因载体的功能：1.是运载体，携带目的基因进入受体细胞;2.能自主复制，进入细胞后可以进行复制或表达基因产物;3.具备筛选标志;4.适当限制酶切位点;5.在细胞中拷贝数高。第一节基因克隆的载体载体分为克隆载体（cloning22质粒（plasmid）是细菌内携带的染色体外的小型双链环状DNA，能独立进行复制。具备下列特点：1.分子量相对较小能在细菌内稳定存在，有较高的拷贝数。2.具有一个以上的遗传标志，便于在宿主细胞进行选择。3.具有多个限制性酶的单一切口，称为多克隆位点。便于外源基因的插入。质粒（plasmid）是细菌内携带的染色体外的小型双链环状D23常用质粒载体pBR322质粒：由一系列大肠杆菌质粒DNA通过重组技术构建成，长度为4.36kb，特点：（1）含有复制起始点和复制调节信号；（2）有单个EcoRI酶切位点，可切开插入目的基因；（3）有抗四环素基因Ter+和抗氨苄青霉素基因Amp+，便于重组体细胞的筛选。常用质粒载体pBR322质粒：由一系列大肠杆菌质粒DNA通过24pUC系列载体:由pBR质粒与M13噬菌体构建而成，长度为2.674kb，特点：（1）含有抗氨苄青霉素基因Amp+和复制起始点。（2）含有大肠杆菌lacZ操纵子的DNA片段（lacZ’基因），与宿主细胞实现基因内互补，形成完整的β-半乳糖苷酶基因，能分解生色底物5-溴-4-氢-3-吲哚-β-D半乳糖苷,形成蓝色菌落——蓝白斑筛选。pUC系列载体:由pBR质粒与M13噬菌体构建而成，长度为225生物化学重组DNA技术［课件］26（一）粘性末端连接1.全同源粘性末端

同一单酶切；方便，但高背景（空白载体）和双向插入载体：5’---GAATTC---3’3’---CTTAAG---5’目的DNA：5’GAATTC----GAATTC3’3’CTTAAG----CTTAAG5’第二节目的基因与载体的连接（一）粘性末端连接第二节目的基因与载体的连接27定向克隆：使外源DNA片段定向插入到载体分子。

双酶切，(1)载体不能自连(2)目的DNA定向插入

粘-粘，粘-平

粘-粘连接效率很高DNA连接反应都是由T4DNA连接酶介导定向克隆：使外源DNA片段定向插入到载体分子。28（二）人工接头连接1.连接子：人工方法合成含有限制酶切位点的寡聚核苷酸片段，与目的基因连接，再用相应酶切，目的基因可带有粘性末端。2.普适子：人工方法直接合成粘性末端，不经酶切即可与载体连接。3.T-A克隆：直接对PCR产物克隆的技术，不依赖模板在扩增产物两端加“A”，在载体切口处加“T”即可连接。（二）人工接头连接1.连接子：人工方法合成含有限制酶切位点的29二、连接反应的建立温度：粘性末端的连接一般在12~15℃，平末端的连接可在室温，但温度高于30℃会导致T4DNA连接酶不稳定。DNA量：载体与目的基因的分子数之比约1：3酶量：按其定义二、连接反应的建立温度：粘性末端的连接一般在12~15℃，平30第三节重组体导入受体细胞转化：质粒及其重组子导入受体细胞转染：病毒及其重组子导入受体细胞转导：噬菌体及其重组子导入受体细胞受体细胞多为大肠杆菌K-12经改造成为安全的宿主菌，限制酶和重组酶缺陷型，经特殊处理成为感受态菌（细菌处于容易吸收外源DNA的状态）第三节重组体导入受体细胞转化：质粒及其重组子导入31感受态菌的制备：1.氯化钙法：细菌处于低温、低渗CaCl2溶液中，菌细胞壁通透性增加，菌体膨胀成球形，经短暂热休克后重组DNA易进入2.电穿孔法：除特殊仪器外比氯化钙法更简单，使用时注意电场强度、电脉冲长度、DNA浓度等参数。感受态菌的制备：32第四节重组体的筛选与鉴定利用抗药基因（或失活）、蓝白斑进行初筛提取重组体DNA限制内酶切，琼脂糖凝胶电泳电泳区带比较（指纹图谱）插入片段长度鉴定:酶切鉴定;PCR鉴定插入片段方向鉴定：正向或反向，使用联合酶切DNA序列测定第四节重组体的筛选与鉴定利用抗药基因（或失活）、蓝白斑33生物化学重组DNA技术［课件］34第五节克隆基因的扩增和表达大肠杆菌培养繁殖使克隆基因扩增原核生物只有一种RNA聚合酶，识别原核细胞的启动子，催化所有RNA的合成真核基因在原核细胞中表达，将外源基因克隆在原核表达载体启动子下游载体分为（1）克隆载体—外源基因在受体细胞中复制扩增。（2）表达载体—外源基因在受体细胞中表达（转录和翻译）第五节克隆基因的扩增和表达大肠杆菌培养繁殖使克隆基因扩35表达载体：◆克隆载体上加合适的转录和翻译调控序列及强启动子◆正确的阅读框架◆选择合适的宿主细胞表达载体：36基因表达产物的检测—Western印迹法1.蛋白质样品的制备：2.电泳:3.转移:4.鉴定：基因表达产物的检测—Western印迹法37基因表达产物（蛋白质或肽）的分离纯化技术包涵体中重组蛋白质的分离与纯化

包涵体是外源基因在原核细胞中高效表达，形成由膜包裹的高密度、不溶性蛋白颗粒。包涵体内的蛋白质是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性。包涵体内的蛋白质可免受蛋白酶的降解作用包涵体大小、密度较细胞中其他成分大，低速离心的方法易于分离。基因表达产物（蛋白质或肽）的分离纯化技术包涵体中重组蛋白质的38谢谢！谢谢！39重组DNA技术

RecombinantDNAtechnology邓益斌重组DNA技术

RecombinantDNAtechno40

主要内容掌握重组DNA技术的定义掌握限制性核酸内切酶的概念熟悉常用工具酶的种类及用途熟悉重组DNA技术的基本步骤主要内容掌握重组DNA技术的定义41第一节重组DNA技术

的定义及步骤

基因重组技术:在体外对不同来源的DNA分子进行共价连接形成重组DNA，再将重组子导入受体细胞，扩增、繁殖和表达。第一节重组DNA技术

的定义及步骤42

基本步骤2.将目的基因与运载体DNA在体外进行重组目的基因运载体DNA限制性核酸内切酶DNA重组体引入宿主细胞筛选出含有重组体的细胞无性繁殖扩增、表达基因产物3.转化或转染4.筛选5.克隆（cloning）基因的表达、检测、分离1.目的基因获得基本步骤2.将目的基因与运载体DNA在体外进行重组目的43一、限制性核酸内切酶选用II型限制酶，能专一识别和切割双链DNA限制酶的命名HaemophilusinfluenzaeRd嗜血杆菌属流感杆菌（种名）株名取H取indHindI第二节重要的工具酶若该微生物有不同的变种和品系，再加上该变种和品系的第一个字母，需大写；从同一种微生物中发现多种限制酶，依据发现的前后顺序用罗马数字表示：例如从淀粉液化芽孢杆菌（Bacillsamyloliquefaciens)H株分离的第一种限制型内切酶，命名为BamHI一、限制性核酸内切酶选用II型限制酶，能专一识别和切割双链44生物化学重组DNA技术［课件］45生物化学重组DNA技术［课件］46三、DNA连接酶：

1.T4噬菌体DNA连接酶：两个不同片段双链DNA存在互补粘性末端（Km=0.6µmol/L)或平末端(Km=50µmol/L)。2.大肠杆菌DNA连接酶四、T4多核苷酸激酶:催化将ATP的γ-磷酸转移到DNA链5’末端五、碱性磷酸酶：催化切除DNA、RNA、dNTP上5’磷酸基团三、DNA连接酶：47重组5’—A3’—TTCGA—AGCTT—3’A—5’目的基因粘性末端运载体DNA粘性末端5’—AAGCTT—3’—TTCGAA—DNA连接酶退火末端转移酶粘端连接平端连接dTTP末端转移酶dATP退火DNA连接酶重组5’—AAGCTT—3’A—5’目的基因粘性末端运48第一部分

获得目的基因

第一部分

获得目的基因

49第一节目的基因的获得原核生物基因组较小,目的基因定位较容易，一般可直接分离获得。即用限制性核酸内切酶将基因组切成若干片段后，用带标记的核酸探针从中筛选、确定、提纯、扩增。真核生物基因组庞大，一个单拷贝仅占整个基因组的10-7~10-5，从中获取某一基因常采用以下几种方法：第一节目的基因的获得原核生物基因组较小,目的基因定位较501.PCR获取目的基因

2.用DNA合成仪人工合成目的基因3.从DNA文库（genelibrary）中筛选出目的基因DNA文库

各种重组DNA分子的集合体，叫DNA文库

cDNA文库

基因组文库

1.PCR获取目的基因2.用DNA合成仪人工合成目的基51将DNA用酶法裂解（鸟枪法）裂解为相当于基因长度的片段分别与质粒重组并引入大肠杆菌即为基因组文库（G-文库）基因组文库：分离纯化基因组DNA筛选目的基因将DNA用酶法裂解（鸟枪法）裂解为相当于基因长度的片段分别与52分离纯化mRNA用oligo-dT亲和层析法提取细胞内总RNA反转录合成cDNA并复制成双链的DNA与质粒重组并引入大肠杆菌即为cDNA文库筛选目的基因核酸杂交法和免疫结合法cDNA文库：分离纯化mRNA反转录合成cDNA并复制成双链的DNA与质粒53一、构建cDNA文库筛选目的基因

1.真核细胞mRNA的分离纯化◆提取细胞内总RNA：裂解、离心去核、抽提RNA◆分离纯化mRNA：oligo-dT纤维亲和层析柱一、构建cDNA文库筛选目的基因1.真核细胞mR54模板：mRNA引物：oligo-dT逆转录酶：依赖RNA的DNA聚合酶底物：dNTP合成方向：5’→3’2.反转录合成cDNA模板：mRNA2.反转录合成cDNA55逆转录酶RNaseHDNA聚合酶mRNA模板杂化双链单链DNAcDNA与载体连接、导入宿主细胞AAA3’AAA3’TTT5’TTT5’3’GGG3’GGG5‘CCCTTT5’AAA3’逆转录酶RNaseHDNA聚合酶mRNA模板杂化双链单链563.构建cDNA文库cDNA两端加接头或衔接头cDNA与载体相连导入宿主细胞进行克隆（来自一个细胞的克隆体）3.构建cDNA文库cDNA两端加接头或衔接头574.筛选目的基因核酸杂交法：用与目的基因互补、带放射性标记的寡核苷酸链为“探针”，与目的基因特异结合并示踪免疫结合法：应用特异性抗体—免疫学探针进行筛选(表达性载体）4.筛选目的基因核酸杂交法：用与目的基因互补、带放射性标58第二节获得目的基因方法的选择原则一、根据获得目的基因的目的二、根据目的基因本身特点三、根据实验室设备条件第二节获得目的基因方法的选择原则一、根据获得目的基因的目59第二部分

重组体的构成、导入和筛选

第二部分

重组体的构成、导入和筛选

60第一节基因克隆的载体载体分为克隆载体（cloningvector）和表达载体（expressionvector），是携带目的基因进入宿主细胞扩增和表达的工具。常用质粒DNA、噬菌体DNA或病毒进行适当改建而成。基因载体的功能：1.是运载体，携带目的基因进入受体细胞;2.能自主复制，进入细胞后可以进行复制或表达基因产物;3.具备筛选标志;4.适当限制酶切位点;5.在细胞中拷贝数高。第一节基因克隆的载体载体分为克隆载体（cloning61质粒（plasmid）是细菌内携带的染色体外的小型双链环状DNA，能独立进行复制。具备下列特点：1.分子量相对较小能在细菌内稳定存在，有较高的拷贝数。2.具有一个以上的遗传标志，便于在宿主细胞进行选择。3.具有多个限制性酶的单一切口，称为多克隆位点。便于外源基因的插入。质粒（plasmid）是细菌内携带的染色体外的小型双链环状D62常用质粒载体pBR322质粒：由一系列大肠杆菌质粒DNA通过重组技术构建成，长度为4.36kb，特点：（1）含有复制起始点和复制调节信号；（2）有单个EcoRI酶切位点，可切开插入目的基因；（3）有抗四环素基因Ter+和抗氨苄青霉素基因Amp+，便于重组体细胞的筛选。常用质粒载体pBR322质粒：由一系列大肠杆菌质粒DNA通过63pUC系列载体:由pBR质粒与M13噬菌体构建而成，长度为2.674kb，特点：（1）含有抗氨苄青霉素基因Amp+和复制起始点。（2）含有大肠杆菌lacZ操纵子的DNA片段（lacZ’基因），与宿主细胞实现基因内互补，形成完整的β-半乳糖苷酶基因，能分解生色底物5-溴-4-氢-3-吲哚-β-D半乳糖苷,形成蓝色菌落——蓝白斑筛选。pUC系列载体:由pBR质粒与M13噬菌体构建而成，长度为264生物化学重组DNA技术［课件］65（一）粘性末端连接1.全同源粘性末端

同一单酶切；方便，但高背景（空白载体）和双向插入载体：5’---GAATTC---3’3’---CTTAAG---5’目的DNA：5’GAATTC----GAATTC3’3’CTTAAG----CTTAAG5’第二节目的基因与载体的连接（一）粘性末端连接第二节目的基因与载体的连接66定向克隆：使外源DNA片段定向插入到载体分子。

双酶切，(1)载体不能自连(2)目的DNA定向插入

粘-粘，粘-平

粘-粘连接效率很高DNA连接反应都是由T4DNA连接酶介导定向克隆：使外源DNA片段定向插入到载体分子。67（二）人工接头连接1.连接子：人工方法合成含有限制酶切位点的寡聚核苷酸片段，与目的基因连接，再用相应酶切，目的基因可带有粘性末端。2.普适子：人工方法直接合成粘性末端，不经酶切即可与载体连接。3.T-A克隆：直接对PCR产物克隆的技术，不依赖模板在扩增产物两端加“A”，在载体切口处加“T”即可连接。（二）人工接头连接1.连接子：人工方法合成含有限制酶切位点的68二、连接反应的建立温度：粘性末端的连接一般在12~15℃，平末端的连接可在室温，但温度高于30℃会导致T4DNA连接酶不稳定。DNA量：载体与目的基因的分子数之比约1：3酶量：按其定义二、连接反