基因工程与基因重组课件

基因重组与基因工程基因重组与基因工程1生物工程定义生物工程是生物技术的总称，是对生命有机体在分子水平、细胞水平、组织水平、个体水平进行不同层次的创造性设计和改造，使之能定向组建具有特定性状的新物种或新品系，从而造福人类的现代应用技术学科。生物工程定义生物工程是生物技术的总称2生物技术的四大体系基因工程细胞工程酶工程发酵工程生物技术的四大体系基因工程3

重组DNA技术（recombinantDNAtechnique），又叫DNA克隆（DNAcloning）。在体外将各种来源的遗传物质——同源的或异源的、真核的或原核的、天然的或人工合成的DNA与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子（复制子），继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增，以获得该DNA分子的大量拷贝。这类克隆是在分子水平上操作，故又称分子克隆（molecularcloning）。一、重组DNA技术相关概念（一）DNA克隆重组DNA技术（recombina4

由于DNA克隆研究对象常常是特异的基因片段，所以又称作基因克隆（genecloning）。实现基因克隆所采用的方法及相关工作统称为基因工程（geneticengineering）。由于DNA克隆研究对象常常是特异的基因片段51997年2月23日英国Wilmut1997年2月23日6

从复杂的生物有机体基因组中，分离出目的基因片段。用合适的酶切割目的基因和载体，产生匹配的末端在体外，将目的基因片段连接到能自我复制的并且具有选择标记的载体分子上，形成重组DNA分子。将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称宿主细胞），并与之一起增殖。

筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆。从筛选出的阳性克隆中提取出扩增的目的基因片段，供进一步研究使用。基因克隆的基本步骤从复杂的生物有机体基因组中，分离出目的基因片段。基因克隆的7基因克隆的基本步骤基因克隆的基本步骤8粘性末端质粒目的基因粘性末端匹配的粘性末端粘性末端质粒目的基因粘性末端匹配的粘性末端9酶切后的目的基因片段接(连接)连接后的重组质粒DNA分子酶切后的目的基因片段接(连接)连接后的重组质粒DNA分子10重组质粒目的基因大肠杆菌转(转化)染色体真好玩!重组质粒目的基因大肠杆菌转(转化)染色体真好玩!11筛(筛选)分解抗生素的酶含抗生素的培养基还活着!玩完啦!大肠杆菌大肠杆菌筛(筛选)分解抗生素的酶含抗生素的培养基还活着!玩完啦!大肠12大量生长提取大量质粒酶切鉴定大量生长提取大量质粒酶切鉴定13您已经掌握基因克隆的主要步骤！分离目的基因和载体DNA。用合适的酶切割上述两者，产生匹配的末端。连接酶将目的基因装入载体。转入细菌。筛选具有抗药性克隆。您已经掌握基因克隆的主要步骤！分离目的基因和载体DNA。14（二）重组DNA中的工具酶限制性核酸内切酶连接酶聚合酶多聚核苷酸激酶碱性磷酸酶（二）重组DNA中的工具酶限制性核酸内切酶151.限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）定义：能识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。主要来源于原核生物，可将侵入宿主细胞的外源性DNA迅速降解，而对细菌自身的DNA，则通过甲基化酶在该限制酶切位点甲基化修饰而保护自身的DNA不被降解。限制性内切酶和甲基化酶共同构成细菌的限制和修饰系统。限制性内切酶由于能限制外源DNA的“入侵”而得名。1.限制性核酸内切酶（restrictionendonu16限制酶的命名

限制酶的命名是根据含有该酶的微生物种属而定。通常有三个斜体字母的缩写表示。第一个大写字母取自细菌属名的第一个字母；第二、三个小写字母取自微生物种名的头两个字母；第四个字母代表该微生物同种内不同的株系；如果同一株名发现几种限制酶，则根据其被发现和分离的先后顺序，用罗马数字表示。例如，从大肠杆菌（EscherichiaColi）RY13株中发现分离的第一种限制酶，称为EcoRI。限制酶的命名17限制性内切酶的分类和特点

根据限制酶的组成、辅因子及切割DNA方式不同，可分为I、II、III型。重组DNA技术中常用的是II型限制性内切酶。II型酶作用特点是有严格的识别、切割顺序，以内切方式水解双链DNA中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5'端为磷酸基，3'端为羟基。识别顺序一般为4~6个碱基，通常是回文结构（palindrome）。限制性内切酶的分类和特点根据限制酶的组成、辅18回文结构

II类限制性核酸内切酶识别DNA位点的核苷酸序列呈二元旋转对称，通常称这种特殊的结构顺序为回文结构。

EcoRI5'…GAATTC…3'3'…CTTAAG…5'回文结构19II型酶切割双链DNA产生3种不同的切口：在对称轴中心同时切割双链，产生平末端或称钝性末端（bluntend），如HpaI：5'…GTT▼AAC…3'HpaI5'…GTTAAC…3'3'…CAA▲TTG…5'3'…CAATTG…5'II型酶切割双链DNA产生3种不同的切口：5'…GTT▼A20在对称轴两侧相对位点分别切割一条链。从5’端切割产生

5'端突出的粘性末端，如EcoRI：5'…G▼AATTC…3'EcoRI5'…GAATTC…3'3'…CTTAA▲G…5'3'…CTTAAG…5'从3'端切割产生3'端突出的粘性末端。如PstI：5'…CTGCA▼G…3'PstI5'…CTGCAG…3'3'…G▲ACGTC…5'3'…GACGTC…5'在对称轴两侧相对位点分别切割一条链。从5’端切割产生21表15-2一些常用的限制性内切酶位点表15-2一些常用的限制性内切酶位点22一些限制酶虽然识别序列不完全相同，但能产生相同类型的粘性末端，称为同尾酶，所产生的末端称配伍末端（compatibleend），可进行相互连接。产生平末端的酶切割DNA后，也可彼此连接。一些限制酶虽然识别序列不完全相同，但能产生23连接酶可催化DNA分子中相邻5'磷酸和3'羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接。常用的有T4（噬菌体）DNA连接酶和E.ColiDNA连接酶。2.DNA连接酶3.聚合酶重组DNA技术中，聚合酶（polymerase）的最重要作用是以DNA或RNA为模板在体外合成DNA或RNA。可分为DNA聚合酶和RNA聚合酶两大类。连接酶可催化DNA分子中相邻5'磷酸和3'24

名称 功能及应用 大肠杆菌DNA聚合酶I以DNA为模板，催化5’→3’核酸链的延长，另有3’→5’的外切酶

大片段（klenow）活性。常用于DNA3’末端的标记和填充、cDNA第二链的合成、DNA测序。TaqDNA聚合酶以DNA为模板，催化5’→3’核酸链的延长，另有弱的5’→3’的外切酶活性，耐高温。常用于PCR及DNA测序。末端转移酶催化NTP中的NMP通过其磷酸基与DNA3’-OH连接而使DNA链延长，无需模板。常用于3'端标记或形成DNA共聚尾巴。逆转录酶以RNA为模板，合成cDNA链（5’→3’），另有RNA酶H活性。常用于cDNA第一、二链的合成及反转录PCR（RT-PCR）。RNA聚合酶以DNA为模板合成RNA。常用于离体条件下，合成单链RNA作为杂交探针。名称 25T4多核苷酸激酶（polynucleotidekinase）催化ATP的γ-磷酸基转移至DNA或RNA的5'末端羟基上。常用于单链或双链DNA和RNA探针的5'端标记。4.多聚核苷酸激酶5.碱性磷酸酶牛小肠碱性磷酸酶（calfintestinalalkalinephosphatase,CIP），催化DNA或RNA的5'磷酸基水解。常用于去除线状载体DNA两端的5'磷酸基团，防止载体自身连接环化；也用于用32P标记DNA的5'末端之前除去原来的5'磷酸基。T4多核苷酸激酶（polynucleoti26

应用重组DNA技术有时是为分离、获得某一感兴趣的基因或DNA片段，或是获得感兴趣的表达产物——蛋白质。这些感兴趣的基因或DNA序列就是目的基因。目的基因有两种类型，即cDNA和基因组DNA。（三）目的基因（targetgene）应用重组DNA技术有时是为分离、获得某一感27（四）基因工程载体基因载体：或称克隆载体（cloningvector）,是在基因工程中为“携带”感兴趣的外源DNA（目的基因、外源基因）、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子，具有自我复制和表达功能。其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而特异设计的克隆载体又称表达载体。（四）基因工程载体基因载体：或称克隆载体（cloning28

能自主复制并能带动插入的目的基因一起复制。具有一个以上的单一限制性酶切位点（多克隆位点，multiplecloningsites），以便目的基因的插入。具有合适的筛选标记（如抗药性基因，酶基因等），以便筛选阳性克隆。载体分子量小，以便容纳较大目的基因，拷贝数高。在细胞内稳定性高，以便确保重组体稳定传代而不易丢失。理想载体应具备的基本条件能自主复制并能带动插入的目的基因一起复制。理想载体应具备的29载体的分类

质粒（plasmid）

噬菌体（phage）

病毒（virus）

克隆载体（cloningvector）

表达载体（expressionvector）常用的载体按来源分为载体按得到的产物分类可分为载体的分类30质粒（plasmid）质粒是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子，能在宿主细胞独立自主地进行复制，并在细胞分裂时保持恒定地传给子代细胞。质粒带有某些遗传信息，会赋予宿主细胞新的遗传性状。因为质粒DNA有自我复制功能及携带遗传信息等特性，可作为重组DNA操作的载体。染色体质粒质粒（plasmid）质粒是存在于细菌染色体31

pBR322质粒图谱氨苄青霉素抗性基因四环素抗性基因多克隆位点pBR322质粒图谱氨苄青霉素抗性基因四环素抗性基因多克32噬菌体载体噬菌体是一种细菌病毒，可作为克隆载体。目前使用的噬菌体载体主要有λ噬菌体衍生物载体、M13噬菌体载体等。除M13噬菌体载体外，这类载体的特点是其容量比质粒载体大，即可插入较大的外源DNA片段（如20kb以上）。可以在体外包装产生感染性很高的噬菌体颗粒。噬菌体载体噬菌体是一种细菌病毒，可作为克隆载33噬菌体头部尾部尾丝噬菌体头部尾部尾丝34

λ噬菌体

λ噬菌体（lambdlabacteriophage）是一种大肠杆菌病毒，为线性双链DNA，它的两端各有12个碱基的互补粘性末端，称COS位点。当噬菌体侵入宿主细胞，两个粘性末端互补结合，形成环状分子。λDNA在体外可包装成病毒颗粒，并高效感染大肠杆菌。λ噬菌体35λ噬菌体侵入细菌后，即可裂解生长（环状DNA在细菌中多次复制，合成大量噬菌体基因产物，装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌），又可以溶源生长（λ噬菌体DNA整合到细胞染色体基因组DNA中，与染色体DNA一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解）。λ噬菌体侵入细菌后，即可裂解生长（环状DNA在细菌中多次复36噬菌体感染细菌示意图裂解生长噬菌体感染细菌示意图裂解生长37λ噬菌体基因组中有较大区域仅与溶源生长有关，而对裂解生长并非绝对需要，因此可以缺失或被外源DNA取代。经改造的λ噬菌体衍生载体可分两类:一类是插入型载体，即外源基因插入到载体上单一的限制酶位点，如λgt系列等。另一类是置换型，即两个限制酶位点之间的DNA片段可被外源DNA取代，如Charon，EMBL系列等。λ噬菌体基因组中有较大区域仅与溶源生长有关，38基因工程与基因重组课件39M13噬菌体载体

M13噬菌体基因组是单链环状DNA，当它侵犯宿主菌后，在细菌胞内酶的作用下，单链DNA转变成复制型双链DNA，可提取出来做基因重组。经改造的M13噬菌体有M13mp系列和pUC系列。M13噬菌体载体M13噬菌体基因组是单链环40M13噬菌体载体—pUC19α互补：单独存在的α及ω片段都没有半乳糖苷酶的活性，只有宿主细胞与克隆载体同时表达两个片段时，宿主细胞内才有半乳糖苷酶活性，使特异性作用物（X-gal）变为蓝色化合物。突变型lac-E.coli表达β-半乳糖苷酶的ω片段。如果插入的外源基因是在lacZ’基因内，就会影响lacZ’的表达，利用lac-E.coli为转染或感染细胞，在含X-gal的培养基上生长时会出现白色菌落；若无外源基因插入，则出现蓝色菌落。多克隆位点编码β-半乳糖苷酶的α片段M13噬菌体载体—pUC19α互补：单独存在的α及ω片段41病毒载体是一类真核载体，能把基因引入到真核细胞中，并在其中被表达。因此是研究真核细胞表达及调控的有力工具。如:腺病毒、逆转录病毒、乳头瘤病毒等。病毒载体42二、重组DNA技术基本原理

目的基因的获取克隆载体的选择和构建外源基因与载体的连接

重组DNA导入受体菌重组体的筛选克隆基因的表达二、重组DNA技术基本原理目的基因的获取43（一）目的基因的获取化学合成法基因组DNAcDNA聚合酶链反应（一）目的基因的获取化学合成法441.化学合成法

已知某种基因的核苷酸序列，或根据某种基因产物的氨基酸序列推导出编码该多肽链的核苷酸序列，再利用DNA合成仪通过化学合成原理合成目的基因。利用该法合成的基因有：人生长激素释放抑制因子、胰岛素原、脑啡肽、干扰素基因等1.化学合成法已知某种基因的核苷酸序列452.基因组DNA利用限制性核酸内切酶将染色体DNA切割成一定基因水平的许多片段，将这些片段与适当的克隆载体拼接成重组DNA分子，继而转入受体菌扩增，使每个细菌内都携带一种重组DNA分子的多个拷贝。不同细菌所包含的重组DNA分子可能为不同的染色体DNA片段，这样全部转化细菌所携带的各种染色体片段就代表了染色体的整个基因组。存在于转化细菌内、由克隆载体所携带的所有基因组DNA片段的集合称为基因组DNA文库（genomicDNAlibrary）。基因组DNA文库涵盖了基因组全部的遗传信息。2.基因组DNA利用限制性核酸内切酶将46

建立基因组文库后，需结合适当筛选方法从众多转化子菌落中选出含有某一基因的菌落，再进行扩增，将重组DNA分离、回收，以获得目的基因。建立基因组文库后，需结合适当筛选方法从众多473.cDNA

把细胞总mRNA通过逆转录合成总cDNA，再与适当载体连接后转入受体菌，从而得到含有某种生物体全部cDNA集合（称为cDNA文库，cDNAlibrary）。然后用适当的方法从cDNA文库中筛选出目的cDNA。3.cDNA把细胞总mRNA通过逆转录48

cDNA文库的特点是它只包括已经被转录成mRNA的那些基因序列，且不包括内含子及调控序列，所以cDNA文库的复杂性要比基因组文库低的多。但由于不同的细胞类型、发育阶段以及细胞所处的特定状态是由特定基因的表达所决定的，因此各自的mRNA种类就不同，由此产生的cDNA又是独特的。与基因组DNA文库类似，由总mRNA制作的cDNA文库包含了细胞表达的各种mRNA信息，自然也含有我们感兴趣的编码cDNA。cDNA文库的特点是它只包括已经被转录成mRN494.聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）参见437页4.聚合酶链反应（polymerasechainrea50ChainReactionPolymerasechainreactionPCR的产物数目以指数级方式增长中子的释放数目以指数级方式增长中子原子核短时间内巨大的能量释放，原子爆炸DNA片段Cycle1Cycle2Cycle3CycleN理论上可达2n个拷贝原料（pg）产物(ug)ChainReactionPolymerasechain51PCR的基本原理体外高效、快速、特异地扩增目的基因或DNA片段的技术。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适条件——模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲液系统和DNA变性、复性及延伸的温度与时间等，使目的DNA得以迅速扩增PCR的基本原理体外高效、快速、特异地扩增目的基因或DNA52DNA的体内复制：原料：模板DNA（基因组DNA），随机小分子RNA引物，dNTPs酶：DNA聚合酶，解旋酶，引发酶反应条件：胞液环境，37℃反应过程：模板DNA解旋、引发体的形成、延长（三阶段）产物：模板DNA（基因组DNA）拷贝数增加一倍

原料：模板DNA（基因组DNA，cDNA）一对特异性寡核苷酸引物，dNTPs酶：TaqDNA聚合酶反应条件：合适的缓冲液，三种变化的温度（94，50-70，72℃），一定的循环数（25-35）反应过程：DNA模板变性（解链）、模板与引物退火、引物延伸（三阶段，多循环）产物：目的DNA（特异性）拷贝数增加2n倍PCR：DNA的体内复制：原料：模板DNA（基因组DNA），原料：模53DNA模板变性与体内DNA解链过程不同，PCR中作为模板的双链DNA是通过95℃左右的高温使其发生变性，形成单链DNA

DNA模板变性与体内DNA解链过程不同，PCR中作为模板的双54模板与引物退火

PCR通常需要两条寡核苷酸链作为DNA合成时的引物（primer）,这两个引物分别与待扩增模板DNA的目标片段两端的序列互补。在降低温度的过程中，通过控制退火条件，引物就能准确地与扩增区域的两端配对。primers模板与引物退火PCR通常需要两条寡核苷酸链作为DNA合成时55⑴引物短，不易缠绕；⑵设计的引物是与模板DNA两端序列互补；⑶引物的量远大于模板分子的量，引物与模板DNA形成双链的几率远远高于DNA分子自身的复性。⑴引物短，不易缠绕；56引物延伸在PCR反应体系中的DNA聚合酶，能够催化反应体系中游离的单核苷酸（dNTPs）由引物5'→3'方向，按碱基配对的原则延伸，形成两条与模板DNA互补的复制链。Taq酶dNTPS新合成的链又可作为下轮循环反应的模板。

引物延伸在PCR反应体系中的DNA聚合酶，能够催化反应体系中57

热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环每一循环后的模板均比前一循环增加1倍。理论上讲，扩增DNA产量是呈指数上升的，即n个循环后，产量为2n拷贝。而实际上，PCR的扩增倍数为（1+X）n，X为扩增效率，平均为75%热变性-复性-延伸25-35次循环百万倍扩增热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环每一循环58尽管PCR扩增DNA非常有效，但目的DNA序列的指数扩增并不是一个无限制的过程。在正常的反应条件下，经30次循环之后，酶的催化反应趋于饱和，就会出现平台效应

(Plateau)，产物的量不再增加。“平台效应”出现的迟早还取决于酶的性能、模板DNA的拷贝数、dNTP浓度等多种因素。尽管PCR扩增DNA非常有效，但目的DNA序列的指数扩增并不59（三）外源基因与载体的连接（二）克隆载体的选择

粘性末端连接平端连接同聚物加尾连接人工接头连接（三）外源基因与载体的连接（二）克隆载体的选择粘性末端601.粘性末端连接外源DNA片段与载体用同一种限制性内切酶切割，获得相同的粘性末端，相互互补配对，在DNA连接酶作用下，形成重组DNA分子。5’…C▼CGG…3’5’…C▼CGG…3’3’…GGC▲C…5’3’…GGC▲C…5’HpaII1.粘性末端连接外源DNA片段与载体用同一种612.平端连接因载体分子和目的DNA分子之间并不一定都产生互补的粘性末端，有的限制性内切酶只能切成平末端。平末端仍用T4DNA连接酶连接，只是效率低，需要的DNA浓度更高。2.平端连接623.同聚物加尾连接同聚物加尾连接是利用同聚物序列，如polyG与polyC之间的退火作用完成连接。在末端转移酶作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列，如将poly（dC）加到双链DNA片段3'羟基上，而将poly（dG）加到质粒载体3'羟基上，制造出粘性末端，然后进行粘性末端连接。3.同聚物加尾连接同聚物加尾连接是利用634.人工接头连接接头（linker）是指人工合成的一段双链寡核苷酸，其中包含一个（或两个）酶切位点。首先将接头与目的DNA片段进行平末端连接，继而用适当的内切酶将接头部位切出粘性末端，最后与载体进行粘性末端连接。4.人工接头连接64（四）重组体导入受体细胞

在分子克隆中，将质粒或以它为载体构建的重组分子导入受体细胞的过程称为转化（transformation）。以噬菌体和真核病毒作载体构建的重组分子导入受体细胞的过程称为转染（transfection）。

基因片段（特别是纯化的DNA）很难直接导入受体细胞，通常将受体细胞预先加以处理，使其提高基因导入细胞的效率。例如用低温CaCl2（冰浴）处理大肠杆菌，可以大大提高质粒的转化效率。这种经过预处理的、容易导入外源核酸分子的受体细胞被称作“感受态细胞”（competentcell）。（四）重组体导入受体细胞在分子克隆中，将质粒65（五）重组体的筛选

通过转化、转染等方式，重组体DNA分子被导入受体细胞，经适当涂布的培养基培养得到大量转化子菌落或转染噬菌斑。因为每一重组体只携带某一段外源基因，而转化或转染时每一受体菌又只能接受一个重组体分子，所以设法将众多的转化菌落或噬菌斑区分开来，并鉴定哪一菌落或噬菌斑所含的重组DNA分子确实带有目的基因，即可得到目的基因的克隆，这一过程即为筛选（screening）。（五）重组体的筛选通过转化、转染等方式，重66根据载体体系、宿主细胞特性及外源基因在受体细胞表达情况不同，可采取不同的筛选方法。1.直接筛选法（1）抗药性标志筛选（2）标志补救（3）分子杂交法2.非直接筛选法免疫学方法根据载体体系、宿主细胞特性及外源基因在受体细67抗药性标志筛选

如果克隆载体携带有某种抗药性标志基因，如Ampr或Tetr，转化后只有含这种抗药基因的转化子细菌才能在含该抗生素的培养板上生存并形成菌落，这样就可将转化菌与非转化菌区别开来。如果重组DNA时将外源基因插入标志基因内，如插入Tetr内，使标志基因Tetr失活，阳性重组子则不能在含有Tet的培养板上生长。用插入失活筛选的重组子载体往往带有另一个抗生素抗性基因如Ampr，因此可以通过双抗生素对照筛选，即阳性转化子可以在含Amp的培养板上生长而不能在含Tet的培养板上生长。抗药性标志筛选如果克隆载体携带有某种抗药性68标志补救

若克隆的基因能够在宿主菌内表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷互补，则可以利用营养突变菌株进行筛选，这就是标志补救（markerrescue）。-互补：通过蓝白斑筛选可以筛选、鉴定重组体与非重组体载体。标志补救若克隆的基因能够在宿主菌内表达，且表69当外源基因插入后，LacZ’基因被破坏，不能合成完整的β-半乳糖苷酶，因此不能分解底物X-gal，菌落成白色β-半乳糖苷酶能分解X-gal，形成蓝色菌落。当外源基因插入后，LacZ’基因被破坏，不能合成完整的β-半70分子杂交法（molecularhybridization）参见435页分子杂交法（molecularhybridization）71核酸分子杂交（molecularhybridization）：指用标记的已知DNA或RNA片段（探针）检测样品中未知核酸序列，通过碱基互补配对原则发生同源性结合，再经显影或显色的方法，将结合的核酸序列的位置或大小显示出来。探针：带有可检测标记的已知序列的DNA或RNA片段。核酸分子杂交的基本原理变性（denaturation）复性（renaturation）杂交（hybridization）预杂交（prehybridization）核酸分子杂交（molecularhybridization72变性（denaturation）概念：在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双股螺旋或发夹结构打开，有规则的结构被破坏，形成单链分子。变性的因素：加热、酸、碱、尿素、甲酰胺等增色效应（hyperchroniceffect）：核酸变性时，紫外吸收值A260随之升高的现象。变性（denaturation）概念：在某些理化因素的作用下73热变性

DNA的熔解曲线Tm值（meltingtemperature）:热变性时，50%DNA分子变性的温度。又叫解链温度、熔解温度。热变性DNA的熔解曲线74复性（renaturation）

概念：在适当条件下，变性DNA的两条互补单链重新缔合，形成双链的过程。热变性后，缓慢降低温度至比Tm值低20-30℃时，变性的单链DNA可恢复其双链结构，称为退火。杂交（hybridization）

来源不同的两条单链核酸分子通过碱基互补可形成异源双螺旋。如DNA/DNA、DNA/RNA、RNA/RNA杂交分子。复性（renaturation）概念：在适当条件下75预杂交（prehybridization）概念：为了减少探针与广泛存在的非互补核酸的非特异性结合，在杂交前用封闭物将这些非特异性位点封闭。这一杂交前的处理过程称为预杂交。

常用的封闭物：变性的非特异性DNA，如鲑鱼精子DNA、小牛胸腺DNA，又称为覆盖DNA。预杂交（prehybridization）概念：为了76变性、复性、杂交示意图变性、复性、杂交示意图77核酸探针：带有可检测标记的已知DNA或RNA片段，用于检测待测样品中的靶核酸序列。探针分类放射性标记核酸探针非放射性标记核酸探针核酸探针：带有可检测标记的已知DNA或RNA片段，用于检测待78印迹杂交

概念：指将待测核酸序列结合到一定的支持物上，然后与存在于液相中的核酸探针进行杂交的过程。探针与待测核酸片段中的同源序列形成杂交分子，探针分子显示的位置及其量的多少可反应出待测的核酸分子是否存在相应的基因序列及其大小。

分类DNA印迹杂交（Southernblotting）RNA印迹杂交（Northernblotting）印迹杂交概念：指将待测核酸序列结合到一定的支持物上，79提取DNA限制性内切酶消化琼脂糖凝胶电泳碱变性转移到NC膜与DNA或RNA探针杂交放射自显影DNA印迹杂交（Southernblotting）检测靶分子为DNA,检测靶分子是否含有目的基因提取DNA限制性内切酶消化琼脂糖凝胶电泳碱变性转移到NC膜与80将琼脂糖凝胶上的DNA分子转移到硝酸纤维素膜上将琼脂糖凝胶上的DNA分子转移到硝酸纤维素膜上81

菌落原位杂交（Insituhybridization）含有与探针互补序列的菌落或噬菌斑经放射自显影后，在X光底片上出现杂交点。将转化后得到的菌落或噬菌斑原位转移到NC膜上，得到一个与平板菌落或噬菌斑分布完全一致的复制品。原位裂解细胞，碱变性，核酸分子被固定于膜上加入标记的DNA或RNA探针进行杂交根据阳性反应位置，可从保留的母板上挑出所需的阳性克隆。菌落原位杂交（Insituhybridization）82RNA印迹杂交（Northernblotting）

检测靶分子为RNA。主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平，或比较不同组织或细胞的同一基因的表达情况。与Southernblotting不同的是在转移前不需进行限制性内切酶切割。

RNA印迹杂交（Northernblotting）83核酸杂交分类表杂交方法适用范围Southern印迹检测经凝胶电泳分开的DNA分子，需转印到膜上Northern印迹检测经凝胶电泳分开的RNA分子，需转印到膜上斑点杂交检测未经分离的、固定在膜上的DNA或RNA分子菌落或噬菌斑杂交检测固定在膜上的、经裂解后从细菌或噬菌体中释放出的DNA分子原位杂交检测细胞或组织中的DNA或RNA分子核酸杂交分类表杂交方法适用范围Southern印迹检84免疫学方法

免疫学筛选是利用特异抗体与目的基因表达的抗原产物相互作用进行筛选，特异性和敏感性也较高，尤其适用于筛选不为宿主菌提供任何选择标记的基因，或者是已获得了该基因编码的蛋白质产物的多克隆或单克隆抗体，用这些抗体来检测目的基因表达的产物。免疫学方法很多，如Westernblot，免疫化学方法、酶联免疫吸附剂测定（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）、放射免疫沉淀、免疫荧光抗体技术等，可对目的基因表达的蛋白进行定性，甚至定量检测。免疫学方法免疫学筛选是利用特异抗体与目的基因85基因工程的最终目的是在一个合适的系统中，使外源基因高效表达，从而产生有重要价值的蛋白质产品。其过程包括外源基因克隆，外源基因在宿主细胞中经转录、翻译、加工等过程表达相应蛋白以及蛋白产物的分离纯化等过程。

（六）克隆基因的表达基因工程的最终目的是在一个合适的系统中，使外源基86目前世界范围内开发的基因工程多肽药物、疫苗、抗体有500多种目前世界范围内开发的基因工程多肽药物、疫苗、抗体有500多种87

E.coli是当前采用最多的原核表达体系，运用E.coli表达有用的蛋白质必须使构建的表达载体符合下列标准：①含大肠杆菌适宜的选择标志②具有能调控转录、产生大量mRNA的强启动子③含适当的翻译控制序列④含有合理设计的多克隆位点，以确保目的基因按一定方向与载体正确连接。外源基因在原核细胞中的表达

E.coli是当前采用最多的原核表达体系，88E.coli表达体系在实际应用中不足之处：①缺乏转录后加工机制，E.coli表达体系只能表达克隆的cDNA，不宜表达真核基因组DNA②缺乏适当的翻译后加工机制，E.coli表达体系的真核蛋白质不能形成适当的折叠或进行糖基化修饰③表达的蛋白质常常形成不溶性的包涵体④很难在E.coli表达体系中表达大量的可溶性蛋白质E.coli表达体系在实际应用中不足之处：89外源基因在真核细胞中表达

目前常用的真核表达体系有酵母、昆虫和哺乳动物细胞表达体系。利用真核细胞作为基因的表达体系已被证明具有许多原核表达体系所不具备的优势①不仅可以表达克隆的cDNA,也可表达真核基因组DNA

②识别和去除内含子,经剪接加工形成成熟的mRNA③对蛋白进行翻译后加工,最大限度地保证蛋白质的生物学活性

外源基因在真核细胞中表达目前常用的真核表达体系有酵90三、DNA重组技术对医学和生命科学发展的贡献对人类遗传信息的认识基因工程药物与疫苗转基因动物和植物基因诊断与基因治疗三、DNA重组技术对医学和生命科学发展的贡献对人类遗传信91镰刀型红细胞贫血镰刀型红细胞贫血92Chehab等设计一对引物把含有突变的DNA片段（共294bp）扩增，扩增产物用限制性内切酶OxaNI消化，琼脂糖凝胶电泳后染色观察：正常人有2个片段，191和103bp，镰刀状红细胞贫血的

纯合子，仅有一个片段294bp

杂合子有191、103和294bp3个片段Chehab等设计一对引物把含有突变的DNA片段（共93

思考题一、基本概念DNA重组技术限制性核酸内切酶回文结构目的基因基因组DNA文库cDNA文库

α-互补

94二、简述题1.何谓基因重组技术，简述其基本过程。2.何谓目的基因，有哪些来源？3.解释基因载体，哪些DNA可作为基因载体？4.E.coli表达体系和真核表达体系各自的优、缺点。

二、简述题95演讲完毕，谢谢观看！演讲完毕，谢谢观看！96基因重组与基因工程基因重组与基因工程97生物工程定义生物工程是生物技术的总称，是对生命有机体在分子水平、细胞水平、组织水平、个体水平进行不同层次的创造性设计和改造，使之能定向组建具有特定性状的新物种或新品系，从而造福人类的现代应用技术学科。生物工程定义生物工程是生物技术的总称98生物技术的四大体系基因工程细胞工程酶工程发酵工程生物技术的四大体系基因工程99

重组DNA技术（recombinantDNAtechnique），又叫DNA克隆（DNAcloning）。在体外将各种来源的遗传物质——同源的或异源的、真核的或原核的、天然的或人工合成的DNA与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子（复制子），继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增，以获得该DNA分子的大量拷贝。这类克隆是在分子水平上操作，故又称分子克隆（molecularcloning）。一、重组DNA技术相关概念（一）DNA克隆重组DNA技术（recombina100

由于DNA克隆研究对象常常是特异的基因片段，所以又称作基因克隆（genecloning）。实现基因克隆所采用的方法及相关工作统称为基因工程（geneticengineering）。由于DNA克隆研究对象常常是特异的基因片段1011997年2月23日英国Wilmut1997年2月23日102

从复杂的生物有机体基因组中，分离出目的基因片段。用合适的酶切割目的基因和载体，产生匹配的末端在体外，将目的基因片段连接到能自我复制的并且具有选择标记的载体分子上，形成重组DNA分子。将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称宿主细胞），并与之一起增殖。

筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆。从筛选出的阳性克隆中提取出扩增的目的基因片段，供进一步研究使用。基因克隆的基本步骤从复杂的生物有机体基因组中，分离出目的基因片段。基因克隆的103基因克隆的基本步骤基因克隆的基本步骤104粘性末端质粒目的基因粘性末端匹配的粘性末端粘性末端质粒目的基因粘性末端匹配的粘性末端105酶切后的目的基因片段接(连接)连接后的重组质粒DNA分子酶切后的目的基因片段接(连接)连接后的重组质粒DNA分子106重组质粒目的基因大肠杆菌转(转化)染色体真好玩!重组质粒目的基因大肠杆菌转(转化)染色体真好玩!107筛(筛选)分解抗生素的酶含抗生素的培养基还活着!玩完啦!大肠杆菌大肠杆菌筛(筛选)分解抗生素的酶含抗生素的培养基还活着!玩完啦!大肠108大量生长提取大量质粒酶切鉴定大量生长提取大量质粒酶切鉴定109您已经掌握基因克隆的主要步骤！分离目的基因和载体DNA。用合适的酶切割上述两者，产生匹配的末端。连接酶将目的基因装入载体。转入细菌。筛选具有抗药性克隆。您已经掌握基因克隆的主要步骤！分离目的基因和载体DNA。110（二）重组DNA中的工具酶限制性核酸内切酶连接酶聚合酶多聚核苷酸激酶碱性磷酸酶（二）重组DNA中的工具酶限制性核酸内切酶1111.限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）定义：能识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。主要来源于原核生物，可将侵入宿主细胞的外源性DNA迅速降解，而对细菌自身的DNA，则通过甲基化酶在该限制酶切位点甲基化修饰而保护自身的DNA不被降解。限制性内切酶和甲基化酶共同构成细菌的限制和修饰系统。限制性内切酶由于能限制外源DNA的“入侵”而得名。1.限制性核酸内切酶（restrictionendonu112限制酶的命名

限制酶的命名是根据含有该酶的微生物种属而定。通常有三个斜体字母的缩写表示。第一个大写字母取自细菌属名的第一个字母；第二、三个小写字母取自微生物种名的头两个字母；第四个字母代表该微生物同种内不同的株系；如果同一株名发现几种限制酶，则根据其被发现和分离的先后顺序，用罗马数字表示。例如，从大肠杆菌（EscherichiaColi）RY13株中发现分离的第一种限制酶，称为EcoRI。限制酶的命名113限制性内切酶的分类和特点

根据限制酶的组成、辅因子及切割DNA方式不同，可分为I、II、III型。重组DNA技术中常用的是II型限制性内切酶。II型酶作用特点是有严格的识别、切割顺序，以内切方式水解双链DNA中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5'端为磷酸基，3'端为羟基。识别顺序一般为4~6个碱基，通常是回文结构（palindrome）。限制性内切酶的分类和特点根据限制酶的组成、辅114回文结构

II类限制性核酸内切酶识别DNA位点的核苷酸序列呈二元旋转对称，通常称这种特殊的结构顺序为回文结构。

EcoRI5'…GAATTC…3'3'…CTTAAG…5'回文结构115II型酶切割双链DNA产生3种不同的切口：在对称轴中心同时切割双链，产生平末端或称钝性末端（bluntend），如HpaI：5'…GTT▼AAC…3'HpaI5'…GTTAAC…3'3'…CAA▲TTG…5'3'…CAATTG…5'II型酶切割双链DNA产生3种不同的切口：5'…GTT▼A116在对称轴两侧相对位点分别切割一条链。从5’端切割产生

5'端突出的粘性末端，如EcoRI：5'…G▼AATTC…3'EcoRI5'…GAATTC…3'3'…CTTAA▲G…5'3'…CTTAAG…5'从3'端切割产生3'端突出的粘性末端。如PstI：5'…CTGCA▼G…3'PstI5'…CTGCAG…3'3'…G▲ACGTC…5'3'…GACGTC…5'在对称轴两侧相对位点分别切割一条链。从5’端切割产生117表15-2一些常用的限制性内切酶位点表15-2一些常用的限制性内切酶位点118一些限制酶虽然识别序列不完全相同，但能产生相同类型的粘性末端，称为同尾酶，所产生的末端称配伍末端（compatibleend），可进行相互连接。产生平末端的酶切割DNA后，也可彼此连接。一些限制酶虽然识别序列不完全相同，但能产生119连接酶可催化DNA分子中相邻5'磷酸和3'羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接。常用的有T4（噬菌体）DNA连接酶和E.ColiDNA连接酶。2.DNA连接酶3.聚合酶重组DNA技术中，聚合酶（polymerase）的最重要作用是以DNA或RNA为模板在体外合成DNA或RNA。可分为DNA聚合酶和RNA聚合酶两大类。连接酶可催化DNA分子中相邻5'磷酸和3'120

名称 功能及应用 大肠杆菌DNA聚合酶I以DNA为模板，催化5’→3’核酸链的延长，另有3’→5’的外切酶

大片段（klenow）活性。常用于DNA3’末端的标记和填充、cDNA第二链的合成、DNA测序。TaqDNA聚合酶以DNA为模板，催化5’→3’核酸链的延长，另有弱的5’→3’的外切酶活性，耐高温。常用于PCR及DNA测序。末端转移酶催化NTP中的NMP通过其磷酸基与DNA3’-OH连接而使DNA链延长，无需模板。常用于3'端标记或形成DNA共聚尾巴。逆转录酶以RNA为模板，合成cDNA链（5’→3’），另有RNA酶H活性。常用于cDNA第一、二链的合成及反转录PCR（RT-PCR）。RNA聚合酶以DNA为模板合成RNA。常用于离体条件下，合成单链RNA作为杂交探针。名称 121T4多核苷酸激酶（polynucleotidekinase）催化ATP的γ-磷酸基转移至DNA或RNA的5'末端羟基上。常用于单链或双链DNA和RNA探针的5'端标记。4.多聚核苷酸激酶5.碱性磷酸酶牛小肠碱性磷酸酶（calfintestinalalkalinephosphatase,CIP），催化DNA或RNA的5'磷酸基水解。常用于去除线状载体DNA两端的5'磷酸基团，防止载体自身连接环化；也用于用32P标记DNA的5'末端之前除去原来的5'磷酸基。T4多核苷酸激酶（polynucleoti122

应用重组DNA技术有时是为分离、获得某一感兴趣的基因或DNA片段，或是获得感兴趣的表达产物——蛋白质。这些感兴趣的基因或DNA序列就是目的基因。目的基因有两种类型，即cDNA和基因组DNA。（三）目的基因（targetgene）应用重组DNA技术有时是为分离、获得某一感123（四）基因工程载体基因载体：或称克隆载体（cloningvector）,是在基因工程中为“携带”感兴趣的外源DNA（目的基因、外源基因）、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子，具有自我复制和表达功能。其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而特异设计的克隆载体又称表达载体。（四）基因工程载体基因载体：或称克隆载体（cloning124

能自主复制并能带动插入的目的基因一起复制。具有一个以上的单一限制性酶切位点（多克隆位点，multiplecloningsites），以便目的基因的插入。具有合适的筛选标记（如抗药性基因，酶基因等），以便筛选阳性克隆。载体分子量小，以便容纳较大目的基因，拷贝数高。在细胞内稳定性高，以便确保重组体稳定传代而不易丢失。理想载体应具备的基本条件能自主复制并能带动插入的目的基因一起复制。理想载体应具备的125载体的分类

质粒（plasmid）

噬菌体（phage）

病毒（virus）

克隆载体（cloningvector）

表达载体（expressionvector）常用的载体按来源分为载体按得到的产物分类可分为载体的分类126质粒（plasmid）质粒是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子，能在宿主细胞独立自主地进行复制，并在细胞分裂时保持恒定地传给子代细胞。质粒带有某些遗传信息，会赋予宿主细胞新的遗传性状。因为质粒DNA有自我复制功能及携带遗传信息等特性，可作为重组DNA操作的载体。染色体质粒质粒（plasmid）质粒是存在于细菌染色体127

pBR322质粒图谱氨苄青霉素抗性基因四环素抗性基因多克隆位点pBR322质粒图谱氨苄青霉素抗性基因四环素抗性基因多克128噬菌体载体噬菌体是一种细菌病毒，可作为克隆载体。目前使用的噬菌体载体主要有λ噬菌体衍生物载体、M13噬菌体载体等。除M13噬菌体载体外，这类载体的特点是其容量比质粒载体大，即可插入较大的外源DNA片段（如20kb以上）。可以在体外包装产生感染性很高的噬菌体颗粒。噬菌体载体噬菌体是一种细菌病毒，可作为克隆载129噬菌体头部尾部尾丝噬菌体头部尾部尾丝130

λ噬菌体

λ噬菌体（lambdlabacteriophage）是一种大肠杆菌病毒，为线性双链DNA，它的两端各有12个碱基的互补粘性末端，称COS位点。当噬菌体侵入宿主细胞，两个粘性末端互补结合，形成环状分子。λDNA在体外可包装成病毒颗粒，并高效感染大肠杆菌。λ噬菌体131λ噬菌体侵入细菌后，即可裂解生长（环状DNA在细菌中多次复制，合成大量噬菌体基因产物，装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌），又可以溶源生长（λ噬菌体DNA整合到细胞染色体基因组DNA中，与染色体DNA一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解）。λ噬菌体侵入细菌后，即可裂解生长（环状DNA在细菌中多次复132噬菌体感染细菌示意图裂解生长噬菌体感染细菌示意图裂解生长133λ噬菌体基因组中有较大区域仅与溶源生长有关，而对裂解生长并非绝对需要，因此可以缺失或被外源DNA取代。经改造的λ噬菌体衍生载体可分两类:一类是插入型载体，即外源基因插入到载体上单一的限制酶位点，如λgt系列等。另一类是置换型，即两个限制酶位点之间的DNA片段可被外源DNA取代，如Charon，EMBL系列等。λ噬菌体基因组中有较大区域仅与溶源生长有关，134基因工程与基因重组课件135M13噬菌体载体

M13噬菌体基因组是单链环状DNA，当它侵犯宿主菌后，在细菌胞内酶的作用下，单链DNA转变成复制型双链DNA，可提取出来做基因重组。经改造的M13噬菌体有M13mp系列和pUC系列。M13噬菌体载体M13噬菌体基因组是单链环136M13噬菌体载体—pUC19α互补：单独存在的α及ω片段都没有半乳糖苷酶的活性，只有宿主细胞与克隆载体同时表达两个片段时，宿主细胞内才有半乳糖苷酶活性，使特异性作用物（X-gal）变为蓝色化合物。突变型lac-E.coli表达β-半乳糖苷酶的ω片段。如果插入的外源基因是在lacZ’基因内，就会影响lacZ’的表达，利用lac-E.coli为转染或感染细胞，在含X-gal的培养基上生长时会出现白色菌落；若无外源基因插入，则出现蓝色菌落。多克隆位点编码β-半乳糖苷酶的α片段M13噬菌体载体—pUC19α互补：单独存在的α及ω片段137病毒载体是一类真核载体，能把基因引入到真核细胞中，并在其中被表达。因此是研究真核细胞表达及调控的有力工具。如:腺病毒、逆转录病毒、乳头瘤病毒等。病毒载体138二、重组DNA技术基本原理

目的基因的获取克隆载体的选择和构建外源基因与载体的连接

重组DNA导入受体菌重组体的筛选克隆基因的表达二、重组DNA技术基本原理目的基因的获取139（一）目的基因的获取化学合成法基因组DNAcDNA聚合酶链反应（一）目的基因的获取化学合成法1401.化学合成法

已知某种基因的核苷酸序列，或根据某种基因产物的氨基酸序列推导出编码该多肽链的核苷酸序列，再利用DNA合成仪通过化学合成原理合成目的基因。利用该法合成的基因有：人生长激素释放抑制因子、胰岛素原、脑啡肽、干扰素基因等1.化学合成法已知某种基因的核苷酸序列1412.基因组DNA利用限制性核酸内切酶将染色体DNA切割成一定基因水平的许多片段，将这些片段与适当的克隆载体拼接成重组DNA分子，继而转入受体菌扩增，使每个细菌内都携带一种重组DNA分子的多个拷贝。不同细菌所包含的重组DNA分子可能为不同的染色体DNA片段，这样全部转化细菌所携带的各种染色体片段就代表了染色体的整个基因组。存在于转化细菌内、由克隆载体所携带的所有基因组DNA片段的集合称为基因组DNA文库（genomicDNAlibrary）。基因组DNA文库涵盖了基因组全部的遗传信息。2.基因组DNA利用限制性核酸内切酶将142

建立基因组文库后，需结合适当筛选方法从众多转化子菌落中选出含有某一基因的菌落，再进行扩增，将重组DNA分离、回收，以获得目的基因。建立基因组文库后，需结合适当筛选方法从众多1433.cDNA

把细胞总mRNA通过逆转录合成总cDNA，再与适当载体连接后转入受体菌，从而得到含有某种生物体全部cDNA集合（称为cDNA文库，cDNAlibrary）。然后用适当的方法从cDNA文库中筛选出目的cDNA。3.cDNA把细胞总mRNA通过逆转录144

cDNA文库的特点是它只包括已经被转录成mRNA的那些基因序列，且不包括内含子及调控序列，所以cDNA文库的复杂性要比基因组文库低的多。但由于不同的细胞类型、发育阶段以及细胞所处的特定状态是由特定基因的表达所决定的，因此各自的mRNA种类就不同，由此产生的cDNA又是独特的。与基因组DNA文库类似，由总mRNA制作的cDNA文库包含了细胞表达的各种mRNA信息，自然也含有我们感兴趣的编码cDNA。cDNA文库的特点是它只包括已经被转录成mRN1454.聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）参见437页4.聚合酶链反应（polymerasechainrea146ChainReactionPolymerasechainreactionPCR的产物数目以指数级方式增长中子的释放数目以指数级方式增长中子原子核短时间内巨大的能量释放，原子爆炸DNA片段Cycle1Cycle2Cycle3CycleN理论上可达2n个拷贝原料（pg）产物(ug)ChainReactionPolymerasechain147PCR的基本原理体外高效、快速、特异地扩增目的基因或DNA片段的技术。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适条件——模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲液系统和DNA变性、复性及延伸的温度与时间等，使目的DNA得以迅速扩增PCR的基本原理体外高效、快速、特异地扩增目的基因或DNA148DNA的体内复制：原料：模板DNA（基因组DNA），随机小分子RNA引物，dNTPs酶：DNA聚合酶，解旋酶，引发酶反应条件：胞液环境，37℃反应过程：模板DNA解旋、引发体的形成、延长（三阶段）产物：模板DNA（基因组DNA）拷贝数增加一倍

原料：模板DNA（基因组DNA，cDNA）一对特异性寡核苷酸引物，dNTPs酶：TaqDNA聚合酶反应条件：合适的缓冲液，三种变化的温度（94，50-70，72℃），一定的循环数（25-35）反应过程：DNA模板变性（解链）、模板与引物退火、引物延伸（三阶段，多循环）产物：目的DNA（特异性）拷贝数增加2n倍PCR：DNA的体内复制：原料：模板DNA（基因组DNA），原料：模149DNA模板变性与体内DNA解链过程不同，PCR中作为模板的双链DNA是通过95℃左右的高温使其发生变性，形成单链DNA

DNA模板变性与体内DNA解链过程不同，PCR中作为模板的双150模板与引物退火

PCR通常需要两条寡核苷酸链作为DNA合成时的引物（primer）,这两个引物分别与待扩增模板DNA的目标片段两端的序列互补。在降低温度的过程中，通过控制退火条件，引物就能准确地与扩增区域的两端配对。primers模板与引物退火PCR通常需要两条寡核苷酸链作为DNA合成时151⑴引物短，不易缠绕；⑵设计的引物是与模板DNA两端序列互补；⑶引物的量远大于模板分子的量，引物与模板DNA形成双链的几率远远高于DNA分子自身的复性。⑴引物短，不易缠绕；152引物延伸在PCR反应体系中的DNA聚合酶，能够催化反应体系中游离的单核苷酸（dNTPs）由引物5'→3'方向，按碱基配对的原则延伸，形成两条与模板DNA互补的复制链。Taq酶dNTPS新合成的链又可作为下轮循环反应的模板。

引物延伸在PCR反应体系中的DNA聚合酶，能够催化反应体系中153

热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环每一循环后的模板均比前一循环增加1倍。理论上讲，扩增DNA产量是呈指数上升的，即n个循环后，产量为2n拷贝。而实际上，PCR的扩增倍数为（1+X）n，X为扩增效率，平均为75%热变性-复性-延伸25-35次循环百万倍扩增热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环