20章基因工程课件

第二十章基因工程第二十章基因工程1第一节自然界的基因重组一、转化作用二、转导作用三、转位（转座）第一节自然界的基因重组一、转化作用220章基因工程课件3一、Transformation转化作用InsertionCrossingover一、Transformation转化作用InsertionC4二、Transduction转导作用二、Transduction转导作用5转导Transduction:

由病毒介导的DNA由一个细胞向另一个细胞转移的现象。随后DNA会整合到受体细胞的基因组中。转导Transduction:6三、基因重排将一个基因从远离启动子的地方移到距它很近的位点从而启动转录，这种方式被称为基因重排。通过基因重排调节基因活性的典型例子是免疫球蛋白结构基因和T－细胞受体基因的表达。三、基因重排将一个基因从远离启动子的地方移到距它很近的位点从720章基因工程课件8在所有物种中，胚系Ig基因的构成基本上相同。Ig重链和轻链(λ和κ链)基因座都由多个编码V区(可变区）和C区（恒定区）蛋白质的基因组成，并被非编码的DNA（连接区，J区）所分隔。V、C、J区在胚胎期细胞中相距较远，细胞发育分化时，免疫球蛋白重链基因DNA重排，大量间隔序列被切除，使位于J-Cμ之间的增强子序列得以发挥作用，增强基因转录。在所有物种中，胚系Ig基因的构成基本上相同。Ig重链和轻链(920章基因工程课件10四、（转位）转座能将自身插入基因组新位置的DNA序列。1转座子的定义四、（转位）转座能将自身插入基因组新位置的DNA序11（1）含短的末端反向重复序列;（2）含编码转座酶的基因;（3）靶位点存在5-9bp的短正向重复序列。（1）含短的末端反向重复序列;12第二节基因克隆的工具酶第二节基因克隆的工具酶13

识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，与相伴的甲基化酶共同构成细菌防御机制——限制修饰体系（限制外源DNA，保护自身DNA）

HindⅢ流感噬血杆菌种属d株第三种内切酶限制性核酸内切酶命名：属名、种名、株名限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链14切割DNA后有粘端与平端之分或产生平末端识别位点常为4-6个碱基对、具有回文结构的DNA片段AATGAATTCGTACCGTTACTTAAGCATGGC限制性核酸内切酶5’---NGAATTCN---3’3’---NCTTAAGN---5’5’---NGAATTCN---3’3’---NCTTAAGN---5’粘末端(Cohensiveendorstickyend）5’突出端EcoR15’---NCAG

CTGN---3’3’---NGTC

GACN---5’5’---NCAGCTGN---3’3’---NGTCGACN---5’平末端Pvu2（bluntend）错位切割垂直切割切割DNA后有粘端与平端之分或产生平末端识别位点常为4-6个15限制性核酸内切酶的切割频率DNA分子中核苷酸序列是随机排列的，一个识别四个核苷酸序列的内切酶平均每隔256bp（44）出现一次该酶的识别切割位点。那么，识别6或8核苷酸序列的内切酶的切割频率是多少？限制性核酸内切酶的切割频率DNA分子中核苷酸序列是随机排列的16基因工程其他常用的工具酶酶的种类功能DNA连接酶催化DNA中相邻的5'磷酸基和3'羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶I①合成双链cDNA的第二条键②缺口平移制作高比活探针③DNA序列分析④填补3'末端反转录酶以RNA为模板合成cDNA第一链多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5'羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3'羟基末端进行同质多聚物加尾切除末端磷酸基团碱性磷酸酶TaqDNA聚合酶PCR扩增基因工程其他常用的工具酶酶的种类功能DNA连接酶催化17第三节基因克隆的载体第三节基因克隆的载体18

载体（vector）是由在细胞中能够自主复制的ＤＮＡ分子构成的一种遗传成分，通过实验手段可使其它ＤＮＡ片段(外源基因)连接在它的上面，进行扩增或表达。载体（vector）是由在细胞中能够自主复1920章基因工程课件20理想载体应具备的几个条件能在宿主细胞内携带目的基因复制扩增，具有较高拷贝数。有多个限制性内切酶单一位点，便于外源基因的插入。有易检测的遗传筛选标记，如抗生素抗性基因，用于阳性克隆的筛选。分子量小，允许插入外源基因的容量较大。理想载体应具备的几个条件能在宿主细胞内携带目的基因复制扩增21载体分类（按功能分）克隆载体：用于外源DNA的克隆和扩增。表达载体：用于外源基因的表达（转录翻译生成蛋白质）载体分类（按功能分）克隆载体：用于外源DNA的克隆和扩增。22一、克隆载体质粒载体噬菌体载体病毒载体一、克隆载体质粒载体23（一）质粒（plasmid）载体质粒是一种独立于染色体外的小分子环状DNA，一般大小约106~108D，可自身复制和表达，有的质粒还带有可做为选择性标记的抗药性基因，所以质粒经过适当改选后便可成为良好的载体。作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的质粒载体。（一）质粒（plasmid）载体24

质粒（plasmid）

是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。大小约为数千碱基对。常有1~3个抗药性基因，以利于筛选。质粒（plasmid）25质粒载体克隆的质粒载体允许外源的DNA插入，储存。主要是DNA水平上的操作。基因表达的质粒载体允许外源DNA的插入、储存和表达。质粒载体克隆的质粒载体26质粒的生物学特性：1、质粒DNA的构型：

SC型共价闭合环形DNA（cccDNA）OC型开环DNA（ocDNA）L型线性DNA（cDNA）

2、不同质粒的分子量大小差异相当显著：

106~108D

3、作为载体的质粒都含有三种共同的组分：

复制基因（replicator）、选择性记号、克隆位点

质粒的生物学特性：27LOCSCLOCSC28质粒DNA的复制类型：低拷贝的质粒（1～十几个）：严紧型复制控制的质粒

高拷贝的质粒（几十~几百个）：松弛型复制控制的质粒

质粒DNA的复制类型：29重要的大肠杆菌质粒载体1、pBR322质粒载体；2、pUC质粒载体；重要的大肠杆菌质粒载体30以Ampr和Tetr为选择性标记，克隆位点在这两个选择性标记的单酶切位点上。（4363bp）ori以Ampr和Tetr为选择性标记，克隆位点在这两个选择性标记31pBR322的结构来源pBR322的结构来源32pBR322质粒载体的特点：1、具有较小的分子量；

它的分子量为4363bp。克隆载体的分子量大小不要超过10kb。2、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。

pBR322DNA分子中总共有24种核酸内切酶只具有单一的酶切识别位点。其中7种内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部，2种识别位点在于这个基因的启动区内，所以9个限制酶切位点插入外源片断可以导致tetr

基因的失活；另外有3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因有单一的识别位点，pBR322质粒载体的特点：33Example:a.在pBR322质粒的BamH或SalⅠ位点插入外源DNA片断，切断了tetr基因编码序列的连续性，使之失去活性，产生出AmprTets表型的重组pBR322质粒，转化入AmpsTets的大肠杆菌细胞。先涂布在含氨苄青霉素的选择培养基上，筛选出具Ampr菌落，再将它们涂布于含四环素的选择性培养基上。插入外源片断的重组质粒不能在这种培养基上生长。Example:34

b.在PstⅠ或ScaⅠ识别位点插入外源片断会导致Ampr基因的失活，产生AmpsTetr表型的质粒。转化大肠杆菌之后，获得的重组子可以比较快的检测出来。其依据是Ampr表型的细胞可以合成β–内酰胺酶，它能使青霉素转变成青霉酮酸，而这种青霉酮酸能与碘结合。在含有可溶性淀粉和四环素的富裕培养基上选择转化子，经37度培养过夜后，在此平板上加入少量的碘指示剂溶液产生青霉素β–内酰胺酶Ampr的菌落，其周围的碘指示剂溶液变得明亮，而Amps菌落无此反应。b.在PstⅠ或ScaⅠ识别位点插入外源片断会导致Ampr35

3、具有较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后每个细胞中可积累1000~3000个拷贝。3、具有较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后每个细胞中可积36pUC质粒载体人们应用多克隆位点技术，在pBR322的基础上，组入了一个在其5’-端带有一段多克隆位点的lacZ’基因，而发展的具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。

pUC质粒载体37

一种典型的pUC系列的质粒载体，包括以下四个部分：

1、来自pBR322质粒的复制起点（ori）；

2、氨苄青霉素抗性基因（ampr）,但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不在含有原来的核酸内切限制酶的但识别位点。

3、大肠杆菌β-半乳糖基因（lacZ）的启动子及编码α-肽链的DNA序列，此结构称之为lacZ’基因；

4、位于lacZ’基因中的靠近5’-端的一段多克隆位点（MCS）区段。但它并不破坏该基因的功能。一种典型的pUC系列的质粒载体，包括以下四个部分：38AmproripUC18(3kb)MCS(Multiplecloningsites, 多克隆位点）LacpromoterlacZ’MCS(Multiplecloningsites,多克隆位点）：指人工合成的含有多种限制性内切酶单一识别切割位点的DNA序列。

AmproripUC18MCS(Multipleclon39乳糖操纵子结构与调控模式图乳糖操纵子结构与调控模式图40pUC质粒载体的优点第一，具有较小的分子量和更高的拷贝数;

仅保留了pBR322的氨苄青霉素抗性基因和复制起点；在操作过程中复制起点内部发生了自发突变造成了基因rop的缺失，它是控制质粒的特殊因子，从而使拷贝数增加，平均每个细胞500~700个拷贝。第二，适用于组织化学检测重组体；具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ’基因，所编码的α-肽链可参与α-互补作用，用X-gal显色对重组子进行鉴定，而pBR322质粒的重组子要进行两步的选择。第三，具有多克隆位点MCS区段．方便具有不同粘性末端的外源片断的插入。pUC质粒载体的优点41穿梭质粒载体（shuttleplasmidvector）是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，因而可在两种不同的寄主细胞存活和复制的质粒载体。穿梭质粒载体42早期发现的大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒载体大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体大肠杆菌-牛乳头瘤病毒迄今还没有发展出适用的大肠杆菌-植物细胞穿梭载体。早期发现的大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒载体4320章基因工程课件44（二）噬菌体载体（Bacteriophage，简称phage）

（二）噬菌体载体4520章基因工程课件46噬菌体的生命周期噬菌体的溶菌生命周期只具有溶菌生长周期的噬菌体颗粒叫烈性噬菌体。烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：1、吸附吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上。2、注入噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞。3、转变被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所。4、合成大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质。5、组装包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒。6、释放合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来。

噬菌体的生命周期4720章基因工程课件48噬菌体的生命周期噬菌体的溶源生命周期是指在感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒，噬菌体的DNA是整合到寄主细胞染色体DNA上，成为它的一个组成部分。

现知道只有双链DNA的噬菌体才具有溶源周期噬菌体的生命周期49温和噬菌体：既能进入溶菌生命周期又能进入溶源生命周期。溶源性细菌：具有一种完整的噬菌体基因组的细菌溶源化：用温和噬菌体感染细菌培养物使之形成溶源性细菌的过程整合：噬菌体的DNA是被包容在寄主细胞染色体DNA中原噬菌体：在溶源细菌内存在的整合的或非整合的噬菌体超感染免疫性：溶源性细菌不能够被头一次感染并使之溶源化的同种噬菌体再感染。温和噬菌体：既能进入溶菌生命周期又能进入溶5020章基因工程课件51λ噬菌体载体λ噬菌体载体52λ噬菌体基因组长48.5kb基因组可为线状和环状两种形式(cosends)溶菌阶段溶源阶段λ噬菌体基因组长48.5kb溶菌阶段溶源阶段53 5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’

剪切连接(包装过程)(侵染细菌细胞后)GGGCGGGCGACCTCG-3’5’-CG+GC-5’3’-GCCCCGCCGCTGGAThephagecosends环状线状 5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’Theph5420章基因工程课件55AWBCDEFZUVGHMLKIJb2

cI

crocIIOPQSRattintxisgamredcIIINCOSCOS头部基因尾部基因功能不明区溶源化重组早期控制阻遏DNA合成溶菌生长非必须区段cI基因：溶源过程控制基因。λ噬菌体的基因组结构AWBCDEFZUVGHML5620章基因工程课件57体外包装

λ噬菌体DNA体外重组后，一般必须经过体外包装，然后以噬菌体感染的方式将重组DNA导入E.coli细胞内。这是因为以感染方式导入细胞的频率可达106~108/μgDNA，λ噬菌体的包装限制为野生噬菌体DNA（约48.5kb）的75%~105%。体外包装58

由于λ噬菌体包装时，当DNA的长度短于野生型的78%或超过105%时，噬菌体的活性就急剧下降。因此只包装它的野生型DNA（48.5KB）的75%~105%左右的ＤＮＡ，要求λ载体DNA和外源DNA长度之和在39～53kb之间。由于λ噬菌体包装时，当DNA的长度短于野生型的7859DNAProteincoatcoscosNonessential

regionLong(left)armshort(right)armExogenousDNA(~20-23kb)λphage12bpDNAProteincoatcoscosNonessent60λ噬菌体载体的主要类型1.插入式载体一种只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点的派生载体。

2.替换型载体（取代型载体）

具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的λDNA区段可以被外源插入的DNA片段所取代。λ噬菌体载体的主要类型61插入式载体：

cI基因插入失活：如λgt10等载体，在cI基因上有EcoRI及HindIII的酶切位点。外源基因插入后将导致cI基因的失活。cI基因失活后将导致噬菌体不能溶原化，产生清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的噬菌斑。LacZ基因插入失活：如charon16A载体，在非必须区段引入lacZ基因，在lacZ基因上有EcoRI位点，插入失活后利用X-gal法筛选（兰白筛选）。

插入式载体：62cIEcoRILA32.7RA10.6λgt10

lacZLA19.9RA21.9EcoRICharon16AcIEcoRILA32.7RA10.66320章基因工程课件64λ替换型载体（取代型载体）外源DNA取代噬菌体染色体中对于噬菌体的感染和复制非必需的片段(约20kb)这些载体是用Lac5（乳糖操纵子的大部分系列，包括完整的LacZ）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac5作为选择标记，使用时用EcoRⅠ水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解E.coli，形成空斑。如EMBL系列λ替换型载体（取代型载体）外源DNA取代噬菌体染色体中对于65Lac5EcoRIEcoRIEcoRIBanHISalISalIBamHIEcoRIMCSMCSCharon4AEMBL3/4Charon40Lac5EcoRI66替换型载体克隆外源DNA的步骤1.应用适当的核酸内切酶消化λ载体，除去可取代的DNA片段；2.将上述所得的

λDNA载体臂同外源DNA片段的连接；3.对重组体的λDNA分子进行包装和增殖，以得到有感染性的λ重组噬菌体替换型载体克隆外源DNA的步骤67（左右臂连接）（三段自身连接）（插入片段）（左右臂连接）（三段自身连接）68根据噬菌斑的透明度或颜色来进行重组子的筛选根据噬菌斑的透明度或颜色来进行重组子的筛选69（黏性质粒）柯斯质粒载体（黏性质粒）柯斯质粒载体70柯斯质粒载体cosmid载体：也称粘粒、柯斯载体。这是一类用于克隆大片段DNA的载体，它是由λ噬菌体的cos（cohesivesite）末端及质粒（plasmid）重组而成的载体。cosmid载体带有质粒的复制起点、克隆位点、选择性标记以及λ噬菌体用于包装的cos末端等，因此该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬菌体，而是以质粒DNA的形式存在于细胞内。柯斯质粒载体71设计构建的柯斯质粒一般长4～6kb。其上的cos位点的一个重要作用是识别噬菌体的外壳蛋白。凡具有cos位点的任何DNA分子只要在长度相当于噬菌体基因组，就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似噬菌体λ的颗粒。因此，插入柯斯质粒的外源DNA可大于40kb。重组的柯斯质粒可象噬菌体λ一样感染大肠杆菌，并在细菌细胞中复制。设计构建的柯斯质粒一般长4～6kb。其上的cos72柯斯质粒载体的特点具有λ噬菌体的特性；具有质粒载体的特性；具有较高容量的克隆能力(40Kb)；柯斯质粒载体的特点73柯斯质粒pHC79系由质粒pBR322和噬菌体λ的cos位点的一段DNA构成全长4.3kb柯斯质粒pHC79系由质粒pBR322和噬菌体λ的cos位点74单链DNA噬菌体载体(M13)单链DNA噬菌体载体75M13噬菌体载体M13是一种含单链（+）DNA（ssDNA）的丝状大肠杆菌噬菌体，其基因组大小为6.4kb。这类载体主要用来获得大量的单链ＤＮＡ片段，这种单链ＤＮＡ片段在遗传学研究中主要用来测定ＤＮＡ序列（sanger双脱氧法）、基因的定点突变研究、异源双链DNA的分析等。

M13噬菌体载体7620章基因工程课件77RFDNARFDNA7820章基因工程课件79M13载体具有多克隆位点(MCS)，方便克隆。许多M13载体的多克隆位点与质粒载体pUC序列的多克隆位点是相同的，在克隆位点选择上更为方便。可以定向地克隆DNA片段，克隆在M13RFDNA分子上的双链DNA片段，到了子代噬菌体便成了单链的形式。所以如果要同时分离ＤＮＡ分子中的双链，则需要两种独立的克隆。M13载体80Blue-whiteselectionBlue-whiteselection81M13载体系列的优点1.在这类载体的基因组中有一条饰变的β-半乳糖苷酶基因片段，其中插入了一段具有密集的多克隆位点的序列；2.M13载体系列是应用基因工程技术成对构建的，可有效地克隆双链DNA分子中的每一条链。M13载体系列的优点82M13克隆载体分子结构图M13克隆载体分子结构图83噬菌粒载体噬菌粒载体84噬菌粒载体

由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型的载体系列。它具有质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位点等，方便DNA的操作，可在细胞内稳定存在；又具有单链噬菌体的复制起点，在辅助噬菌体的存在下，可进行噬菌体的繁殖，产生单链的子代噬菌体。噬菌粒载体85常用的噬菌粒载体pUC118和pUC1191.具有较小分子量的共价、闭合、环形的基因组DNA，可克隆10kb的外源DNA片段，并易于进行分离与操作；2.编码一个ampr基因作为选择记号，因此只有携带pUC118或pUC119噬菌粒载体的大肠杆菌转化子细胞，才能够在含有氨苄青霉素的培养基中生长，便于转化子的选择；3.拷贝数含量高，每个寄主可高达500个，所以只要用少量的大肠杆菌细胞培养物，便可制备出大量的载体DNA；4.存在着一个多克隆位点区，因此许多种不同类型的外源DNA片段，不经修饰便可直接插入到载体分子上；常用的噬菌粒载体pUC118和pUC119865.由于多克隆位点区阻断了大肠杆菌lacZ基因的5’-端编码区，可按照IPTG组织化学显色反应试验，筛选重组子；6.lacZ基因是置于lac启动子的控制之下，这样插入的外源基因便会以融合蛋白质的形式表达；7.含有质粒的复制起点，在没有辅助噬菌体的情况下，克隆的外源基因可以像质粒一样按常规的方式，复制形成大量的双链DNA分子8.带有一个M13噬菌体的复制起点，在有辅助噬菌体感染的寄主细胞中，可以合成出单DNA拷贝，并包装成噬菌体颗粒分泌到培养基中；5.由于多克隆位点区阻断了大肠杆菌lacZ基因的5’-端编879.在pUC118和pUC119这两个载体中，多克隆位点区的核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它们当中的一个可转录克隆基因的正链DNA，另一个则可转录出负链DNA；10.可以直接对克隆的DNA片断进行核苷酸的序列测定，免去了从质粒载体到噬菌体的这一烦琐的亚克隆步骤。9.在pUC118和pUC119这两个载体中，多克隆位点区8820章基因工程课件89pBluescript噬菌粒载体基本结构：1.在多克隆位点的两侧，有一对T3和T7噬菌体的启动子，可以定向指导外源基因的转录活动；2.同时具有一个单链噬菌体M13或f1的复制起点和一个来自ColE1质粒的复制起点，在不同的情况下，可以采取不同的复制形式，分别合成单链或双链的DNA；3.编码有一个氨苄青霉素抗性基因，供作转化子记号；4.含有lacZ基因，可用Xgal-IPTG组织显色反应法筛选噬菌粒载体。pBluescript噬菌粒载体90T7T3用于体外转录T7T3用于体外转录91（三）其他载体

酵母人工染色体载体（yeastartificialchromosome,YAC）细菌人工染色体 （bacterialartificialchromosome,BAC）动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒、腺病毒相关病毒、逆转录病毒）（三）其他载体92人基因组十分庞大，约含3×109bp，建立和筛选人的基因组文库，要求有容量更大的载体，酵母人工染色体（yeastartificialchromosome,YAC）载体应运而生。YAC含有酵母染色体端粒（telesome）、着丝点(centromere)及复制起点等功能序列，可插入长度达200-500kb的外源DNA，导入酵母细胞可以随细胞分裂周期复制繁殖供作克隆，成为人基因组研究计划的重要载体。人基因组十分庞大，约含3×109bp，建立和93正常酵母人工染色体含有：*四膜虫端粒（tel)*酵母自主复制序列（ARS)*酵母着丝点(CEN)*酵母的选择标记(TRP1、URA1)YAC载体正常酵母人工染色体含有：YAC载体94质粒和噬菌体载体只能在细菌中繁殖，不能满足真核DNA重组需要。感染动物的病毒可改造用作动物细胞的载体。由于动物细胞的培养和操作较复杂、花费也较多，因而病毒载体构建时一般都把细菌质粒复制起始序列放置其中。使载体及其携带的外来序列能方便地在细菌中繁殖和克隆，然后再引入真核细胞。目前病毒载体常用者有改造来自猴肾病毒SV40（SimianVirus40）、逆转录病毒和昆虫杆状病毒等，使用这些病毒载体的目的多为将目的基因或序列放入动物细胞中表达或试验其功能、或作基因治疗等。

质粒和噬菌体载体只能在细菌中繁殖，不能满足真核D95质粒*受体细胞结构插入片断举例E.coli环状〈8*pUC18/19,T-载体pGEM-3z等λ噬菌体E.coli线状9-24kbEMBL系列，Λgt系列丝状噬菌体及噬菌粒E.coli环状〈10kbM13mp系列粘粒载体E.coli环状35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCVBAC(BacterialArtificialChromosome)E.coli环状≈300kbPeloBAC系列PAC(P1-derivedArtificialchromosome)E.coli环状100-2000kbPCYPAC1YAC(YeastArtificialchromosome)酵母细胞线性染色体100-2000kbMAC(MammalianArtificialChromosome)哺乳类细胞线性染色体〉1000kb病毒载体动物细胞环状SV40载体，昆虫杆状病毒载体穿梭载体动物细胞和细菌环状pSVK3质粒，PBV,Ti质粒载体的种类和特征质粒*受体细胞结构插入片断举例E.coli环状〈8*pU96质粒λ噬菌体柯斯质粒单链噬菌体克隆DNA大片段±*++-构建基因组文库-++-构建DNA文库+---常规的亚克隆化+---构建新型的DNA结构+---序列分析+--+单链探针+**--+外源基因在大肠杆菌中的表达+---四种常用载体的比较*外源DNA如超过10kb，则重组质粒的转化率和DNA得率都非常低**已有个别材料可用于此目的质粒λ噬菌体柯斯质粒单链噬菌体克隆DNA大片段±*++-构建97二表达载体二表达载体98

大肠杆菌（原核）表达载体表达载体：按特殊设计构建的，能使克隆在其中特定位点的外源真核基因的编码序列，在大肠杆菌细胞中正常转录并转译成相应蛋白质的克隆载体。

大肠杆菌（原核）表达载体表达载体：按特殊设计构建的，能99表达载体除了具有克隆载体所具备的复制起始位点，抗性基因和多克隆位点外，还需具备转录和翻译所必需的元件。如：具有功能（强）启动子；具有核糖体结合位点；转录终止序列。表达载体除了具有克隆载体所具备的复制起始位点，抗性基因和多克100

101核糖体结合位点启动子转录终止子复制起点核糖体结合位点启动子转录终止子复制102PL启动子的表达载体是一种最广泛使用大肠杆菌表达载体的启动子之一。

λ噬菌体的阻遏物－操作系统PL启动子的表达载体λ噬菌体的阻遏物－操作系统103cI基因存在一个温度敏感突变等位基因。42度时，阻遏蛋白失活；28-30度时，PL启动子完全被阻遏蛋白抑制。通过改变温度来控制PL启动子的开闭cI基因存在一个温度敏感突变等位基因。104真核表达载体真核表达载体的构建有：原核生物的序列，来自质粒的复制起始序列、抗生素抗性标记基因。真核生物表达调控的元件，包括启动子，增强子、转录终止和polyA加尾信号。真核细胞的复制起始序列，可筛选标记基因等。真核表达载体真核表达载体的构建有：105真核表达载体主要包括质粒载体和病毒载体，使用的调控表达元件最初多来源于病毒SV40病毒载体逆转录病毒载体腺病毒载体腺相关病毒载体真核表达载体主要包括质粒载体和病毒载体，使用的调控表达106第四节基因克隆的一般过程第四节基因克隆的一般过程107基因克隆的基本过程

1．

载体的选择和制备2．

制备目的基因片段3．

目的基因和载体间的重组连接4．

重组DNA导入受体细胞5．

重组子的筛选和鉴定

6．

重组子的扩增或表达基因克隆的基本过程1．

载体的选择和制备108一、目的基因的获取1.用PCR技术获取基因2.用RT-PCR（逆转录-PCR）获得基因3.从基因组文库或cDNA文库中获取基因4．人工合成基因一、目的基因的获取1.用PCR技术获取基因109是根据DNA半保留复制和DNA聚合酶的特性建立起来的体外复制扩增DNA片段的技术1.用PCR技术获取基因（聚合酶链式反应,

polymerasechainreaction）KaryB.Mulis1985年发明,获1993年诺贝尔化学奖可将微量的目的DNA在体外扩增100万倍以上PCR技术是根据DNA半保留复制和DNA聚合酶的特性建立起来的体外复制1102.用RT-PCR（逆转录-PCR）获得基因以mRNA为模板，先进行逆转录得到cDNA（complementaryDNA，cDNA），再进行的PCR反应模板为mRNA需逆转录酶产物为cDNART-PCR与PCR区别2.用RT-PCR（逆转录-PCR）获得基因以m1113.从基因组文库或cDNA文库中获取基因基因组文库（genomicDNAlibrary）

含有某种生物体全部基因片段的重组DNA克隆群体cDNA文库（cDNAlibrary）含有某一组织细胞中的全部mRNA信息

基因文库genelibrary3.从基因组文库或cDNA文库中获取基因基因组文库（geno112文库构建提取染色体DNA↓DNA片段↓插入适当的克隆载体↓转入受体菌扩增↓基因组文库基因组文库的构建机械法或限制性内切酶切割文库构建提取染色体DNA基因组文库的构建机械法或限制性内切酶113细胞总mRNA↓反转录酶

cDNA

↓插入合适载体↓转入受体菌↓

cDNA文库cDNA文库的构建细胞总mRNAcDNA文库的构建114基因文库构建示意图基因文库构建示意图1154．人工合成基因

已知目的基因的碱基序列可用DNA合成仪合成基因片段，然后用其他反应将基因片段连接起来优点可修饰基因

可在基因两端设计接头可选择各种宿主生物偏爱的密码子4．人工合成基因已知目的基因的碱基序列可用DNA合成116二、克隆载体的选择与制备1.根据克隆片段的大小。2.根据实验目的（表达或扩增）等等二、克隆载体的选择与制备1.根据克隆片段的大小。117三、目的基因与克隆载体的连接（一）粘性末端连接1.利用相同的酶切位点——单酶单切点

用同一种酶分别切割目的基因/载体，然后进行连接。优点：二者产生相同的粘性末端，彼此很易按碱基配对退火，在ligase作用下生成DNA分子重组体。如：geneEcoRⅠvectorEcoRⅠ三、目的基因与克隆载体的连接（一）粘性末端连接118问题与解决办法：

（1）自身环化

粘性末端自发形成双链，连接产物含大量的目的基因和载体自身环化的假重组体－>若转化则出现假阳性克隆。解决办法是

用高浓度的DNA（目的基因：载体为3：1）和碱性磷酸酶（AP：BIP/CIP）处理载体，去除5’－P使之不能自身环化，缺口在宿主内可得到修复。（2）不能定向克隆/插入

由于是单一位点，目的基因可以以不同方向插入载体。对于克隆扩增问题不大，因为克隆上去的基因再重组时又要切下来；对于表达载体目的基因必须按5‘－3’方向克隆在启动子下游而不能反之。问题与解决办法：1192.利用相同的酶切位点——双酶双切点（定向克隆）优点（1）避免载体/目的基因的自身环化，提高连接效率；（2）可控制外源基因插入方向。构建表达载体时最好使用双酶双切点，这样方式也称定向克隆。如：目的基因和载体都有EcoRⅠ，PstⅠ酶切位点，产生各自互补粘端，分别配对连接。2.利用相同的酶切位点——双酶双切点（定向克隆）1203.通过同聚物加尾连接同聚物加尾是指用末端脱氧核苷酸转移酶将某种脱氧核苷酸加到目的基因的3’末端的羟基上（polydC)，又将与之互补的脱氧核苷酸（polydG)加到载体3’末端的羟基上，制造出粘性末端。dC：dG同源多聚尾是连接DNA片段克隆cDNA的有效方法。3.通过同聚物加尾连接1214.加人工接头连接

人工接头（linker，接头）是指人工合成的，连接目的基因两端的含有某些限制酶位点的寡核苷酸片段，如含EcoRⅠ的linker与目的基因的连接图（p371）。4.加人工接头连接1225.聚合酶链反应特异引物连接

利用PCR技术，将PCR引物的5’端加上限制性内切酶的切点。5.聚合酶链反应特异引物连接1236.T载体（A/T克隆法）

在克隆PCR产物cDNA时可采用这一方法。（1）cDNA末端添加AA利用Taqpol延伸活性，以不依赖模板的方式在已完成延伸的PCR产物的3’端添加AA（利用DNApol活性可成）。（2）末端为TT的线性化的T载体可用下述2种方法得到：

①MbcⅡ、XcmⅠ或HphⅠ酶切产生单个T突出末端；②将T加到酶切产生的平端的载体上；T载体已商品化。6.T载体（A/T克隆法）124（二）平头末端的连接平端的4个来源载体目的基因连接或克隆策略①少数限制酶如HaeⅡ对称切产生平端√√cDNA①目的基因载体平端平端连接②机械剪切DNA产生平端√√cDNA②加人工接头连接（cDNA/vector）③逆转录生成cDNA是平端√cDNA③用衔接接头取代人工接头连接（cDNA/vector）④5’端突出，用酶切平，或用酶填平3’端；3’端突出只能切平，不能填平产生平端√√cDNAcDNA④通过同聚尾连接(cDNA/vector)（二）平头末端的连接平端的4个来源载体目的基因连接或克隆策略125（一）序言1.导入目的

（1）克隆扩增

rDNA导入宿主细胞，利用宿主的生理条件，克隆扩增，克隆片段随着载体（如质粒）一起扩增获得扩增DNA片段（如细菌分裂繁殖）。（2）克隆表达

利用宿主的生理条件，生产基因工程产品或开展基因治疗。受体细胞接受rDNA分子的细胞称作受体细胞或宿主细胞。（1）原核细胞既可以复制扩增，也可以基因表达。（2）真核细胞一般只用作基因表达系统。四、重组DNA（rDNA）导入受体细胞

（一）序言四、重组DNA（rDNA）导入受体细胞

1262.受体细胞的基本条件(1)易接纳rDNA分子；(2)对载体复制扩增无严格限制；(3)不降解，不修饰外源DNA分子。3.转化和转染（transformation/transfection）

rDNA导入原核细胞的过程称转化，导入真核称转染。2.受体细胞的基本条件127（二）rDNA导入大肠杆菌1.氯化钙转化法感受态细胞2.电穿孔法转化效率高于方法13.体外包装感染法适用于λ载体和柯斯质粒（二）rDNA导入大肠杆菌1.氯化钙转化法128（二）rDNA导入哺乳动物细胞1.DNA-磷酸钙共沉淀2.病毒感染法3.显微注射法4.脂质体介导法（二）rDNA导入哺乳动物细胞1.DNA-磷酸钙共沉淀129五、转化菌的筛选（一）λ噬菌感染E.coli可以溶菌生长，形成很亮的噬菌斑，溶源生长多少也有溶菌，形成噬菌斑挑选噬菌斑即可分析鉴定转化子。

（二）质粒转化E.coli可用含抗生素的平板筛选，挑选阳性克隆分析鉴定转化子（图8-3）。六、DNA重组体的筛选转化子不一定就是重组子。

转化菌中有一部分是重组子，质粒载体就是粘端基因的重组体，含有载体抗生素抗性基因，可在含抗生素平板上存活。而酶切不完全或酶切后载体未与目的基因重组而自身环化导入host中去的另一部分就可能不是的，但因含抗生素抗性基因也可在抗生素平板上生长，所需要rDNA筛选。确定外源DNA片段是否插入并与载体连接。五、转化菌的筛选130五重组体的筛选与鉴定（一）遗传学方法1.抗生素抗性筛选（插入失活）此法适用于带有抗生素抗性标记基因的克隆载体，将外源DNA插入到其一抗生素基因序列内，该基因就失活，据此特性，设计一套药物平板，可筛选出重组子。

五重组体的筛选与鉴定（一）遗传学方法131插入失活应用举例1.PBR322含Ampr和tetr,后者含BamHI和SalI2个单一限制酶切点，具有Ampr和tetr表型。（双抗）2.在tetr任何一个酶切点插入外源基因片断，都会导致tetr失活。3.将含有插入外源基因的PBR322的细菌先涂布于含Amp的琼脂板上，存活者必定是转化子。（Ampr）4.将存活菌复印在tet的琼脂板上，对照2个平板，凡在Amp平板上生长而在tet上不生长的菌落，必定是带有外源基因的重组子。插入失活应用举例1.PBR322含Ampr和t132五重组体的筛选与鉴定（一）遗传学方法2.遗传标记补救筛选A二氢叶酸还原酶（DHFR)标记基因用于外源基因导入哺乳动物细胞后阳性克隆的筛选。五重组体的筛选与鉴定（一）遗传学方法133B.α－互补（蓝白菌落筛选或称x－gal筛选）⒈载体Puc系列（PUC18/19）带有E.coliDNA的短区段，含：(1)Lacz(N)即编码β－半糖苷酸N端的146个AA信息也称α－多肽；(2)编码区插入一个MCS并不破坏阅读框，使少数几个AA插入到该酶的N端而不影响其功能；(3)Plac可以启动Lacz的转录，表达，但受阻pr.阻遏，IPTG（异丙基硫代β－半乳糖苷）能够去阻遏。⒉JM103受体菌含lacz(c)可以编码β－半乳糖苷酶的C端部分⒊α－互补当载体转入JM103lacz(n)与lacz(c)α互补，编码具有活性酶pr→使底物X-gal生色（5溴4氯3吲哚β－半乳糖苷产生兰菌落）。⒋当MCS插入外源gene片断时，几乎无一例外产生无α－互补能力的氨基酸片段（插入酶失落）导致白菌落产生。B.α－互补（蓝白菌落筛选或称x－gal筛选）⒈载体Puc13420章基因工程课件135PUC19PlacLacZ(N)MCSJM103外源基因片段插入白菌落IPTGlacz(c)X-gal蓝菌落β-半乳糖苷酶图α-互补①②③④PUC19LacZ(N)MCSJM103外源基因片段插入136C.噬菌斑筛选

噬菌体系列载体包装外源DNA后的重组分子的长度必需是其野生型长度的75%-105%时，方能形成有活性的噬菌体颗粒，在培养平板上出现清晰的噬菌斑。不含外源DNA的单一载体DNA因其长度太小不能被包装成活的噬菌体颗粒，感染细菌后不形成噬菌斑。C.噬菌斑筛选137（二）免疫学方法westernblotting，检测外源基因的表达产物。

（二）免疫学方法138（三）分子生物学方法

1.限制性内切酶酶切图谱分析基本流程是:

⑴挑选平板转化菌落→小量培养→快速提取质粒.⑵酶切rDNA和载体对照电泳分析→即可判断所选菌落是否含有重组DNA分子.

EcoRIPBR325-APOAIPUC19-APOAI加样孔2.7kb5.4kb0.89kb图pUC19-APCAI和pBR325-APOAI质粒DNA及其EcoRI酶切产物的琼脂糖电泳图PUC19（三）分子生物学方法

1.限制性内切酶酶切图谱分析EcoR1392.核酸探针杂交检测法2.核酸探针杂交检测法1403.聚合酶链反应（PCR)4.测序3.聚合酶链反应（PCR)141第五节克隆基因的表达第五节克隆基因的表达142一、原核生物表达体系一、原核生物表达体系143（一）大肠杆菌表达体系组成1.目的基因：真核生物目的基因的cDNA(CDS)；2.载体：大肠杆菌表达载体（包含三要素）3.受体菌株：遗传改造的基因工程菌

（一）大肠杆菌表达体系144（二）、提高外源基因表达水平的策略1.促进蛋白质合成选用强启动子。调整SD序列和起始密码子之间的距离。利用温度敏感或药物诱导启动子来协调宿主菌的生长周期和表达周期。2.抑制蛋白降解融合蛋白表达。使用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌突变体。3.维持和恢复蛋白质特异空间结构控制目的蛋白占总细菌蛋白的量，防止形成包涵体。

（二）、提高外源基因表达水平的策略1.促进蛋白质合成145大肠杆菌表达体系

优越性：1.对大肠杆菌的背景知识，特别是基因表达调控的分子机理有深刻的了解；2.是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体；3.许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中实现有效、高水平的表达；4.大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易用于批量生产。大肠杆菌表达体系146大肠杆菌中表达体系的不足：1.真核基因，在结构上同原核基因之间存在着很大的差别。2.真核基因的转录信号同原核的不同。细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子；外源基因可能含有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷酸序列。3.真核基因mRNA的分子结构同细菌的有所差异，影响真核基因mRNA稳定性。大肠杆菌中表达体系的不足：1474.许多真核基因的蛋白质产物，都要经过转译后的加工修饰（正确折叠和组装），而大多数的这类修饰作用在细菌细胞中并不存在；5.细菌的蛋白酶，能够识别外来的真核基因所表达的蛋白质分子，并把它们降解掉。4.许多真核基因的蛋白质产物，都要经过转译后的加工修饰（正148原核细胞表达载体pBV220、pET等,多种载体有商品化供应原核细胞RNA聚合酶可以识别的启动子原核细胞转录终止子原核细胞核糖体结合位点其他调控序列结构特点克隆基因在原核生物中表达的必要条件是携带克隆基因的载体具备原核生物中所需要的以下表达调控序列:

原核细胞表达载体pBV220、pET等,多种载体有商品化149表达质粒载体pET的结构表达质粒载体pET的结构150适用于结构复杂的大分子蛋白，尤其那些空间结构和生物学活性依赖于糖基化或磷酸化等修饰的蛋白质。常用的真核表达体系有酵母，昆虫和哺乳类动物细胞等。二、真核生物表达体系适用于结构复杂的大分子蛋白，尤其那些空间结构151（一）真核表达载体主要包括质粒载体和病毒载体，使用的调控表达元件最初多来源于病毒。SV40病毒载体逆转录病毒载体腺病毒载体腺相关病毒载体（一）真核表达载体主要包括质粒载体和病毒载体，使用的调152真核细胞表达系统的优缺点优点重组质粒转染的细胞具有遗传的稳定性和可重复性。可表达需要翻译后修饰的蛋白。可表达基因组DNA，也可表达cDNA。可表达分泌性蛋白。蛋白产物对宿主细胞的影响不大，且自身也很少降解。真核细胞表达系统的优缺点优点重组质粒转染的细胞具有遗传的稳定153缺点表达系统相对复杂成本高生长周期长缺点表达系统相对复杂154演讲完毕，谢谢观看！演讲完毕，谢谢观看！155第二十章基因工程第二十章基因工程156第一节自然界的基因重组一、转化作用二、转导作用三、转位（转座）第一节自然界的基因重组一、转化作用15720章基因工程课件158一、Transformation转化作用InsertionCrossingover一、Transformation转化作用InsertionC159二、Transduction转导作用二、Transduction转导作用160转导Transduction:

由病毒介导的DNA由一个细胞向另一个细胞转移的现象。随后DNA会整合到受体细胞的基因组中。转导Transduction:161三、基因重排将一个基因从远离启动子的地方移到距它很近的位点从而启动转录，这种方式被称为基因重排。通过基因重排调节基因活性的典型例子是免疫球蛋白结构基因和T－细胞受体基因的表达。三、基因重排将一个基因从远离启动子的地方移到距它很近的位点从16220章基因工程课件163在所有物种中，胚系Ig基因的构成基本上相同。Ig重链和轻链(λ和κ链)基因座都由多个编码V区(可变区）和C区（恒定区）蛋白质的基因组成，并被非编码的DNA（连接区，J区）所分隔。V、C、J区在胚胎期细胞中相距较远，细胞发育分化时，免疫球蛋白重链基因DNA重排，大量间隔序列被切除，使位于J-Cμ之间的增强子序列得以发挥作用，增强基因转录。在所有物种中，胚系Ig基因的构成基本上相同。Ig重链和轻链(16420章基因工程课件165四、（转位）转座能将自身插入基因组新位置的DNA序列。1转座子的定义四、（转位）转座能将自身插入基因组新位置的DNA序166（1）含短的末端反向重复序列;（2）含编码转座酶的基因;（3）靶位点存在5-9bp的短正向重复序列。（1）含短的末端反向重复序列;167第二节基因克隆的工具酶第二节基因克隆的工具酶168

识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，与相伴的甲基化酶共同构成细菌防御机制——限制修饰体系（限制外源DNA，保护自身DNA）

HindⅢ流感噬血杆菌种属d株第三种内切酶限制性核酸内切酶命名：属名、种名、株名限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链169切割DNA后有粘端与平端之分或产生平末端识别位点常为4-6个碱基对、具有回文结构的DNA片段AATGAATTCGTACCGTTACTTAAGCATGGC限制性核酸内切酶5’---NGAATTCN---3’3’---NCTTAAGN---5’5’---NGAATTCN---3’3’---NCTTAAGN---5’粘末端(Cohensiveendorstickyend）5’突出端EcoR15’---NCAG

CTGN---3’3’---NGTC

GACN---5’5’---NCAGCTGN---3’3’---NGTCGACN---5’平末端Pvu2（bluntend）错位切割垂直切割切割DNA后有粘端与平端之分或产生平末端识别位点常为4-6个170限制性核酸内切酶的切割频率DNA分子中核苷酸序列是随机排列的，一个识别四个核苷酸序列的内切酶平均每隔256bp（44）出现一次该酶的识别切割位点。那么，识别6或8核苷酸序列的内切酶的切割频率是多少？限制性核酸内切酶的切割频率DNA分子中核苷酸序列是随机排列的171基因工程其他常用的工具酶酶的种类功能DNA连接酶催化DNA中相邻的5'磷酸基和3'羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶I①合成双链cDNA的第二条键②缺口平移制作高比活探针③DNA序列分析④填补3'末端反转录酶以RNA为模板合成cDNA第一链多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5'羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3'羟基末端进行同质多聚物加尾切除末端磷酸基团碱性磷酸酶TaqDNA聚合酶PCR扩增基因工程其他常用的工具酶酶的种类功能DNA连接酶催化172第三节基因克隆的载体第三节基因克隆的载体173

载体（vector）是由在细胞中能够自主复制的ＤＮＡ分子构成的一种遗传成分，通过实验手段可使其它ＤＮＡ片段(外源基因)连接在它的上面，进行扩增或表达。载体（vector）是由在细胞中能够自主复17420章基因工程课件175理想载体应具备的几个条件能在宿主细胞内携带目的基因复制扩增，具有较高拷贝数。有多个限制性内切酶单一位点，便于外源基因的插入。有易检测的遗传筛选标记，如抗生素抗性基因，用于阳性克隆的筛选。分子量小，允许插入外源基因的容量较大。理想载体应具备的几个条件能在宿主细胞内携带目的基因复制扩增176载体分类（按功能分）克隆载体：用于外源DNA的克隆和扩增。表达载体：用于外源基因的表达（转录翻译生成蛋白质）载体分类（按功能分）克隆载体：用于外源DNA的克隆和扩增。177一、克隆载体质粒载体噬菌体载体病毒载体一、克隆载体质粒载体178（一）质粒（plasmid）载体质粒是一种独立于染色体外的小分子环状DNA，一般大小约106~108D，可自身复制和表达，有的质粒还带有可做为选择性标记的抗药性基因，所以质粒经过适当改选后便可成为良好的载体。作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的质粒载体。（一）质粒（plasmid）载体179

质粒（plasmid）

是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。大小约为数千碱基对。常有1~3个抗药性基因，以利于筛选。质粒（plasmid）180质粒载体克隆的质粒载体允许外源的DNA插入，储存。主要是DNA水平上的操作。基因表达的质粒载体允许外源DNA的插入、储存和表达。质粒载体克隆的质粒载体181质粒的生物学特性：1、质粒DNA的构型：

SC型共价闭合环形DNA（cccDNA）OC型开环DNA（ocDNA）L型线性DNA（cDNA）

2、不同质粒的分子量大小差异相当显著：

106~108D

3、作为载体的质粒都含有三种共同的组分：

复制基因（replicator）、选择性记号、克隆位点

质粒的生物学特性：182LOCSCLOCSC183质粒DNA的复制类型：低拷贝的质粒（1～十几个）：严紧型复制控制的质粒

高拷贝的质粒（几十~几百个）：松弛型复制控制的质粒

质粒DNA的复制类型：184重要的大肠杆菌质粒载体1、pBR322质粒载体；2、pUC质粒载体；重要的大肠杆菌质粒载体185以Ampr和Tetr为选择性标记，克隆位点在这两个选择性标记的单酶切位点上。（4363bp）ori以Ampr和Tetr为选择性标记，克隆位点在这两个选择性标记186pBR322的结构来源pBR322的结构来源187pBR322质粒载体的特点：1、具有较小的分子量；

它的分子量为4363bp。克隆载体的分子量大小不要超过10kb。2、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。

pBR322DNA分子中总共有24种核酸内切酶只具有单一的酶切识别位点。其中7种内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部，2种识别位点在于这个基因的启动区内，所以9个限制酶切位点插入外源片断可以导致tetr

基因的失活；另外有3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因有单一的识别位点，pBR322质粒载体的特点：188Example:a.在pBR322质粒的BamH或SalⅠ位点插入外源DNA片断，切断了tetr基因编码序列的连续性，使之失去活性，产生出AmprTets表型的重组pBR322质粒，转化入AmpsTets的大肠杆菌细胞。先涂布在含氨苄青霉素的选择培养基上，筛选出具Ampr菌落，再将它们涂布于含四环素的选择性培养基上。插入外源片断的重组质粒不能在这种培养基上生长。Example:189

b.在PstⅠ或ScaⅠ识别位点插入外源片断会导致Ampr基因的失活，产生AmpsTetr表型的质粒。转化大肠杆菌之后，获得的重组子可以比较快的检测出来。其依据是Ampr表型的细胞可以合成β–内酰胺酶，它能使青霉素转变成青霉酮酸，而这种青霉酮酸能与碘结合。在含有可溶性淀粉和四环素的富裕培养基上选择转化子，经37度培养过夜后，在此平板上加入少量的碘指示剂溶液产生青霉素β–内酰胺酶Ampr的菌落，其周围的碘指示剂溶液变得明亮，而Amps菌落无此反应。b.在PstⅠ或ScaⅠ识别位点插入外源片断会导致Ampr190

3、具有较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后每个细胞中可积累1000~3000个拷贝。3、具有较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后每个细胞中可积191pUC质粒载体人们应用多克隆位点技术，在pBR322的基础上，组入了一个在其5’-端带有一段多克隆位点的lacZ’基因，而发展的具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。

pUC质粒载体192

一种典型的pUC系列的质粒载体，包括以下四个部分：

1、来自pBR322质粒的复制起点（ori）；

2、氨苄青霉素抗性基因（ampr）,但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不在含有原来的核酸内切限制酶的但识别位点。

3、大肠杆菌β-半乳糖基因（lacZ）的启动子及编码α-肽链的DNA序列，此结构称之为lacZ’基因；

4、位于lacZ’基因中的靠近5’-端的一段多克隆位点（MCS）区段。但它并不破坏该基因的功能。一种典型的pUC系列的质粒载体，包括以下四个部分：193AmproripUC18(3kb)MCS(Multiplecloningsites, 多克隆位点）LacpromoterlacZ’MCS(Multiplecloningsites,多克隆位点）：指人工合成的含有多种限制性内切酶单一识别切割位点的DNA序列。

AmproripUC18MCS(Multipleclon194乳糖操纵子结构与调控模式图乳糖操纵子结构与调控模式图195pUC质粒载体的优点第一，具有较小的分子量和更高的拷贝数;

仅保留了pBR322的氨苄青霉素抗性基因和复制起点；在操作过程中复制起点内部发生了自发突变造成了基因rop的缺失，它是控制质粒的特殊因子，从而使拷贝数增加，平均每个细胞500~700个拷贝。第二，适用于组织化学检测重组体；具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ’基因，所编码的α-肽链可参与α-互补作用，用X-gal显色对重组子进行鉴定，而pBR322质粒的重组子要进行两步的选择。第三，具有多克隆位点MCS区段．方便具有不同粘性末端的外源片断的插入。pUC质粒载体的优点196穿梭质粒载体（shuttleplasmidvector）是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，因而可在两种不同的寄主细胞存活和复制的质粒载体。穿梭质粒载体197早期发现的大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒载体大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体大肠杆菌-牛乳头瘤病毒迄今还没有发展出适用的大肠杆菌-植物细胞穿梭载体。早期发现的大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒载体19820章基因工程课件199（二）噬菌体载体（Bacteriophage，简称phage）

（二）噬菌体载体20020章基因工程课件201噬菌体的生命周期噬菌体的溶菌生命周期只具有溶菌生长周期的噬菌体颗粒叫烈性噬菌体。烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：1、吸附吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上。2、注入噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞。3、转变被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所。4、合成大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质。5、组装包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒。6、释放合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来。

噬菌体的生命周期20220章基因工程课件203噬菌体的生命周期噬菌体的溶源生命周期是指在感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒，噬菌体的DNA是整合到寄主细胞染色体DNA上，成为它的一个组成部分。

现知道只有双链DNA的噬菌体才具有溶源周期噬菌体的生命周期204温和噬菌体：既能进入溶菌生命周期又能进入溶源生命周期。溶源性细菌：具有一种完整的噬菌体基因组的细菌溶源化：用温和噬菌体感染细菌培养物使之形成溶源性细菌的过程整合：噬菌体的DNA是被包容在寄主细胞染色体DNA中原噬菌体：在溶源细菌内存在的整合的或非整合的噬菌体超感染免疫性：溶源性细菌不能够被头一次感染并使之溶源化的同种噬菌体再感染。温和噬菌体：既能进入溶菌生命周期又能进入溶20520章基因工程课件206λ噬菌体载体λ噬菌体载体207λ噬菌体基因组长48.5kb基因组可为线状和环状两种形式(cosends)溶菌阶段溶源阶段λ噬菌体基因组长48.5kb溶菌阶段溶源阶段208 5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’

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