第二章基因工程载体和工具酶课件

第二章基因工程载体和工具酶湖南师范大学生命科学学院袁婺洲第二章基因工程载体和工具酶湖南师范大学生命科学学院1本章目录2.1载体2.1.1质粒载体2.1.2噬菌体载体2.1.3其他载体2.2工具酶2.2.1限制性核酸内切酶2.2.2DNA聚合酶和Klenow大片段2.2.3DNA连接酶2.2.4碱性磷酸酶2.2.5末端脱氧核苷酸转移酶本章目录2.1载体2第二章基因工程载体和工具酶第一节载体第二章基因工程载体和工具酶第一节载体3载体的功能及特征运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件载体的功能及特征运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复4克隆载体应具备的条件具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）

具有合适的筛选标记具有较高的外源DNA的装载能力具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有与特定受体细胞相适应的复制位点整合位点克隆载体应具备的条件具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移51.质粒plasmid细菌染色体外的遗传因子，闭合环状双链DNA大小：1-200kb能自主复制，但要利用寄主细胞复制染色体的同一组酶系复制分松弛型和严谨型两种

松弛型：10-200拷贝（加氯霉素扩增）严谨型：1-10拷贝有某些基因，如抗药性基因，对寄主的生长是有利的1.质粒plasmid细菌染色体外的遗传因子，闭合环状双6天然质粒天然质粒7第二章基因工程载体和工具酶课件8PcopcopP/OrepreporiCopRep质粒的自主复制性：ColE1、pMB1、pSC101等不同启动子pMB1质粒DNA复制启动控制松弛型质粒启动子的突变质粒的基本特征PcopcopP/OrepreporiCopRep质粒的自主92.质粒的不相容性任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性。质粒的基本特征以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101、F、RP4拥有相似的复制子结构，彼此不相容2.质粒的不相容性任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不103.携带特殊的遗传标记：抗生素标记基因1)氨苄青霉素抗性基因2)四环素抗性基因3)氯霉素抗性基因4)卡那霉素和新霉素抗性基因5）lacZ’基因质粒的基本特征3.携带特殊的遗传标记：抗生素标记基因1)氨苄青霉素抗性基因2)四环素抗性基因3)氯霉素抗性基因4)卡那霉素和新霉素抗性基因5）lacZ’基因3.携带特殊的遗传标记：抗生素标记基因1)氨苄青霉素抗性基11LacZ基因的显色原理：LacZ基因的显色原理：12第二章基因工程载体和工具酶课件13第二章基因工程载体和工具酶课件14第二章基因工程载体和工具酶课件15LacZ基因表达的蓝白斑菌落LacZ基因表达的蓝白斑菌落16基因工程质粒：PlasmidpBR322松驰型质粒Ampr，Tetr多种限制性酶切位点全长4362bp基因工程质粒：PlasmidpBR322松驰型质粒17PlasmidpBR322结构图4363bpPlasmidpBR322结构图4363bp18pBR322质粒结构来源pBR322质粒结构来源19Plasmidplink322在pBR322基础上改建，增加了一个多接头（polylinker），即增加了多克隆位点。全长3.8kbPlasmidplink322在pBR322基础上改建，20Plasmidplink322Plasmidplink32221

pUC质粒(UniversityofCalifornia)

pUC质粒是由大肠杆菌pBR322质粒与M13噬菌体改建而成的双链DNA质粒载体

pUC18/pUC19全长2674bp，有Amp抗性基因，一个复制起点ori。带有lacZ的N端标记序列；因在复制起点ori区域内缺失rop基因（改进的pMB1复制子），细胞即使生长在无氯霉素环境中也可形成高拷贝数（500-700）。宿主菌携带β－半乳糖苷酶C端序列。重组子菌落是白色，空转化子是蓝色。pUC质粒(UniversityofCalifo22PlasmidpUC18/pUC19

结构

PlasmidpUC18/pUC19结构23改建质粒的要求：尽可能使质粒缩小，以便插入更大的外源DNA片段；增加多种酶切位点；增加标记基因；提高外源DNA的表达水平；增加质粒在受体细胞中的拷贝数改建质粒的要求：尽可能使质粒缩小，以便插入更大的外源DNA片24转化子的筛选方法遗传标记筛选（载体与目的基因本身）DNA片段大小检测核酸分子杂交目的基因表达产物检测转化子的筛选方法遗传标记筛选（载体与目的基因本身）25pBR322质粒克隆外源基因的过程

pBR322质粒克隆外源基因的过程26载体遗传标记检测抗药性筛选法ROPROISalIBamHITcrPvuIPstIPstIEcoRIClaIHindIIIHindIIBalIAprpBR3224363bpori将外源DNA片段插在EcoRI位点：非重组子呈Apr、Tcr重组子呈Apr、Tcr将外源DNA片段插在BamHI位点：非重组子呈Apr、Tcr重组子呈Apr、Tcs载体遗传标记检测抗药性筛选法ROPROISalIBamH27载体遗传标记检测显色筛选法pUC18AprlacZ'oriApr

+X-gal重组子（Apr+lacZ-）

将外源基因克隆在pUC18的lacZ’标记基因内部，使之灭活，此时重组子呈Apr、lacZ-，白色菌落；而非重组子则呈Apr、lacZ+，蓝色菌落载体遗传标记检测显色筛选法pUC18AprlacZ'oriA28DNA片段大小检测全酶解图谱法：pUC182.7kbHindIIISphIPstISalIBamHISmaIKpnIEcoRIAprlacZ’oriBBEP4.0kb1.0kb0.8kb用BamHI酶切转化子质粒DNA电泳观察酶解产物片段：重组子：2.7kb+4.0kb非重组子：2.7kbDNA片段大小检测全酶解图谱法：pUC182.7kbHi29DNA片段大小检测全酶解图谱法：pUC182.7kbHindIIISphIPstISalIBamHISmaIKpnIEcoRIAprlacZ’oriBP4.0kb1.0kb0.8kb用EcoRI酶切转化子质粒DNA目的重组子：

3.0kb+3.7kb

或者：

1.0kb+5.7kb用PstI酶切转化子质粒DNA目的重组子：3.2kb+3.5kb或者：0.8kb+5.9kbDNA片段大小检测全酶解图谱法：pUC182.7kbHi30质粒DNA提取的策略质粒DNA的提取细菌细胞破碎----碱使染色体DNA变性-----离心分离------收集质粒DNA-----纯化------保存真核细胞DNA的提取研磨使细胞破碎-----蛋白酶K去核蛋白----分离蛋白质与DNA------纯化-----沉淀------纯度检测质粒DNA提取的策略质粒DNA的提取31质粒DNA的纯化RNA酶去RNASDS-蛋白复合物蛋白酶K去蛋白质酚-氯仿抽提纯化试剂盒紫外分光光度计测A260与A280值：1·8或2·0质粒DNA的纯化RNA酶去RNA32质粒DNA沉淀二倍体积的无水乙醇与DNA相混合。使乙醇的终含量占67%左右。室温静置30分钟。乙醇沉淀时，加NaAcorNaCl至终浓度为0·1-0·25M，是为了中和DNA分子在碱性条件下所带的负电荷，减少DNA分子同性电荷的相斥力。0·6倍体积的异丙醇沉淀，-20°C半小时。质粒DNA沉淀二倍体积的无水乙醇与DNA相混合。使乙醇的终含33DNA分离

琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳氯化铯密度梯度离心DNA分离

琼脂糖凝胶电泳34DNA浓度检测琼脂糖凝胶电泳0.05-0.1µgEB-标准DNA浓度比较:1ng紫外分光光度计测A260:0.1-1ideal,0.05-1.5accepted纯度:分光光度计不但能确定核酸的浓度，还可以通过A260/A280估计核酸纯度。纯DNA其比值为1.8，纯RNA为2.0。如比值高于1.8，说明DNA样品中含RNA，而样品中的酚和蛋白质将会导致比值降低。DNA浓度检测琼脂糖凝胶电泳0.05-0.1µg35EB与DNAEB与DNA36DNA大小测量凝胶上与标准分子量比较λHindIII100bpladder自己的markerDNA大小测量凝胶上与标准分子量比较37在紫外透射仪下看DNA时，DNA亮度与哪些因素有关？DNA浓度DNA大小波长纯度EB量等有关在紫外透射仪下看DNA时，DNA亮度与哪些因素有关？DNA浓38DNA电泳结果分析DNA电泳结果分析392.λ噬菌体λ噬菌体DNA是线性双链DNA分子，48.5kb噬菌体λ粒子，DNA线性双链，带有12bp的粘性末端，称为cos位点。噬菌体感染细菌以后，双链DNA分子通过COS位点成环状Λ基因组三个区域：左侧：包括外壳蛋白基因，20kb

中间区：18kb

右侧：复制及裂解基因，12kbλDNA+外源DNA之和必须在39-53kb之间，所以可插入7-21kb的外源片段

2.λ噬菌体λ噬菌体DNA是线性双链DNA分子，48.405’TCCAGCGGCGGGG3’3’CCCGCCGCTGGA5’COSCOScos头部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重组基因删除与整合基因l-DNAλ噬菌体的基因组结构5’TCCAGCGGCGGGG3’3’CCCGCCGCTG41λ-DNA载体的构建：删除重复的酶切位点野生型的l-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，

不利于重组操作，必须删除至1-2个同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增

加一些单一的酶切位点除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增加酶位点λ-DNA载体的构建：删除重复的酶切位点野生型的l-DNA链42λ-DNA载体的构建：加装选择标记与质粒不同，野生型λ-DNA上缺少合适的选择标记，因此加装选择标记是l-DNA克隆载体构建的重要内容l-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：免疫功能类标记颜色反应类标记λ-DNA载体的构建：加装选择标记与质粒不同，野生型λ-43λ-DNA载体的构建：加装选择标记lacZlacZ基因编码b-半乳糖苷酶，能催化无色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基因插入到lacZ基因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物；而空载体l-DNA则产生蓝色透明斑λ-DNA载体的构建：加装选择标记lacZlacZ基因44(一)插入型载体(一)插入型载体45第二章基因工程载体和工具酶课件46在Charon4载体中克隆外源DNA在Charon4载体中克隆外源DNA473.M13单链噬菌体M13噬菌体的生物学特性：

生物结构M13噬菌体的外型呈丝状M13

噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNA组成

M13

DNA全长6407个核苷酸M13DNA上至少有10个基因2700个外壳蛋白分子M13

噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长

3.M13单链噬菌体M13噬菌体的生物学特性：生物结构M48第二章基因工程载体和工具酶课件49大肠杆菌的M13单链噬菌体DNAM13DNA载体的构建：IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII野生型M13RF-DNAIIIVIIIVIIXVVIIIXVIIIM13mp系列载体lacZ‘polylinker大肠杆菌的M13单链噬菌体DNAM13DNA载体的构建：I50DNA测序片段的扩增DNA测序片段的扩增514.柯斯质粒cosmid1978年由Collins和Hohn改建正常的质粒与噬菌体的cos位点构成有Amp，Tet抗性基因Cos位点可识别噬菌体的外壳蛋白，可被包装4.柯斯质粒cosmid1978年由Collins和Ho52柯斯质粒（cosmid）的结构pHC796400bpTcrlfragmentcosoriAprPstIBamHISalI1.8kb的l-DNA片段+pBR322片段装载范围为31-45kb柯斯质粒（cosmid）的结构pHC796400bpTcr53柯斯质粒载体的特点：能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞

装载量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小范围能像质粒那样在受体细胞中自主复制重组操作简便，筛选容易不能体内包装，不裂解受体细胞柯斯质粒载体的特点：能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转54柯斯质粒的克隆过程柯斯质粒的克隆过程555.人工微小染色体

YAC,yeastartificialchromosomeBAC,bacteriaartificialchromosomePAC,P1artificialchromosomeMAC,mammalcellartificialchromosomeFosmid,F因子改建而来5.人工微小染色体YAC,yeastartificia56酵母人工染色体（YAC）YAC载体应含有下列元件：

酵母染色体的端粒序列

pYAC4CEN4EcoRIURA3TELBamHITELoriAprTRP1ARS1酵母染色体的复制子

酵母染色体的中心粒序列

酵母系统的选择标记大肠杆菌的复制子

大肠杆菌的选择标记YAC载体的装载量为350-400kb酵母人工染色体（YAC）YAC载体应含有下列元件：酵母染色57YAC的构建YAC的构建58酵母人工染色体的应用酵母人工染色体的应用59克隆载体的发展历史：第一代：环状质粒，装载几个到十几个kb片段;第二代：经过改建的病毒，装载能力２０kb左右;第三代：cosmid,装载能力30-40kb;第四代:YAC,装载能力1-2Mb;第五代:新型载体:BAC,PAC,MAC,Fosmid等,装载能力80-200kb克隆载体的发展历史：第一代：环状质粒，装载几个到十几个kb片606.穿梭质粒载体（shuttleplasmidvector）

是一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，因而可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。6.穿梭质粒载体（shuttleplasmidvect61大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体627.表达载体表达载体是将目的基因在人工控制下置于生物宿主中大量生产的载体.表达载体三个系统:1.DNA复制及质粒DNA的筛选:有DNA复制起点ori,及Amp,Tet抗性基因2.目的基因的转录:这一系统包括启动子,抑制物基因和转录终止子.启动子位于目的基因的上游,常用的如Placz等.3.蛋白质的翻译:包括核糖体识别位点SD,翻译起始密码子和终止密码子.7.表达载体表达载体是将目的基因在人工控制下置于生物宿主中63第二章基因工程载体和工具酶课件64

pQE30载体属于PDS质粒家族大肠杆菌T5启动子和转录终止信号表达的蛋白带有一个六聚组氨酸接头pQE30载体65GEX-4T-1原核表达载体：具有可高效诱导表达的tac启动子；采用温和洗脱条件可将融合蛋白从亲和介质中洗脱下来，最大限度减少对蛋白活性的影响；具有专一性的凝血酶识别位点，可从融合产物中得到纯化的目标蛋白

GEX-4T-1原核表达载体：66含有氨苄青霉素抗性的pDNA3.1(-)真核表达质粒吉欧霉素含有氨苄青霉素抗性的pDNA3.1(-)真核表达质粒吉欧霉67第二章基因工程载体和工具酶课件68第二章基因工程载体和工具酶第二节工具酶第二章基因工程载体和工具酶第二节工具酶69用于核酸操作的工具酶限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA聚合酶碱性磷酸酯酶末端转移酶用于核酸操作的工具酶限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA聚合酶701.限制性核酸内切酶识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链主要存在于原核细菌中，细菌的限制与修饰作用，帮助细菌限制外来DNA的入侵1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出

HindII和HindIII

1.限制性核酸内切酶识别双链DNA分子中的特定序列，并切割71限制性核酸内切酶的命名属名种名株名HindIII

EcoRIHaemophilus

influenzae

d嗜血流感杆菌d株同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶EscherichiacoliR限制性核酸内切酶的命名属名72限制性核酸内切酶的种类1986年,615

种限制酶,98种甲基化酶；

1998年,10000种细菌或古细菌中存在3000种酶;2005年1月，共发现4342种限制酶和甲基化酶，其中限制酶有3681

种，商业化的限制酶有588

种，在Ⅱ型限制酶中共有221种特异性。限制性核酸内切酶的种类1986年,615种限制酶,973限制性核酸内切酶的分类主要特性I型II型III型限制修饰多功能单功能双功能蛋白结构异源三聚体同源二聚体异源二聚体辅助因子ATPMg2+SAMATPMg2+SAMMg2+识别序列TGAN8TGCT回文对称序列GAGCCAACN6GTGCCAGCAG切割位点距识别序列1kb处识别序列内或附近距识别序列下游随机性切割特异性切割24-26bp处限制性核酸内切酶的分类主要特性74II型限制性核酸内切酶的基本特性①识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列②大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧③识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构5‘…GCT

GAATTC

GAG…3’3‘…CGA

CTTAAG

CTC…5’EcoRI的识别序列EcoRI的切割位点II型限制性核酸内切酶的基本特性①识别双链DNA分子中475第二章基因工程载体和工具酶课件76EcoRI等产生的5‘粘性末端5‘…

G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…

C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃5‘…

G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…

C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C

…5’

退火4-7℃5‘…

G-C-T-G

A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…

C-G-A-C-T-T-A-A

G-C-T-C…5’OHPOHPEcoRI等产生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-A-77PstI等产生的3‘粘性末端5‘…

G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…

C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C

…5’PstI37℃5‘…

G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…

C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’

退火4-7℃5‘…

G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G

…3’3‘…

C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHOHPPPstI等产生的3‘粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G78PvuII等产生的平头末端5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…

C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvuII37℃5‘…

G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’3‘…

C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’

PvuII等产生的平头末端5‘…G-C-T-C-A-G-79限制性核酸内切酶酶切位点出现频率44＝25646＝4096限制性核酸内切酶酶切位点出现频率44＝25646＝409680同裂酶（同切点酶）：来源不同，识别顺序相同或相近，切割序列相同，产生相同或不同的粘性末端。或者说：不同来源的限制酶可以切割相同的序列。

Sau3AI:5’-GATC-3’3’-CTAG-5’BamHI:5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’同裂酶（同切点酶）：81同尾酶：来源各异，识别靶序列各不相同，但产生相同的粘性末端。

BglII:5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’BamHI:5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’同尾酶：82影响限制性核酸内切酶活性的因素DNA的纯度(蛋白质、酚、氯仿、EDTA、SDS、高浓度的盐离子等)DNA的甲基化程度酶切消化反应的温度DNA的分子结构限制性核酸内切酶的缓冲液影响限制性核酸内切酶活性的因素DNA的纯度(蛋白质、酚、氯仿83影响限制性核酸内切酶活性的因素1.DNA样品的纯度：蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等加大酶的用量，1mgDNA用10U酶加大反应总体积延长反应时间影响限制性核酸内切酶活性的因素1.DNA样品的纯度：蛋白质、842.缓冲液Tris-HCl50mMpH7.5MgCl210mMNaCl0-150mMDTT1mM0-50mM低盐酶100mM中盐酶150mM高盐酶Volume20-100mlTT37℃1-1.5hr影响限制性核酸内切酶活性的因素:1U核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应1小时，完全水解1mg标准DNA所需的酶量2.缓冲液Tris-HCl50mMpH7.5MgC85第二章基因工程载体和工具酶课件86第二章基因工程载体和工具酶课件87II型核酸内切酶的多酶联合酶解对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切II型核酸内切酶的多酶联合酶解对盐浓度要求不同的酶，可采取882、DNA连接酶作用：负责双链DNA中相邻3`-OH与5`-磷酸基团之间的磷酸二酯键的形成。只能连接切口（nickornike）不能连接缺口（gap）2、DNA连接酶作用：负责双链DNA中相邻3`-OH与5`-89平头双链DNA片段的连接操作粘性末端的连接属于分子内部的连接平头末端的连接则属于分子间的连接提高平头末端连接效率的方法包括：加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）

加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会

平头双链DNA片段的连接操作粘性末端的连接属于分子内部的连接90平头末端人工粘性末端的连接C3'

GG5'

G3'C5'C3'GT4-DNA连接酶TdTTdTdTTPdATPGTTTTTTTTTT3'C退火C3'

TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAA

3'

GG3'

AAAAAAAAAAC5'

5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGC3'

5'

5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTG平头末端人工粘性末端的连接C3'GG5'G3'C91同种内切酶生产的粘性末端的连接5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5'GCTTAAAATTCG5'

5'

GCTTAA

5'5'

AATTCG5'

退火GCTTAAAATTCG5'

GCTTAA

5'

AATTCGGCTTAAAATTCG5'

GCTTAA

5'

AATTCGT4-DNAligaseGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAG同种内切酶生产的粘性末端的连接5'5'GAATTCCTTA92同尾酶生产的粘性末端的连接BamHI5'

5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'

5'

TACTAG

5'5'

GATCAT5'

退火GCCTAGGATCCG5'

TACTAG

5'

GATCATT4-DNAligaseTGATCCACTAGG5'

5'GGATCACCTAGT5'

TGATCAACTAGT5'

BclIIGCCTAGGATCCG5'

TACTAG

5'

GATCATTGATCCACTAGG5'

5'GGATCACCTAGT同尾酶生产的粘性末端的连接BamHI5'5'GGATCCC93不同粘性末端的连接BamHI5'

5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'

5'

CTGCAG5'

GACGTC3'

T4-DNAligaseCGATCCGCTAGG5'

5'GGATCGCCTAGC5'

CTGCAGGACGTC5'

PstI3'

T4-DNApol切平5'

CG5'

GCKlenow补平5'GGATCCCTAGGATCC5'

CTAGGCGATCCGCTAGG5'

5'GGATCGCCTAGC不同粘性末端的连接BamHI5'5'GGATCCCCTAG94DNA连接酶的反应条件：Tris-HCl50-100mMpH7.5MgCl210mMATP0.5-1mMDTT5mMVolume10-20mlTT4-15℃4-16hr1UDNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15℃反应1小时，完全连接1mgl-DNA（HindIII片段）所需的酶量DNA连接酶的反应条件：Tris-HCl50-100m95重组率重组率的定义重组率=含有外源DNA的重组分子数/载体分子总数在常规实验条件下，重组率一般为25-75%

提高重组率的方法：①提高外源DNA片段与载体的分子比：5:1-10:1②载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团③平头末端增加同聚物尾巴重组率重组率的定义重组率=含有外源DNA的重组分子数96转化率转化率的定义

转化率是每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体DNA转化后，受体细胞接纳DNA的个数，即克隆数转化率转化率的定义转化率是每微克载体DNA在最佳转化97转化率的计算例如，pUC18对大肠杆菌的转化率为108，即每微克pUC18中只有108个分子能进入受体细胞。一微克pUC18共有3.4X1011个分子（6.02X1017/2686X660），也就是说，每3400个pUC18分子才有一个分子进入受体细胞。

另一方面，在实际操作过程中，转化一微克pUC18共需2ml感受态细胞，大约含有2X1010个大肠杆菌细胞，也就是说，每200个细胞只有一个细胞能接纳pUC18DNA转化率的计算例如，pUC18对大肠杆菌的转化率为108，即每98转化率的影响因素（1）载体及DNA重组分子方面：

载体本身的性质与插入片段的大小（2）受体细胞方面：

受体细胞必须与载体相匹配，例如：pBR322转化大肠杆菌JM83株，转化率很低；但对大肠杆菌ED8767株的转化率则较高转化率的影响因素（1）载体及DNA重组分子方面：载体本身99转化率的影响因素（3）转化方法方面：

Ca2+诱导转化106-107/mg

DNA

l-DNA转染107-108/mgDNA

电穿孔转化106-109/mgDNA

转化率的影响因素（3）转化方法方面：Ca2+诱导转化1003.大肠杆菌DNA聚合酶I5‘→3‘的DNA聚合酶活性5‘→3‘的核酸外切酶活性3‘→5‘的核酸外切酶活性大肠杆菌DNA聚合酶I的基本性质：3‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’5‘…C-G-A-G-T-OH5‘pppdNMg2+3‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’5‘…

C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OHDNApolI3.大肠杆菌DNA聚合酶I5‘→3‘的DNA聚合酶活性5‘101缺口前移标记法大肠杆菌DNA聚合酶I的基本用途：5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘

Mg2+5‘dNTP5‘pppdA（a-32P-dATP）5‘…G-C-T-CA-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’制备32P标记的探针DNaseIDNApolI3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘缺口前移标记法大肠杆菌DNA聚合酶I的基本用途：5‘…102大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）Klenow酶的基本性质：大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端三分之二的大肽段，即为Klenow酶Klenow酶仍拥有5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性，但失去了5‘→3‘的核酸外切酶活性大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）Klen103大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）Klenow酶的基本用途：补平由核酸内切酶产生的5‘粘性末端DNA片段的同位素末端标记cDNA第二链的合成双脱氧末端终止法测定DNA序列大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）Klen1044.反转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶反转录酶的基本特性：以RNA为模板聚合cDNA链3’AAAAAAAAAAAA5’mRNA反转录酶Mg2+dNTP5’TTTTTTTTTTTToligo(dT)12-183’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTTTT3’cDNA4.反转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶反转录酶的基本特性：105反转录酶的基本特性：双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链反转录酶3’RNA5’

DNA3’5’3’RNA5’

DNA3’5’反转录酶5’

DNA3’反转录酶的基本特性：反转录酶3’RNA5’DNA3’1065.碱性磷酸酯酶来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（CIP）来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（BAP）5‘pOH3‘

DNAorRNA5‘pppdN5‘pppNBAP/CIPOH3‘

5‘HO5‘HOdN5‘HON从DNA或RNA的三磷酸核苷酸上除去5`磷酸根残基5.碱性磷酸酯酶来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（CIP）来107碱性磷酸酯酶从DNA或RNA的三磷酸核苷酸上除去5`磷酸根残基用于5`端标记32P用于防止载体的粘性末端的自连碱性磷酸酯酶从DNA或RNA的三磷酸核苷酸上除去5`磷酸根残108防止载体的粘性末端的自连防止载体的粘性末端的自连109T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）5‘HO3‘HOOH3‘OH5‘T4-PNPMg2+

pppATP（g-32P-ATP）5‘p3‘HOOH3‘p5‘用于探针的末端同位素标记：T4-PNP的基本特性：在DNA、RNA的5‘-OH上加上磷酸基团T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）5‘HO3‘HOO1106.末端转移酶（TdT）TdT的基本特性：不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs5‘p3‘HOOH3‘

p5‘

TdTMg2+

dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAA

OH3‘p5‘

6.末端转移酶（TdT）TdT的基本特性：不需要模板的D111用于人工接头探针标记末端转移酶的用途用于人工接头末端转移酶的用途1127.单链核酸内切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本反应：内切单链DNA或RNA5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-C-T-T-G-A-G-G-A-G-T…3’S1Zn2+5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-CT-T-G-A-G-G-A-G-T…3’5‘…G-C-T-CA-G-C-T-CT-T-G-A-GG-A-G-T…3’5‘dNMPs或5‘NMPs7.单链核酸内切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本反应：内切单链113S1的用途：合成CDNA时切除单链环S1的用途：合成CDNA时切除单链环114S1核酸酶的重要用途：在DNA上定位RNA（S1mapping）DNAmRNA杂交S1EcoRIS1核酸酶的重要用途：在DNA上定位RNA（S1mappi115第二章基因工程载体和工具酶湖南师范大学生命科学学院袁婺洲第二章基因工程载体和工具酶湖南师范大学生命科学学院116本章目录2.1载体2.1.1质粒载体2.1.2噬菌体载体2.1.3其他载体2.2工具酶2.2.1限制性核酸内切酶2.2.2DNA聚合酶和Klenow大片段2.2.3DNA连接酶2.2.4碱性磷酸酶2.2.5末端脱氧核苷酸转移酶本章目录2.1载体117第二章基因工程载体和工具酶第一节载体第二章基因工程载体和工具酶第一节载体118载体的功能及特征运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件载体的功能及特征运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复119克隆载体应具备的条件具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）

具有合适的筛选标记具有较高的外源DNA的装载能力具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有与特定受体细胞相适应的复制位点整合位点克隆载体应具备的条件具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移1201.质粒plasmid细菌染色体外的遗传因子，闭合环状双链DNA大小：1-200kb能自主复制，但要利用寄主细胞复制染色体的同一组酶系复制分松弛型和严谨型两种

松弛型：10-200拷贝（加氯霉素扩增）严谨型：1-10拷贝有某些基因，如抗药性基因，对寄主的生长是有利的1.质粒plasmid细菌染色体外的遗传因子，闭合环状双121天然质粒天然质粒122第二章基因工程载体和工具酶课件123PcopcopP/OrepreporiCopRep质粒的自主复制性：ColE1、pMB1、pSC101等不同启动子pMB1质粒DNA复制启动控制松弛型质粒启动子的突变质粒的基本特征PcopcopP/OrepreporiCopRep质粒的自主1242.质粒的不相容性任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性。质粒的基本特征以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101、F、RP4拥有相似的复制子结构，彼此不相容2.质粒的不相容性任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不1253.携带特殊的遗传标记：抗生素标记基因1)氨苄青霉素抗性基因2)四环素抗性基因3)氯霉素抗性基因4)卡那霉素和新霉素抗性基因5）lacZ’基因质粒的基本特征3.携带特殊的遗传标记：抗生素标记基因1)氨苄青霉素抗性基因2)四环素抗性基因3)氯霉素抗性基因4)卡那霉素和新霉素抗性基因5）lacZ’基因3.携带特殊的遗传标记：抗生素标记基因1)氨苄青霉素抗性基126LacZ基因的显色原理：LacZ基因的显色原理：127第二章基因工程载体和工具酶课件128第二章基因工程载体和工具酶课件129第二章基因工程载体和工具酶课件130LacZ基因表达的蓝白斑菌落LacZ基因表达的蓝白斑菌落131基因工程质粒：PlasmidpBR322松驰型质粒Ampr，Tetr多种限制性酶切位点全长4362bp基因工程质粒：PlasmidpBR322松驰型质粒132PlasmidpBR322结构图4363bpPlasmidpBR322结构图4363bp133pBR322质粒结构来源pBR322质粒结构来源134Plasmidplink322在pBR322基础上改建，增加了一个多接头（polylinker），即增加了多克隆位点。全长3.8kbPlasmidplink322在pBR322基础上改建，135Plasmidplink322Plasmidplink322136

pUC质粒(UniversityofCalifornia)

pUC质粒是由大肠杆菌pBR322质粒与M13噬菌体改建而成的双链DNA质粒载体

pUC18/pUC19全长2674bp，有Amp抗性基因，一个复制起点ori。带有lacZ的N端标记序列；因在复制起点ori区域内缺失rop基因（改进的pMB1复制子），细胞即使生长在无氯霉素环境中也可形成高拷贝数（500-700）。宿主菌携带β－半乳糖苷酶C端序列。重组子菌落是白色，空转化子是蓝色。pUC质粒(UniversityofCalifo137PlasmidpUC18/pUC19

结构

PlasmidpUC18/pUC19结构138改建质粒的要求：尽可能使质粒缩小，以便插入更大的外源DNA片段；增加多种酶切位点；增加标记基因；提高外源DNA的表达水平；增加质粒在受体细胞中的拷贝数改建质粒的要求：尽可能使质粒缩小，以便插入更大的外源DNA片139转化子的筛选方法遗传标记筛选（载体与目的基因本身）DNA片段大小检测核酸分子杂交目的基因表达产物检测转化子的筛选方法遗传标记筛选（载体与目的基因本身）140pBR322质粒克隆外源基因的过程

pBR322质粒克隆外源基因的过程141载体遗传标记检测抗药性筛选法ROPROISalIBamHITcrPvuIPstIPstIEcoRIClaIHindIIIHindIIBalIAprpBR3224363bpori将外源DNA片段插在EcoRI位点：非重组子呈Apr、Tcr重组子呈Apr、Tcr将外源DNA片段插在BamHI位点：非重组子呈Apr、Tcr重组子呈Apr、Tcs载体遗传标记检测抗药性筛选法ROPROISalIBamH142载体遗传标记检测显色筛选法pUC18AprlacZ'oriApr

+X-gal重组子（Apr+lacZ-）

将外源基因克隆在pUC18的lacZ’标记基因内部，使之灭活，此时重组子呈Apr、lacZ-，白色菌落；而非重组子则呈Apr、lacZ+，蓝色菌落载体遗传标记检测显色筛选法pUC18AprlacZ'oriA143DNA片段大小检测全酶解图谱法：pUC182.7kbHindIIISphIPstISalIBamHISmaIKpnIEcoRIAprlacZ’oriBBEP4.0kb1.0kb0.8kb用BamHI酶切转化子质粒DNA电泳观察酶解产物片段：重组子：2.7kb+4.0kb非重组子：2.7kbDNA片段大小检测全酶解图谱法：pUC182.7kbHi144DNA片段大小检测全酶解图谱法：pUC182.7kbHindIIISphIPstISalIBamHISmaIKpnIEcoRIAprlacZ’oriBP4.0kb1.0kb0.8kb用EcoRI酶切转化子质粒DNA目的重组子：

3.0kb+3.7kb

或者：

1.0kb+5.7kb用PstI酶切转化子质粒DNA目的重组子：3.2kb+3.5kb或者：0.8kb+5.9kbDNA片段大小检测全酶解图谱法：pUC182.7kbHi145质粒DNA提取的策略质粒DNA的提取细菌细胞破碎----碱使染色体DNA变性-----离心分离------收集质粒DNA-----纯化------保存真核细胞DNA的提取研磨使细胞破碎-----蛋白酶K去核蛋白----分离蛋白质与DNA------纯化-----沉淀------纯度检测质粒DNA提取的策略质粒DNA的提取146质粒DNA的纯化RNA酶去RNASDS-蛋白复合物蛋白酶K去蛋白质酚-氯仿抽提纯化试剂盒紫外分光光度计测A260与A280值：1·8或2·0质粒DNA的纯化RNA酶去RNA147质粒DNA沉淀二倍体积的无水乙醇与DNA相混合。使乙醇的终含量占67%左右。室温静置30分钟。乙醇沉淀时，加NaAcorNaCl至终浓度为0·1-0·25M，是为了中和DNA分子在碱性条件下所带的负电荷，减少DNA分子同性电荷的相斥力。0·6倍体积的异丙醇沉淀，-20°C半小时。质粒DNA沉淀二倍体积的无水乙醇与DNA相混合。使乙醇的终含148DNA分离

琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳氯化铯密度梯度离心DNA分离

琼脂糖凝胶电泳149DNA浓度检测琼脂糖凝胶电泳0.05-0.1µgEB-标准DNA浓度比较:1ng紫外分光光度计测A260:0.1-1ideal,0.05-1.5accepted纯度:分光光度计不但能确定核酸的浓度，还可以通过A260/A280估计核酸纯度。纯DNA其比值为1.8，纯RNA为2.0。如比值高于1.8，说明DNA样品中含RNA，而样品中的酚和蛋白质将会导致比值降低。DNA浓度检测琼脂糖凝胶电泳0.05-0.1µg150EB与DNAEB与DNA151DNA大小测量凝胶上与标准分子量比较λHindIII100bpladder自己的markerDNA大小测量凝胶上与标准分子量比较152在紫外透射仪下看DNA时，DNA亮度与哪些因素有关？DNA浓度DNA大小波长纯度EB量等有关在紫外透射仪下看DNA时，DNA亮度与哪些因素有关？DNA浓153DNA电泳结果分析DNA电泳结果分析1542.λ噬菌体λ噬菌体DNA是线性双链DNA分子，48.5kb噬菌体λ粒子，DNA线性双链，带有12bp的粘性末端，称为cos位点。噬菌体感染细菌以后，双链DNA分子通过COS位点成环状Λ基因组三个区域：左侧：包括外壳蛋白基因，20kb

中间区：18kb

右侧：复制及裂解基因，12kbλDNA+外源DNA之和必须在39-53kb之间，所以可插入7-21kb的外源片段

2.λ噬菌体λ噬菌体DNA是线性双链DNA分子，48.1555’TCCAGCGGCGGGG3’3’CCCGCCGCTGGA5’COSCOScos头部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重组基因删除与整合基因l-DNAλ噬菌体的基因组结构5’TCCAGCGGCGGGG3’3’CCCGCCGCTG156λ-DNA载体的构建：删除重复的酶切位点野生型的l-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，

不利于重组操作，必须删除至1-2个同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增

加一些单一的酶切位点除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增加酶位点λ-DNA载体的构建：删除重复的酶切位点野生型的l-DNA链157λ-DNA载体的构建：加装选择标记与质粒不同，野生型λ-DNA上缺少合适的选择标记，因此加装选择标记是l-DNA克隆载体构建的重要内容l-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：免疫功能类标记颜色反应类标记λ-DNA载体的构建：加装选择标记与质粒不同，野生型λ-158λ-DNA载体的构建：加装选择标记lacZlacZ基因编码b-半乳糖苷酶，能催化无色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基因插入到lacZ基因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物；而空载体l-DNA则产生蓝色透明斑λ-DNA载体的构建：加装选择标记lacZlacZ基因159(一)插入型载体(一)插入型载体160第二章基因工程载体和工具酶课件161在Charon4载体中克隆外源DNA在Charon4载体中克隆外源DNA1623.M13单链噬菌体M13噬菌体的生物学特性：

生物结构M13噬菌体的外型呈丝状M13

噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNA组成

M13

DNA全长6407个核苷酸M13DNA上至少有10个基因2700个外壳蛋白分子M13

噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长

3.M13单链噬菌体M13噬菌体的生物学特性：生物结构M163第二章基因工程载体和工具酶课件164大肠杆菌的M13单链噬菌体DNAM13DNA载体的构建：IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII野生型M13RF-DNAIIIVIIIVIIXVVIIIXVIIIM13mp系列载体lacZ‘polylinker大肠杆菌的M13单链噬菌体DNAM13DNA载体的构建：I165DNA测序片段的扩增DNA测序片段的扩增1664.柯斯质粒cosmid1978年由Collins和Hohn改建正常的质粒与噬菌体的cos位点构成有Amp，Tet抗性基因Cos位点可识别噬菌体的外壳蛋白，可被包装4.柯斯质粒cosmid1978年由Collins和Ho167柯斯质粒（cosmid）的结构pHC796400bpTcrlfragmentcosoriAprPstIBamHISalI1.8kb的l-DNA片段+pBR322片段装载范围为31-45kb柯斯质粒（cosmid）的结构pHC796400bpTcr168柯斯质粒载体的特点：能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞

装载量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小范围能像质粒那样在受体细胞中自主复制重组操作简便，筛选容易不能体内包装，不裂解受体细胞柯斯质粒载体的特点：能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转169柯斯质粒的克隆过程柯斯质粒的克隆过程1705.人工微小染色体

YAC,yeastartificialchromosomeBAC,bacteriaartificialchromosomePAC,P1artificialchromosomeMAC,mammalcellartificialchromosomeFosmid,F因子改建而来5.人工微小染色体YAC,yeastartificia171酵母人工染色体（YAC）YAC载体应含有下列元件：

酵母染色体的端粒序列

pYAC4CEN4EcoRIURA3TELBamHITELoriAprTRP1ARS1酵母染色体的复制子

酵母染色体的中心粒序列

酵母系统的选择标记大肠杆菌的复制子

大肠杆菌的选择标记YAC载体的装载量为350-400kb酵母人工染色体（YAC）YAC载体应含有下列元件：酵母染色172YAC的构建YAC的构建173酵母人工染色体的应用酵母人工染色体的应用174克隆载体的发展历史：第一代：环状质粒，装载几个到十几个kb片段;第二代：经过改建的病毒，装载能力２０kb左右;第三代：cosmid,装载能力30-40kb;第四代:YAC,装载能力1-2Mb;第五代:新型载体:BAC,PAC,MAC,Fosmid等,装载能力80-200kb克隆载体的发展历史：第一代：环状质粒，装载几个到十几个kb片1756.穿梭质粒载体（shuttleplasmidvector）

是一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，因而可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。6.穿梭质粒载体（shuttleplasmidvect176大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体1777.表达载体表达载体是将目的基因在人工控制下置于生物宿主中大量生产的载体.表达载体三个系统:1.DNA复制及质粒DNA的筛选:有DNA复制起点ori,及Amp,Tet抗性基因2.目的基因的转录:这一系统包括启动子,抑制物基因和转录终止子.启动子位于目的基因的上游,常用的如Placz等.3.蛋白质的翻译:包括核糖体识别位点SD,翻译起始密码子和终止密码子.7.表达载体表达载体是将目的基因在人工控制下置于生物宿主中178第二章基因工程载体和工具酶课件179

pQE30载体属于PDS质粒家族大肠杆菌T5启动子和转录终止信号表达的蛋白带有一个六聚组氨酸接头pQE30载体180GEX-4T-1原核表达载体：具有可高效诱导表达的tac启动子；采用温和洗脱条件可将融合蛋白从亲和介质中洗脱下来，最大限度减少对蛋白活性的影响；具有专一性的凝血酶识别位点，可从融合产物中得到纯化的目标蛋白

GEX-4T-1原核表达载体：181含有氨苄青霉素抗性的pDNA3.1(-)真核表达质粒吉欧霉素含有氨苄青霉素抗性的pDNA3.1(-)真核表达质粒吉欧霉182第二章基因工程载体和工具酶课件183第二章基因工程载体和工具酶第二节工具酶第二章基因工程载体和工具酶第二节工具酶184用于核酸操作的工具酶限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA聚合酶碱性磷酸酯酶末端转移酶用于核酸操作的工具酶限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA聚合酶1851.限制性核酸内切酶识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链主要存在于原核细菌中，细菌的限制与修饰作用，帮助细菌限制外来DNA的入侵1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出

HindII和HindIII

1.限制性核酸内切酶识别双链DNA分子中的特定序列，并切割186限制性核酸内切酶的命名属名种名株名HindIII

EcoRIHaemophilus

influenzae

d嗜血流感杆菌d株同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶EscherichiacoliR限制性核酸内切酶的命名属名187限制性核酸内切酶的种类1986年,615

种限制酶,98种甲基化酶；

1998年,10000种细菌或古细菌中存在3000种酶;2005年1月，共发现4342种限制酶和甲基化酶，其中限制酶有3681

种，商业化的限制酶有588

种，在Ⅱ型限制酶中共有221种特异性。限制性核酸内切酶的种类1986年,615种限制酶,9188限制性核酸内切酶的分类主要特性I型II型III型限制修饰多功能单功能双功能蛋白结构异源三聚体同源二聚体异源二聚体辅助因子ATPMg2+SAMATPMg2+SAMMg2+识别序列TGAN8TGCT回文对称序列GAGCCAACN6GTGCCAGCAG切割位点距识别序列1kb处识别序列内或附近距识别序列下游随机性切割特异性切割24-26bp处限制性核酸内切酶的分类主要特性189II型限制性核酸内切酶的基本特性①识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列②大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧③识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构5‘…GCT

GAATTC

GAG…3’3‘…CGA

CTTAAG

CTC…5’EcoRI的识别序列EcoRI的切割位点II型限制性核酸内切酶的基本特性①识别双链DNA分子中4190第二章基因工程载体和工具酶课件191EcoRI等产生的5‘粘性末端5‘…

G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…

C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃5‘…

G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…

C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C

…5’

退火4-7℃5‘…

G-C-T-G

A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…

C-G-A-C-T-T-A-A

G-C-T-C…5’OHPOHPEcoRI等产生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-A-192PstI等产生的3‘粘性末端5‘…

G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…

C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C

…5’PstI37℃5‘…

G-C-T-C-T-G-C-A-OH