FISH痰脱落细胞检查诊断肺癌的价值

FISH痰脱落细胞检查诊断肺癌的价值

摘要：目的探讨荧光原位杂交技术(FISH)痰脱落细胞检测诊断肺癌的价值。

方法分别采用FISH、常规痰脱落细胞学检查(常规方法)检测60例疑似肺癌患者3、7、17染色体和9号染色体p16位点异常，以病理诊断为金标准，分析FISH、常规方法及二者联合检测诊断肺癌的敏感度和特异度。

结果病理诊断为肺癌43例，肺良性病变17例。FISH与常规方法诊断肺癌的敏感性分别为65.1％、32.5％，P=0.003；特异性分别为76.5％、100％，P=l；常规方法+FISH联合检测的敏感性与特异性分别为72.1％、100％，与常规方法相比，P分别=0、l。FISH与常规方法检测对TNM分期为I~Ⅱ期的敏感性分别为55.6％、22.2％，P=0.040；Ⅲ~IV期的敏感性分别为72％、40％，P=0.025；常规方法+FISH联合对TNM分期为I~Ⅱ期、Ⅲ~Ⅳ期的敏感性分别为66.7％、76％，与常规方法相比，P分别=0.007、0.010。FISH、常规方法及二者联合检测对肺癌分期的诊断特异性无统计学差异。

结论

FISH诊断肺癌的敏感性明显高于常规方法，与常规方法联合检测可显著提高痰液标本诊断肺癌的准确性。

胸片、CT及痰细胞学检查为目前肺癌早期的主要筛查手段，但特异性及敏感性均较低，早期漏诊率高；而大部分肺癌患者就诊时病情已发展到晚期，病死率高。荧光原位杂交(Fluorescenceinsituhybridization，FISH)是近年发展起来的一项新技术，其可迅速检测出中期分裂相／间期核细胞中染色体数目等异常变化，为肺癌的遗传学研究提供了新方法。本文就采用双色FISH技术检测了60例初诊疑似肺癌患者痰液中脱落细胞3、7、17染色体和9号染色体P16位点异常情况，并以组织病理确诊为肺癌金标准，探讨FISH技术在肺癌诊断中的应用价值。1.资料与方法1.1临床资料

60例初诊疑似肺癌患者，男42例，女18例；年龄46—76岁，中位年龄63岁。长期吸烟35例，有慢性咳嗽咳痰病史47例。经病理或细胞学检查诊断证实为肺癌43例(肺癌组)，其中鳞癌26例、小细胞肺癌6例、腺癌11例；TNM分期I一Ⅱ期(早期)18例，Ⅲ～Ⅳ期(晚期)25例。肺良性病变17例(良性组)，其中结核10例，肺炎7例。另选取同期20例体检健康者为对照组，年龄4l一80岁，中位年龄61岁。1.2痰脱落细胞检查收集三组新鲜痰液标本(取清晨漱口后深部第2、3口痰，连续3d，留置于无菌瓶中)，每例收集约20mL，分为两等分各10mL，分别用于FISH检测和常规痰脱落细胞学检查(常规方法)。1.2.1FISH检测

标本处理

1)将10ml痰液放入5~10ml消化液中，摇匀，静置，去上清，离心，留取细胞沉淀

2)加入预热的胶原酶B，吹打，水浴，离心，去上清，再加入预热的0.075mol\L的KCL低渗液

3)放入37℃水浴箱低渗30分钟

4)取出后加入新鲜固定液5ml，混匀，静置，离心，去上清

5)缓慢加入5ml固定液，静置10分钟后离心

6)去除上清液加固定液离心（重复2~3次直到细胞成分洗干净为止）玻片制备

1)滴制备好的细胞样本到载玻片上（用显微镜观察细胞分布情况）

2)（胃蛋白酶工作液）在2×SSC（pH7.0）液中浸泡2分钟

3)依次在70%、85%、100%的乙醇中浸泡2分钟，脱水1.2.2对照组痰脱落细胞染色体数目畸变的阈值(畸变率)

对采集的20例正常人痰液每组探针组合分析100个细胞。统计出现不同异常情况的百分比，阈值=平均数(M)+3×标准差(sD)，3、7、17号染色体探针各需要建立2个阈值(1个点、≥3个点)，9p16探针需要建立3个阈值(0、1、≥3个点)。任意≥2个位点出现异常(3号和17号染色体出现非整倍增加)可判断为阳性；一个位点有≥2种异常(9p16有0信号点异常和3信号点异常)也可判断为阳性。

若只有一个位点出现一种异常，扩大计数细胞后再重新判断。统计信号种类及与之相对应细胞数目百分比并录入图像分析仪。在镜下观察杂交效果，以细胞杂交率>80％为有效标本。细胞核膜须完整，在细胞核内可见清晰明亮的橘红色或黄绿色荧光信号，如出现2个或3个荧光点，两个位点之间距离大于单个信号的直径以上，且荧光强度相近，计为含有2条或3条染色体。如果两个信号之间的距离<1个信号的直径则计数为1条染色体。

正常表现：3(红),7(绿)染色体着丝粒正常表现：P16(红)位点,17染色体着丝粒(绿)异常表现：出现染色体非整倍体异常表现：P16(红)缺失，出现染色体非整倍体疑似肺癌患者染色体畸变

20例正常人痰脱落细胞染色体数目畸变的阈值(畸变率)为标准，判定疑似肺癌患者染色体畸变数。每组探针均组合分析100个细胞，计算异常率，判断阳性个数。2结果

20例正常人痰脱落细胞染色体数目畸变的阈值(畸变率)见表1。2.2诊断价值

FISH与常规方法诊断的敏感性分别为65.1％(28/43)、32.5％(14/43)，P=0.003；特异性分别为76.5％(13/17)、100％(17/17)，P=1；联合检测的敏感性与特异性分别为72.1％(31/43)、100％(17/17)，与常规方法比较，P分别=0、1。FISH、常规方法判断TNM分期为I～Ⅱ期的敏感性分别为55.6％(10/18)、22.2％(4/18)，P=0.040；Ⅲ～Ⅳ期敏感性分别为72％(18/25)、40％(10/25)，P=0.025；联合检测判断I～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期的敏感性分别为66.7％(12/18)、76％(19/25)，与常规方法比较，P分别=0.007、0.010；三种方法判断不同分期患者的特异性无统计学差异。3讨论

FISH是一种细胞遗传学与分子生物学相结合的新技术，其采用荧光素直接标记遗传物质DNA制备探针，与染色体或实体肿瘤及脱落细胞间期核进行杂交，通过荧光显微镜观察肿瘤细胞内有无染色体数目和结构的改变；可直接用于检测肺癌患者脱落细胞间期核染色体变化。已有相关文献报道，利用支气管镜检刷取标本进行FISH检测可明显提高早期肺癌检出的敏感性，但支气管镜具有一定创伤性。用FISH技术对痰标本进行肺癌高危人群筛查，对肺癌的发生进行早期干预是目前研究的热点。近年来国内外关于FISH检测痰脱落细胞诊断肺癌的报道较少，且结论差异较大。

本研究FISH结果显示，3，7，17号染色体和9号染色体p16在肺癌组与良性组均发生一定数目的畸变，说明染色体畸变在肺癌发生、发展过程中起重要作用。本研究结果显示，FISH联合常规方法检测诊断肺癌的敏感性为72.1％，明显高于常规方法，但特异性无统计学差异。有关报道，通过支气管镜检查疑似肺癌患者得到刷检样本，FISH及联合方法诊断肺癌的敏