果胶物质的测定

果胶物质的测定果胶物质（PecticSubstances）是一种植物胶，可作为食品生产中的胶冻材料和增稠剂。果胶在医药上可以作为治疗胃肠道及胃溃疡等疾病的良好药剂。果胶，特别是低甲氧基果胶，因为它能与铅、汞等有害金属形成人体不能吸收的不溶解物，因而可用作金属中毒的一种良好解毒剂和预防剂。可见，果胶的生产和应用，将会得到很快的发展。关于果胶物质的构造尚未完全清楚。它是一群复杂的胶态的碳水化合物衍生物。有人认为果胶物质是一种均多糖。但多数人认为果胶物质是半乳糖醛酸与鼠李糖所组成的杂多糖。另外，许多植物的果胶物质中尚含有阿拉伯树胶（arabinan）、聚半乳糖和阿拉伯聚半乳糖。简单说，果胶物质的最大特征就是含有聚半乳糖醛酸。这些半乳糖醛酸的羧基可能有一部分被甲基酯化，一部分或全部被大碱所中和。为了求得名词的统一，根据它的结构和某些性质，美国化学协会等组织给各种不同果胶物质定义如下∶（1）原果胶（Protopectin）。植物在未成熟前，果胶物质相互间，或它与半纤维素及钙盐之间，以机械方式或化学方式相结合，形成了不溶于水的物质。原果胶可以成为一种不溶于水的、亲水能力很大的结合剂，这时原果胶具有增稠作用。在酶的作用下，草莓等成熟的果实和胡萝卜等蔬菜中的原果胶，能逐渐变为果胶酯酸。于是，一部分果胶物质呈溶解状态而存在细胞液中。原果胶在水或酸性溶液中加热，也同样可转变为果胶酯酸。（2）果胶酯酸（Pectinicacid）。它的基本结构是多聚半乳糖醛酸，呈胶态。其中甲基酯的含量是可变的。酯化程度100%的完全甲基化的果胶酯酸，甲氧基（CH3O—）含量为16.32%。按甲氧基含量的不同，果胶酯酸分为两类。甲氧基含量大于7%的，叫作高甲氧基果胶（又称果胶，Pectin）；甲氧基含量小于7%的，叫作低甲氧基果胶（又称低酯果胶）。果胶酯酸与糖和酸在适当条件下能形成凝胶。甚至，不用加糖，只要有多价正离子存在，，低酯果胶也可形成凝胶。果胶酯酸的游离羧基与金属离子可形成正盐或酸式盐。（3）果胶酸（Pecticacid）。它的基本结构是聚半乳糖醛酸，呈胶态。它同果胶酯酸的差别是其中的羧基是游离的，不以甲基酯的形式存在，但实际很难得到无甲酯的果胶物质。通常，把甲氧基含量为1%的，叫作果胶酸。天然的果蔬，仅含有少量果胶酸。而在酶的作用下，水溶性的果胶物质可以转变为果胶酸。果胶酸的游离羧基与金属离子也形成正盐或酸式盐。关于果胶物质的测定，通常采用的方法有重量法、果胶酸钙滴定法（即用乙二胺四乙酸二钠标准溶液滴定果胶酸钙中的钙量）和咔唑反应比色法等。上述测定方法中，果胶酸钙滴定法较适于纯果胶的测定。当样品有色时，不易确定滴定终点。且由不同试样得到的果胶酸钙，其组成各不相同，分析果胶酸钙中的钙量不能用来计算果胶的实际含量。因此，应用范围受到一定限制。测定方法有重量法、比色法等。一、质量法方法原理将果胶物质从样品中提取出来，加入氯化钙生成不溶于水的果胶酸钙，测其果胶酸钙质量或换算成果胶酸的质量。试剂（1）0.1mol·L-INaOH溶液。称取化学纯NaOH4g加水溶解，然后稀释至1000mL。（2）1mol·L醋酸溶液。取化学纯冰乙酸58.3mL，加水稀释至1000mL。（3）0.1mol·L~'CaCl2溶液。称取分析纯无水氯化钙5.5g，加水溶解后，稀释至500mL。（4）2mol·LCaCl2溶液。称取分析纯无水氯化钙110g，加水溶解后，稀释至500mL。操作步骤（1）样品处理。样品中存在果胶酶时，为了钝化酶的活性，可以加入热的950ml.·L乙醇，使样品溶液的乙醇最终浓度调整到700mL·L-以上。然后加热煮沸1.5h，过滤后，以950mL·L-’乙醇洗涤多次，再以乙醚处理。这样，可除去全部糖类、脂类及色素，乙醚则挥发除去。干燥的样品需要磨细，细度为60目。（2）提取。①总果胶物质新鲜样品称取磨碎的样品50g。置于1000mL烧杯中，加入0.05mol-L-AHCl400mL，在80～90℃加热2h。加热时随时补充蒸发损失的水分。冷却后，移入500mL容量瓶，加水稀释定容，过滤。干燥样品称取样品5g，置于250mL三角瓶中，加入加热至沸的0.05mol·L~HCl150mL，连接冷凝器，加热煮沸1h，冷却至室温，用水定容至200mL，摇匀，过滤。②水溶性果胶物质。将样品研碎。新鲜样品准确称取30～50g；干燥样品准确称取5～10g。以150mL水将样品移入250mL烧杯中。加热至沸，保持沸腾1h。加热时随时补足蒸发所损失的水分。把杯内物质全部移入250mL容量瓶内，加水定容。过滤。测定。吸取一定量滤液，其量相当于能生成果胶钙约25mg。将提取液放入1000mL烧杯中，中和后，加水至300mL，加入0.1mol·LNaOH溶液100mL，充分搅拌，放置过夜，以皂化之（脱去甲氧基，使生成果胶酸钠）。加入1mol·L-'HOAc溶液50mL。5min后，加入0.1mol·L~'CaCl2溶液25mL，然后，一边滴加2mol·L~1CaCl2溶液25mL一边充分搅拌。放置1h后，加热5min，趁热以直径11cm的折叠滤纸过滤，用热水洗涤至不含有氯化物，然后，用热水把滤纸上的沉淀无损地洗入原先的烧杯中，加热煮沸数分钟，用已知重量的玻璃砂蕊漏斗（1G2）过滤，在105℃烘1.5h后称重，再放入烘箱继续干燥至恒重为止。结果计算计算方式有两种，一种用果胶酸钙表示，另一种用果胶酸表示。二、比色法（注1）方法原理方法基于果胶物质水解，生成半乳糖醛酸在强酸中与咔唑的缩合反应。然后，对其紫红色呈色溶液进行比色定量。试剂（1）乙醇（化学纯）。无水乙醇和950mL·L-1乙醇。（2）精制乙醇。取无水乙醇（化学纯）或950mL·L乙醇1000mL，加入Zn粉4g和硫酸（1∶1）4mL，置恒温水浴中回流10h后，用全玻璃仪器蒸馏。馏出液每1000mL加入Zn粉和KOH各4g，进行重蒸馏。（3）1.5g·L-I咔唑乙醇溶液。称取化学纯咔唑0.150g，溶解于精制乙醇，并定容至100mL。（4）标准半乳糖醛酸。以医药公司上海化学试剂采购供应站分装的L.Light出品a-D水解半乳糖醛酸作为标准半乳糖醛酸。（5）浓硫酸（优级纯）（注2）。（6）0.05mol·L-'HCI溶液。操作步骤（1）半乳糖醛酸标准曲线的制作。准确称取α-D-水解半乳糖醛酸100mg，溶解于蒸馏水，并定容至100mL，混合后得1mg·mL-1的半乳糖醛酸原液。移取上述原液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0mL，分别注入100mL容量瓶中，稀释至刻度，即得一系列浓度为10、20、30、40、50、60、70μg·mL-|的半乳糖醛酸标准溶液。取30mm×200mm的硬质大试管7支，用吸管注入浓H2SO4。各12mL。置冰水浴中冷却，边冷却边分别沿壁徐徐加入上述不同浓度的半乳糖醛酸标准溶液各2mL，充分混合后，再置冰水浴中冷却。然后，在沸水浴中加热10min，冷却至室温后，加入1.5g·L~1咔唑溶液各1mL，充分混和。另以蒸馏水代替半乳糖醛酸标准溶液，依上法同样处理，作为试剂空白对照。室温下放置30min后，用721型分光光度计，在波长530mm下，分别测定其吸光度（A），以测得的吸光度（A）为纵坐标，每毫升标准溶液中半乳糖醛酸的含量为横坐标，制作标准曲线。（2）样品中果胶物质的提取和测定。称取番茄原浆和番茄汁20g，注入250mL烧瓶中，加入无水乙醇100mL，充分搅拌混和后盖以表玻璃。在85～90℃恒温水浴上加热20min，冷却，并静置1h后，用1G3玻璃滤器，在轻微抽气下过滤，弃去含糖的乙醇滤液。沉淀用乙醇分次洗涤，除去糖分，直至滤液无色，用穆立虚反应法（*）检验至无糖或接近无糖的反应为止（半）。然后，将沉淀移入250mL三角烧瓶，并用150mL加热至沸的0.05mol·L-1HCl溶液将滤器上残留的沉淀无损地洗入同一烧瓶中，摇匀，接上回流冷凝管，在沸水浴上抽提1h，冷却至室温，用蒸馏水定容至200mL。混合，先经脱脂棉粗滤，再用滤纸过滤。移取上述澄清的提取液10mL，注入100mL容量瓶中，加水定容。然后，移取稀释液2mL按半乳糖醛酸标准曲线的制作法操作，测定其吸光度（法5.6），由标准曲线查出稀释液中半乳糖醛酸的浓度（pg*mL~1）。结果计算样品中的果胶物质总量以半乳糖醛酸表示。注释注1.本试验方法较果胶酸钙重量法操作简易，快速，每份样品需6~8h。半乳糖醛酸标准加料的平均回收率达98.4%～102.7%。样品的重现性较好，同一试样5次测定结果的标准偏差为±1.03%～3.71%，标准误差为±0.46～1.51。注2.硫酸的浓度对半乳糖醛酸溶液的呈色有较大的影响。半乳糖醛酸在低浓度的硫酸中与咔唑试剂的呈色度极低，甚至不起呈色反应而仅在浓HSO中，才可使其充分显色。此外，硫酸的纯度，对其呈色反应也有一定影响，测定样品时必须选用与标准曲线的制作相同规格和批次的硫酸，以消除其误差。注3.糖分的穆立虚反应法检检。取待测检测0.5mL，注入小试管中，加入50g·L-1萘酚的乙醇溶液2～3滴，充分混合，此时溶液稍有白色混浊。然后，使试管稍稍倾斜，用吸管沿管壁徐徐加入浓硫酸1mL（注意水层与浓硫酸不可混和）。将试管稍予静置后，若在两液层的界面产生紫红色色环，则证明检液含有糖分。注4.应用咔唑反应比色法测定果胶物质时，其试样的提取液必须是不含糖分的溶液。糖分的存在，对硫酸一半乳糖醛酸混合液的咔唑呈色引起较大的干扰，而使测定结果偏高。因此，从样品中提取果胶物质之前，用乙醇