果蔬中脂氧合酶活性的测定

果蔬中脂氧合酶活性的测定一、目的要求了解脂氧合酶的作用，掌握果蔬组织中脂氧合酶活性的测定方法。二、基本原理脂氧合酶（Lipoxygenase，LOX）是一种含非血红素铁的蛋白质，专一催化具有顺、顺-1,4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸的加氧反应，生成具有共轭双键的过氧化物。LOX在植物中普遍存在，其作用的底物主要为来自细胞质膜的多元不饱和脂肪酸如亚油酸、甲基亚油酸、亚麻酸及花生四烯酸等。LOX与果蔬细胞脂质过氧化作用、后熟衰老过程的启动和逆境胁迫、伤诱导、病原侵染信号的产生和识别等关系密切，被认为是引起果蔬后熟衰老的一类重要的酶。LOX能催化含有顺、顺-1,4-戊二烯结构的多不饱和脂肪酸的加合氧分子反应，生成的初期产物具有共轭二烯结构，产物中的共轭双键在波长234nm处具有特征吸收。因此，利用分光光度计法可以测定LOX酶活性大小。三、材料、仪器及试剂（一）材料芒果、番茄、桃、猕猴桃等。（二）仪器及用具研钵、高速冷冻离心机、移液器、离心管、紫外分光光度计、容量瓶（100mL、1000mL）、试管、计时器。（三）试剂1．亚油酸钠溶液方法一：称取亚油酸钠（Sigma产品），直接配制100mmol/L亚油酸钠溶液。方法二：取0.5mL亚油酸（化学纯），加入到10mL蒸馏水中，再加入0.25mLTween-20，摇匀。再逐滴滴加1mol/LNaOH，摇动至溶液变得清亮。然后用蒸馏水稀释至100mL，即为0.5%亚油酸溶液。2．100mmol/L、pH6.8磷酸钠缓冲液母液A（200mmol/LNa2HPO4溶液）：称取35.61gNa2HPO4·2H2O或53.65gNa2HPO4·7H2O或71.64gNa2HPO4·12H2O，用蒸馏水溶解，定容至1000mL。母液B（200mmol/LNaH2PO4溶液）：称取27.6gNaH2PO4·H2O或31.2gNaH2PO4·2H2O用蒸馏水溶解，定容至1000mL。取49.0mL母液A和51.0mL母液B混合后，调节pH至6.8，稀释、定容至200mL。3．提取缓冲液（含1%TritonX-100和4%PVPP）取1mLTritonX-100和4gPVPP，加入到100mL100mmol/L、pH6.8磷酸钠缓冲液中，摇匀，置于4℃冰箱预冷。4．100mmol/L、pH5.5醋酸缓冲液母液A（200mmol/L醋酸溶液）：量取11.55mL冰醋酸，加蒸馏水稀释至1000mL。母液B（200mmol/L醋酸钠溶液）：称取16.4g无水醋酸钠（或称取27.2g三水合乙酸钠），用蒸馏水溶解、定容至1000mL。取68mL母液A和432mL母液B混合后，调节pH至5.5，加蒸馏水稀释至1000mL。四、实验步骤（一）酶液提取称取5.0g果蔬组织置于研钵内，加入5.0mL经4℃预冷的提取缓冲液，在冰浴条件下研磨匀浆，然后转入离心管于4℃、12000×g离心30min，收集上清夜用于LOX活性测定。（二）活性测定方法一：取2.75mL100mmol/L、pH5.5醋酸缓冲液，加入50μL100mmol/L亚油酸钠，在30℃保温10min，加入200µL粗酶液，混匀。以蒸馏水为参比调零，在反应15s时开始记录反应体系在波长234nm处吸光度值为初始值，然后每隔30s记录一次，连续测定，至少获取6个点的数据。重复三次。方法二：取2.7mL50mmol/L、pH6.8磷酸缓冲液，加入100μL0.5%亚油酸溶液，在30℃保温10min，再加入200μL粗酶液，混匀，按照上述方法测定混合液在234nm处吸光度值。五、实验结果与计算1．将测定的数据填入下表重复次数样品重量W(g)提取液体积V(mL)吸取样品液体积Vs(mL)234nm吸光度值样品中LOX活性(0.01△OD234·min-1·g-1FW)OD0OD1OD2OD3OD4OD5△OD计算值平均值±标准偏差1232．计算结果记录反应体系在234nm处的吸光度值，制作OD234值随时间变化曲线，根据曲线的初始线性部分计算每分钟吸光度变化值△OD234。然后，以每克鲜重（FW）果蔬样品每分钟吸光度变化值增加0.01时为1个LOX活性单位（U），则U=0.01△OD234·min-1·g-1FW。计算公式：式中：△OD234——反应混合液的吸光度变化值；△t——酶促反应时间，min；V——样品提取液总体积，mL；Vs——测定时所取样品提取液体积，mL；W——样品重量，g。脂氧合酶活性还可以每分钟反应体系在波长234nm处吸光度值变化增加0.01时所需的