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文档简介
果蔬中脂氧合酶活性的测定一、目的要求了解脂氧合酶的作用,掌握果蔬组织中脂氧合酶活性的测定方法。二、基本原理脂氧合酶(Lipoxygenase,LOX)是一种含非血红素铁的蛋白质,专一催化具有顺、顺-1,4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸的加氧反应,生成具有共轭双键的过氧化物。LOX在植物中普遍存在,其作用的底物主要为来自细胞质膜的多元不饱和脂肪酸如亚油酸、甲基亚油酸、亚麻酸及花生四烯酸等。LOX与果蔬细胞脂质过氧化作用、后熟衰老过程的启动和逆境胁迫、伤诱导、病原侵染信号的产生和识别等关系密切,被认为是引起果蔬后熟衰老的一类重要的酶。LOX能催化含有顺、顺-1,4-戊二烯结构的多不饱和脂肪酸的加合氧分子反应,生成的初期产物具有共轭二烯结构,产物中的共轭双键在波长234nm处具有特征吸收。因此,利用分光光度计法可以测定LOX酶活性大小。三、材料、仪器及试剂(一)材料芒果、番茄、桃、猕猴桃等。(二)仪器及用具研钵、高速冷冻离心机、移液器、离心管、紫外分光光度计、容量瓶(100mL、1000mL)、试管、计时器。(三)试剂1.亚油酸钠溶液方法一:称取亚油酸钠(Sigma产品),直接配制100mmol/L亚油酸钠溶液。方法二:取0.5mL亚油酸(化学纯),加入到10mL蒸馏水中,再加入0.25mLTween-20,摇匀。再逐滴滴加1mol/LNaOH,摇动至溶液变得清亮。然后用蒸馏水稀释至100mL,即为0.5%亚油酸溶液。2.100mmol/L、pH6.8磷酸钠缓冲液母液A(200mmol/LNa2HPO4溶液):称取35.61gNa2HPO4·2H2O或53.65gNa2HPO4·7H2O或71.64gNa2HPO4·12H2O,用蒸馏水溶解,定容至1000mL。母液B(200mmol/LNaH2PO4溶液):称取27.6gNaH2PO4·H2O或31.2gNaH2PO4·2H2O用蒸馏水溶解,定容至1000mL。取49.0mL母液A和51.0mL母液B混合后,调节pH至6.8,稀释、定容至200mL。3.提取缓冲液(含1%TritonX-100和4%PVPP)取1mLTritonX-100和4gPVPP,加入到100mL100mmol/L、pH6.8磷酸钠缓冲液中,摇匀,置于4℃冰箱预冷。4.100mmol/L、pH5.5醋酸缓冲液母液A(200mmol/L醋酸溶液):量取11.55mL冰醋酸,加蒸馏水稀释至1000mL。母液B(200mmol/L醋酸钠溶液):称取16.4g无水醋酸钠(或称取27.2g三水合乙酸钠),用蒸馏水溶解、定容至1000mL。取68mL母液A和432mL母液B混合后,调节pH至5.5,加蒸馏水稀释至1000mL。四、实验步骤(一)酶液提取称取5.0g果蔬组织置于研钵内,加入5.0mL经4℃预冷的提取缓冲液,在冰浴条件下研磨匀浆,然后转入离心管于4℃、12000×g离心30min,收集上清夜用于LOX活性测定。(二)活性测定方法一:取2.75mL100mmol/L、pH5.5醋酸缓冲液,加入50μL100mmol/L亚油酸钠,在30℃保温10min,加入200µL粗酶液,混匀。以蒸馏水为参比调零,在反应15s时开始记录反应体系在波长234nm处吸光度值为初始值,然后每隔30s记录一次,连续测定,至少获取6个点的数据。重复三次。方法二:取2.7mL50mmol/L、pH6.8磷酸缓冲液,加入100μL0.5%亚油酸溶液,在30℃保温10min,再加入200μL粗酶液,混匀,按照上述方法测定混合液在234nm处吸光度值。五、实验结果与计算1.将测定的数据填入下表重复次数样品重量W(g)提取液体积V(mL)吸取样品液体积Vs(mL)234nm吸光度值样品中LOX活性(0.01△OD234·min-1·g-1FW)OD0OD1OD2OD3OD4OD5△OD计算值平均值±标准偏差1232.计算结果记录反应体系在234nm处的吸光度值,制作OD234值随时间变化曲线,根据曲线的初始线性部分计算每分钟吸光度变化值△OD234。然后,以每克鲜重(FW)果蔬样品每分钟吸光度变化值增加0.01时为1个LOX活性单位(U),则U=0.01△OD234·min-1·g-1FW。计算公式:式中:△OD234——反应混合液的吸光度变化值;△t——酶促反应时间,min;V——样品提取液总体积,mL;Vs——测定时所取样品提取液体积,mL;W——样品重量,g。脂氧合酶活性还可以每分钟反应体系在波长234nm处吸光度值变化增加0.01时所需的
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