微生物的遗传变异和育种

第八章微生物的遗传变异和育种第一节遗传变异的概念及物质基础第二节基因突变与基因重组第三节微生物育种第四节基因工程第五节

菌种保藏

第八章微生物的遗传变异和育种生物体最本质的属性之一。遗传，讲的是亲子间的关系，指生物的上一代将自己的一整套遗传因子传递给下一代的行为或功能，它具有极其稳定的特性。变异：指生物体遗传物质结构或数量的改变，即遗传型的改变。微生物与遗传学研究：个体结构简单；营养体多为单倍体；易于在成分简单的合成培养基上生长繁殖；繁殖速度快；易于累积不同的最终代谢产物及中间代谢物；菌落形态特征的可见性与多样性；环境条件对各个体作用具有直接性和均一性；易于形成营养缺陷型；一般都有相应的病毒；存在多种处于进化过程中的原始有性生殖方式等。研究现代遗传学和重要的生物学基本理论问题，微生物是最佳材料和研究对象。第一节遗传变异的概念及物质基础一、基本概念（一）、遗传型、基因型：某一生物个体所含有的全部遗传因子（基因的总和）。具有某遗传型的生物只有在适当的环境条件下，通过自身的代谢和发育，才能将它具体化，即产生表型。----------代谢----

遗传型+环境条件------->表型

--------------发育----一、基本概念（二）、表型：某一生物体所具有的一切外表特征及内在特性的总和，是遗传型在合适环境下的具体体现。表型是一种现实性。一、基本概念（三）、变异：在某种外因或内因的作用下，生物体遗传物质结构或数量的改变，即遗传型的改变。变异特点：在群体中以极低的几率(一般为10-5～10-10)出现；性状变化的幅度大；变化后的新性状是稳定和可遗传的。一、基本概念（四）、饰变：不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、翻译水平上的表型变化。饰变特点：整个群体中每一个体都发生同样变化；性状变化的幅度小；饰变性状不遗传。例如，粘质沙雷氏菌25℃培养，产生深红色灵杆菌素，把菌落染成鲜血似的(因此过去称它为“神灵色杆菌”或“灵杆菌”)；37℃时，群体中所有个体都不产色素。重新降温至25℃，所有细胞产色素能力又可以恢复。二、证明核酸是遗传变异

物质的经典实验（一）、转化实验

（二）、噬菌体感染实验

（三）、植物病毒的重建实验

（一）转化实验英，F.Griffith，1928年研究肺炎链（双）球菌发现转变现象。肺炎链（双）球菌，球菌，成双或成链，致人肺炎、小鼠败血症。有许多不同菌株，有荚膜者具致病性，菌落表面光滑，称S型；有的不形成荚膜，无致病性，菌落外观粗糙，称R型。F.Griffith的三组试验：1、动物试验：小白鼠体内加入活R菌或死S菌，小白鼠活；小白鼠体内加入活S菌，小白鼠死；小白鼠体内加入活R菌和热死S菌，小白鼠死，抽心血分离，发现有活的S型细胞－转化现象。2、细菌培养试验：热死S菌在培养皿中培养，不生长；活R菌在培养皿中培养，长出R菌；热死S菌和活R菌在培养皿中培养，长出大量R菌和10-6S菌。3、S型菌无细胞抽提液试验：活R菌加S菌的无细胞抽提液，在培养皿中培养，长出大量的R菌和少量的S菌。(a)无毒毒菌菌系系RII不使使白白鼠鼠死死亡亡，，从从鼠鼠体体内内分分离离仍仍得得无无毒毒细细菌菌；；(b)将SIII加热热杀杀死死，，不不使使白白鼠鼠死死亡亡，，鼠鼠体体内内无无有有毒毒细细菌菌；；(c)混合合活活RII和加加热热杀杀死死的的SIII，，使白白鼠鼠死死亡亡，，并并在在死死鼠鼠体体内内发发现现活活的的SIII细胞胞（一一））转转化化实实验验以上上实实验验说说明明，，加加热热杀杀死死的的S型细细菌菌，，在在其其细细胞胞内内可可能能存存在在一一种种转转化化物物质质，，它它能能通通过过某某种种方方式式进进入入R型细细胞胞，，并并使使R型细细胞胞获获得得稳稳定定的的遗遗传传性性状状。。（一一））转转化化实实验验1944年年，，美美Avery等进进行行了了离离体体条条件件转转化化实实验验。。1、、从从活活S菌分分离离提提纯纯各各种种细细胞胞成成分分————DNA，，RNA，，蛋白白质质，，荚荚膜膜多多糖糖等等。。2、将将各组组分逐逐个与与活R菌混合合（①①加S菌的DNA；②②加S菌的DNA及DNA酶以外外的酶酶；③③加S菌的DNA和DNA酶(分分解DNA)；；④加S菌的RNA；⑤⑤加S菌的蛋蛋白质质；⑥⑥加S菌的荚荚膜多多糖）），体体外培培养。。3、结结果：：①、、②长长出S菌；③③、④④、⑤⑤、⑥⑥只长长R菌。自SIII抽提的的DNA与活R菌系细细菌混混合，，少数数R细胞转转化成成S细胞。。加脱脱氧核核糖核核酸酶酶(DNase)可阻止止转化化作用用（一））转化化实验验上述结结果说说明：：S菌DNA将R型转化化为S型。DNA纯度越越高，，转化化效率率越高高。微微量纯纯DNA(6×10-8g)，，仍有转转化能能力。。S菌转移移给R菌的，，不是是某一一遗传传性状状(如如荚膜膜多糖糖)本本身，，而是是以DNA为物质质基础础的遗遗传信信息。。（二））噬菌菌体感感染实实验1952，A.Hershey等利用用示踪踪元素素，证明DNA是噬菌菌体遗遗传物物质。。以放射射性32PO3-4或35SO2-4作为磷磷源或或硫源源培养养E.coli，，让T2噬菌体体（只只有核核酸和和蛋白白质））感染染E.coli，获得得含32P-DNA核心的的噬菌菌体或或含35S-蛋白质质外壳壳的噬噬菌体体。将32P-DNA噬菌体体、35S-蛋白质质外壳壳噬菌菌体分分别感感染无无放射射性的的E.coli，搅拌拌离心心，观观察。。发现现DNA是噬菌菌体遗遗传物物质。。用含32PDNA(核心)的噬噬菌体体作感感染实实验用含35S蛋白质质(外外壳)的噬噬菌体体作感感染实实验（三））植物物病毒毒的重重建实实验：：1956，，美H.Fraenkel-Conrat，TMV（RNA）和HRV（与TMV近缘的的霍氏氏车前前花叶叶病毒毒）。将TMV放在一一定浓浓度的的苯酚酚溶液液中振振荡,使蛋蛋白质质外壳壳与RNA分离。。分离的的RNA能感染染烟草草患典典型症症状,病斑斑中能能分离离出正正常病病毒粒粒子。。RNA裸露，，缺乏乏蛋白白质衣衣壳保保护，，感染染频率率低于于正常常TMV粒子的的感染染频率率。TMV重建实实验示示意图图(粗粗线箭箭头头表示示遗传传信息息的去去向)二、证证明核核酸是是遗传传变异异物物质的的经典典实验验通过上上述三三个经经典实实验，，确信信无疑疑地得得出结结论，只有核核酸才才是贮贮存遗遗传信信息的的真正正物质质。三、遗遗传物物质在在细胞胞中的的存在在方式式（一））、细细胞水水平：：核或或核质质体（二）、、细胞胞核水水平：：核内内染色色体(核基基因组组)，，核外外染色色体（（真核核质粒粒、质质体－－线粒粒体、、叶绿绿体；；原核质质粒：：F因子性因子子、R因子抗性因因子、Col质粒产大肠肠杆菌菌素因因子、Ti质粒诱癌、巨大大质粒粒固氮、降解解性质质粒降解复复杂物物质）（三））、染染色体体水平平：数目，，倍数数（四））、核核酸水水平：：DNA，RNA三、遗遗传物物质在在细胞胞中的的存在在方式式（五））、基基因水水平：具有特特定核核苷酸酸顺序序的核核酸片片段，，具有有自主主复制制能力力的最最小遗遗传功功能单单位。。相对对分子子量约约为6.7×105Da，1000--1500bp(碱基对对)，每个个细菌菌一般般含有有5，000—10，000个基因因。三、遗遗传物物质在在细胞胞中的的存在在方式式（六））、密密码子子水平平：决决定3个核核苷酸酸顺序序（AA））的片断断，遗遗传的的信息息单位位。43=64＞20－23，，出现现一种以以上密密码子子编码码同一一种氨氨基酸酸的现现象。。有些些被用用作““起读读”(AUG)或““终止止”信信号(UAA、UGA和UAG)。（七））、核核苷酸酸、碱碱基水水平：：最低低突变变单位位或交交换单单位（（A、G、T、C）。。三、遗遗传物物质在在细胞胞中的的存在在方式式原核生生物的的基因因调控控系统统是由由操纵纵子（（启动动基因因、操操纵基基因、、结构构基因因）和和调节节基因因组成成。结构基基因决决定多多肽(酶及结结构蛋蛋白)的合成，，操纵纵基因因与结结构基基因紧紧密连连锁在在一起起的，，控制制结构构基因因转录录的开开放或或关闭闭。启启动基基因是是转录录起始始部位位。调节基基因一一般与与操纵纵子有有一定定间隔隔距离离(一一般小小于100个碱碱基)，调调节结结构基基因的的活动动。三、遗遗传物物质在在细胞胞中的的存在在方式式顺序：：启动动基因因－操操纵基基因－－结构构基－－调节节基因因关闭转转录：：调节节基因因转录录出自自己的的mRNA,经翻译译产生生阻遏遏蛋白白,识识别并并附着着在操操纵基基因上上，相相互作作用使使DNA双链无无法分分开，，阻挡挡RNA聚合酶酶沿着着结构构基因因移动动。启动转转录：：阻遏遏蛋白白从操操纵基基因上上解除除；依依赖于于DNA的RNA多聚酶酶附着着在启启动基基因上上，通通过操操纵基基因，，沿着着结构构基因因移动动，转转录mRNA。。三、遗遗传物物质在在细胞胞中的的存在在方式式真核生生物的的基因因：没没有操操纵子子结构构，存存在不不编码码序列列和重重复序序列，，转录录与翻翻译有有空间间分隔隔，基基因之之间被被许多多无编编码功功能的的内含含子阻阻隔。。四、原原核生生物的的质粒粒cccDNA：：游离于于染色色体外外，具具有独独立复复制能能力的的小型型共价价闭合合环状状DNA分子。。1984，，天蓝色色链霉霉菌等等，发发现线线形质质粒。。某些质质粒具具有与与核染染色体体整合合和脱脱离的的功能能，如F因子，称“附附加体体”。分子量量一般般在106～108Da，，大小约约为1%核基因因组。。携带带染色色体上上没有有的基基因，赋予某某些特特殊功功能，，例如如接合合、产产毒、、抗药药、固固氮、、产特特殊酶酶或降降解有有毒物物质等等。质粒消消失不不会造造成菌菌体死死亡。。四、原原核生生物的的质粒粒质粒复复制与与核染染色体体同步步，称“严严紧型型复制制控制制”，，细胞胞一般般含1～2个质粒粒；不同步步，称“松松弛型型复制制控制制”，一般含含10～15个或更更多。。质粒之之间及及质粒粒与核核染色色体之之间可可以发发生重重组。。少数质质粒可可以在在不同同菌株株间发发生转转移，如F、R等。遇吖啶类类染料、、丝裂霉霉素C、紫外线、、利福平平、重金金属离子子或高温温等因素素，可使子代代细胞中中质粒消消失。四、原核核生物的的质粒（一）、、F因子、致致育因子子或性因因子：E.coli等细菌中中决定性性别。约约等于2%核染染色体DNA的小型cccDNA。。分子量为为6.2×107Da，94.5kb（（千碱基对对），其其中有1/3的的基因与与接合作作用有关关。四、原核核生物的的质粒（二）、、R因子、R质粒：多数由相相连的两两个DNA片段组成成。其一一称RTF质粒(抗抗性转移移因子)，含有有调节DNA复制和拷拷贝数的的基因及及转移基基因，有有时还有有四环素素抗性基基因。11×106Da。其二为r质粒（抗抗性决定定质粒）），几百百万至100××106Da以上。含含其他抗抗生素的的抗性基基因，例例如抗青青霉素、安比西林林、氯霉素、链霉素、卡那霉素素和磺胺胺等基因因。一种可通通过接合合而转移移的R因子的形形成(IS因子是转转座因子子，可使使RTF质粒和r决定质粒粒结合)四、原核核生物的的质粒（三）、、Col因子、产产大肠杆杆菌素因因子。大大肠杆菌菌素是E.coli某些菌株株分泌的的细菌毒毒素，具具有通过过抑制复复制、转转录、翻翻译或能能量代谢谢等，专专一地杀杀死其他他肠道细细菌的功功能。约约4～8×104Da。携带Col因子的菌菌株，由由于质粒粒本身编编码一种种免疫蛋蛋白，从从而对大大肠杆菌菌素有免免疫作用用，不受受其伤害害。四、原核核生物的的质粒（四）、、Ti质粒、诱诱癌质粒粒：大型型，长200kb。根癌土壤壤杆菌侵侵入到双双子叶植植物细胞胞中，Ti质粒片段段与植物物细胞核核染色体体组发生生整合，，破坏控控制细胞胞分裂的的激素调调节系统统，转变变成癌细细胞。植物遗传传工程研研究的重重要载体体。外源源基因可可借DNA重组技术术插入到到Ti质粒中，，进一步步整合到到植物染染色体上上，改变变遗传性性，培育育优良品品种。四、原核核生物的的质粒（五）、、巨大质质粒：200～～300×106Da，比一般质质粒大几几十倍至至几百倍倍。根瘤菌属属中发现现，具有一系系列固氮氮基因。。四、原核核生物的的质粒（六）、、降解性性质粒：：可编码码降解复复杂物质质的酶，，利用一一般细菌菌难以分分解的物物质作碳碳源。如如CAM(樟脑)质质粒，OCT(辛烷)质质粒，XYL(二甲苯)质粒，，SAL(水杨酸)质粒，，MDL(扁桃酸)质粒，，NAP(萘)质粒粒和TOL(甲苯)质质粒等。。仅在假单单胞菌属属中发现现。第二节基因突变变与基因因重组突变指遗遗传物质质的核苷苷酸顺序序突然发发生了稳稳定的可可遗传的的变化。。基因重组组指把两两个不同同性状个个体内的的遗传基基因转移移到一起起，经过过重新组组合，形形成新遗遗传型个个体。属属于分子子水平杂杂交。一、基因因突变（一）、、类型（二）、、特点（三）、、机制（一）基基因突变变类型按内部结结构：1、基因因突变（点突变）：一对或少少数几对对碱基发发生改变变。2、染色色体畸变变：DNA的大段变变化(损伤)，表现为为插入、缺失、重复、易位和倒倒位。按表型特特征：1、形态态突变型型：细胞胞或菌落落形态改改变。2、生化化突变型型--代谢途径径发生变变异而形形态没有有明显变变化。分分营养缺缺陷型、、抗性突突变型和和抗原突突变型。。（一）基基因突变变类型A、营养缺陷陷型：基基因突变变引起代代谢过程程中某种种酶的合合成能力力丧失，，必须在在原有培培养基中中添加细细胞不能能合成的的营养成成分才能能正常生生长。B、抗性突变变型：能能抵抗有有害理化化因素，，分抗药药性、抗抗紫外线线或抗噬噬菌体等等。C、抗原突变变型--细胞成分分尤其是是细胞表表面成分分(细胞胞壁、荚荚膜、鞭鞭毛)的的细微改改变而引引起抗原原性变化化。（一）基基因突变变类型3、致死死突变型型--基因突变变导致个个体死亡亡。A、条件致死死突变型型：突变变后，在在某种条条件下可可正常生生长、繁繁殖并实实现其表表型，而而在另一一条件下下却无法法生长、、繁殖。。例如，，E.coli的某些菌菌株可在在37℃℃下正常常生长，，不能在在42℃℃下生长长等。B、其他突变变型：如如毒力、、糖发酵酵能力、、代谢产产物的种种类和产产量以及及对某种种药物的的依赖性性等。（一）基基因突变变类型按分离：：1、选择择性突变变：具有有选择性性标记，，可通过过某种环环境条件件使它们们得到优优势生长长,从而而取代原原始菌株株。如营营养缺陷陷型或抗抗性突变变型等。。2、非选选择性突突变：没没有选择择性标记记，只有有一些性性状的数数量差别别。例如如菌落大大小、颜颜色深浅浅及代谢谢产物量量的多少少等。（二）基基因突变变特点1、不对应应性--突变性状状与原因因无直接接对应关关系。2、自发性性--没有人为为诱变因因素，自自发产生生。3、稀有性性--自变频率率低且稳稳定，多为10-6～10-9。4、独立立性--某一群体体中，可可发生抗抗青霉素素的突变变型，也也可发生生抗链霉霉素或任任何其他他药物的的抗药性性。某一一基因的的突变，，不影响响其他基基因的突突变率。。突变对对某一细细胞是随随机的，，对某一一基因也也是随机机的。（二）基基因突变变特点5、诱变性性--诱变剂可可提高自自变频率率10～105倍。6、稳定定性--遗传结构构突变，，新性状状稳定遗遗传。7、可逆逆性--由原始野野生型基基因变异异为突变变型基因因的过程程称为正正向突变变，反之之称为回回复突变变或回变变。实验证明明，任何何性状既既有正向向突变，，也可发发生回复复突变。。（三）基基因突变变机制1、诱变变机制：：显著提提高突变变频率的的理化因因子，称称为诱变变剂。A、、碱基基对对置置换换：：只只涉涉及及一一对对碱碱基基被被另另一一对对碱碱基基所所置置换换，，属属于于微微小小损损伤伤，，又又称称点点突突变变。。分分为为转转换换（（嘧嘧啶啶或或嘌嘌呤呤同同类类更更换换））、、颠颠换换（（嘧嘧啶啶或或嘌嘌呤呤异异类类更更换换））。。某一一种种诱诱变变剂剂，，可可同同时时引引起起转转换换与与颠颠换换，，也也可可只只具具一一个个功功能能。。碱基基的的置置换换（（实实－－转转换换、、虚虚－－颠颠换换））（三三））基基因因突突变变机制制直接接置置换换诱诱变变：：直直接接与与核核酸酸碱碱基基发发生生化化学学反反应应的的诱诱变变剂剂，，不不论论在在机机体体内内或或在在离离体体条条件件下下均均有有作作用用。。种种类类很很多多，，例例如如亚亚硝硝酸酸、、羟羟胺胺和和各各种种烷烷化化剂剂(硫硫酸酸二二乙乙酯酯、、甲甲基基磺磺酸酸乙乙脂脂、、N-甲基基-N′′-硝基基-N-亚硝硝基基胍胍、、N-甲基基-N-亚硝硝基基脲脲、、乙乙烯烯亚亚胺胺、、环环氧氧乙乙酸酸、、氮氮芥芥等等)。。它它们们可可与与一一个个或或几几个个核核苷苷酸酸发发生生化化学学反反应应，，引引起起DNA复制制时时碱碱基基配配对对的的转转换换，，进进一一步步使使微微生生物物发发生生变变异异。。（三三））基基因因突突变变机制制间接接置置换换诱诱变变：：通通过过活活细细胞胞的的代代谢谢活活动动使使碱碱基基类类似似物物掺掺入入到到DNA分子子中中引引起起诱诱变变。。如如5-溴尿尿嘧嘧啶啶(5-BU)、5-氨基基尿尿嘧嘧啶啶(5-AU)、8-氮鸟鸟嘌嘌呤呤(8-NG)、2-氨基基嘌嘌呤呤(2-AP)和6-氯嘌嘌呤呤(6-CP)等。。对休休止止细细胞胞、、游游离离噬噬菌菌体体粒粒子子或或离离体体DNA分子子不不起起作作用用。。（三三））基基因因突突变变机制制B、、移码码突突变变：：诱诱变变剂剂使使DNA分子子中中一一个个或或少少数数几几个个核核苷苷酸酸增增添添(插插入入)或或缺缺失失，，从从而而使使该该部部位位后后面面的的全全部部遗遗传传密密码码发发生生转转录录和和翻翻译译错错误误的的一一类类突突变变。。由由移移码码突突变变所所产产生生的的突突变变株株，，称称为为移移码码突突变变株株。（三三））基基因因突突变变机制制C、、染色色体体畸畸变变：：某某些些理理化化因因子子如如X射线线及及烷烷化化剂剂、、亚亚硝硝酸酸等等，，引引起起DNA的大大损损伤伤，，包包括括染染色色体体结结构构的的缺缺失失（（基基因因减减少少））、重复复（（基基因因增增加加））、插入入、易位位、、倒倒位位（（基基因因排排列列顺顺序序相相反反））和和染染色色体体数数目目变变化化。。染色色体体结结构构变变化化，，分分染染色色体体内内畸畸变变和和染染色色体体间间畸畸变变。。前前者者只只涉涉及及一一条条染染色色体体，，后后者者非非同同源源染染色色体体间间的的易易位位。。（三三））基基因因突突变变机制制注意意：：许许多多理理化化诱诱变变剂剂的的诱诱变变作作用用都都不不是是单单一一功功能能的的。。例例如如，亚硝硝酸酸既既能能引引起起碱碱基基对对的的转转换换作作用用，又能能诱诱发发染染色色体体畸畸变变；一些些电电离离辐辐射射也也可可同同时时引引起起基基因因突突变变和和染染色色体体畸畸变变。。（三三））基基因因突突变变机制制2、、自自发发（（没没有有人人工工参参与与所所发发生生））突突变变机机制制：：A、、背景景辐辐射射和和环环境境因因素素的的诱诱变变：：不不少少““自自发发突突变变””实实质质上上是是一一些些原原因因不不详详的的低低剂剂量量诱诱变变因因素素长长期期综综合合诱诱变变导导致致。。例例如如，，充充满满宇宇宙宙空空间间的的各各种种短短波波辐辐射射或或高高温温诱诱变变效效应应，，以以及及自自然然界界中中普普遍遍存存在在的的一一些些低低浓浓度度的的诱诱变变物物质质(在在微微环环境境中中有有时时也也可可能能是是高高浓浓度度)的的作作用用等等。。（三三））基基因因突突变变机制制B、、自身身代代谢谢产产物物的的诱诱变变：：过过氧氧化化氢氢是是普普遍遍存存在在于于微微生生物物体体内内的的一一种种代代谢谢产产物物。。对对脉脉孢孢菌菌有有诱诱变变作作用用，，加加入入过过氧氧化化氢氢酶酶可可降降低低这这种种作作用用。。如如果果在在加加入入该该酶酶的的同同时时又又加加入入酶酶抑抑制制剂剂KCN，，则又又可可提提高高突突变变率率。。说说明明过过氧氧化化氢氢很很可可能能是是““自自发发突突变变””中中的的一一种种内内源源性性诱诱变变剂剂。。在在许许多多微微生生物物的的陈陈旧旧培培养养物物中中易易出出现现自自发发突突变变株株，，可可能能也也是是同同样样原原因因。。（三三））基基因因突突变变机制制C、、互变变异异构构效效应应：：DNA链中中，，T以烯烯醇醇式式出出现现，，复复制制时时，，其其相相对对位位置置不不再再是是A，，而是是G；；C以亚亚氨氨基基形形式式出出现现，，就就和和A配对对，，使使基基因因发发生生突突变变，，造造成成自自发发突突变变。。碱碱基基对对发发生生自自发发突突变变的的几几率率约约为为10-8～10-9。（三三））基基因因突突变变机制制D、、环出出效效应应：：DNA复制制中中，，如如果果其其中中某某一一单单链链上上偶偶而而产产生生一一个个小小环环，，则则会会因因其其上上的的基基因因越越过过复复制制而而发发生生遗遗传传缺缺失失，，从从而而造造成成自自发发突突变变。。环出出效效应应设设想想图图：：复复制制时时，，上链链标标记记B处发发生生““环环出出””，，只只有有A及C获得得复复制制，，从从而而发发生生自自发发突突变变。。在在下下链链中中,复复制制正正常常进进行行。。二、、基基因因重重组组（一一））、、原原核核微微生生物物的的基基因因重重组组：：转化化、、转转导导、、接接合合、、原原生生质质体体融融合合（二二））、、真真核核微微生生物物的的基基因因重重组组：：有性性杂杂交交、准准性性生生殖殖--（一一））原原核核微微生生物物基基因因重重组组1、、转转化化与与转转染染：：受体体菌菌直直接接吸吸收收来来自自供供体体菌菌的的DNA片段段，，通通过过交交换换，，整整合合到到自自己己的的基基因因组组中中，，从从而而获获得得供供体体菌菌的的部部分分遗遗传传性性状状的的现现象象称称转转化化。。转化化后后的的受受体体菌菌，，称称为为转转化化子子。。来来自自供供体体的的DNA片段段称称为为转转化化因因子子，，一一般般是是双双链链DNA片段段。。转化化过过程程示示意意图图G＋肺炎炎双双球球菌菌的的转转化化过过程程①吸吸附附：：双链链DNA片段段与与感感受受态态（（受受体体菌菌最最易易接接受受外外源源DNA片段段并并实实现现转转化化的的生生理理状状态态））受受体体菌菌细细胞胞表表面面的的特特定定位位点点(主要在在新形形成细细胞壁壁的赤赤道区区)结合，胆碱可可促进进这一一过程程；②酶解解：吸附的的DNA被核酸酸内切切酶分分解，形成平平均分分子量量4～5×106的DNA片段；；③进入入：一条单单链被被膜上上另一一种核核酸酶酶切除除，另一条条单链链耗能能后逐逐步进进入细细胞。。分子子量＜＜5×105的DNA片段不不能进进入细细胞。。低浓浓度溶溶菌酶酶处理理，提高细细胞壁壁通透透性，可提高高转化化频率率；（一））原核核微生生物基基因重重组④转化化：进进入的的单链链与受受体菌菌染色色体组组上的的同源源区段段配对对，接接着受受体染染色体体组的的相应应单链链片段段被切切除，，并被被外来来的单单链DNA所交换换和取取代，，形成成杂合合DNA区段(它们们间的的DNA顺序不不一定定互补补，故故可呈呈杂合合状态态)；；⑤复制制：染染色体体组复复制，，杂合合区段段分离离成两两个，，其中中之一一类似似供体体菌，，另一一类似似受体体菌。。细胞胞分裂裂后，，该染染色体体发生生分离离，形形成1个转转化子子。转化中中单链链外基基因组组片段段与双双链内内基因因组间间的交交换与与整合合过程程示意意图（一））原核核微生生物基基因重重组转染：：抽提提噬菌菌体或或其他他病毒毒的DNA(或RNA)，感染染感受受态的的宿主主细胞胞，产产生正正常的的噬菌菌体或或病毒毒后代代的现现象。与转化化不同同之处处：病病毒或或噬菌菌体并并非遗遗传基基因的的供体体菌，，中间间也不不发生生任何何遗传传因子子的交交换或或整合合，最最后也也不产产生具具有杂杂种性性质的的转化化子。。（一））原核核微生生物基基因重重组2、转转导与与溶源源转变变：通过缺陷或或温和和噬菌菌体的的媒介介，把供供体细细胞的的DNA片段携携带到到受体体细胞胞中，，从而而使后后者获获得了了前者者部分分遗传传性状状的现现象。。获得得新遗遗传性性状的的受体体细胞胞，称称为转转导子子。1952年年在鼠鼠伤寒寒沙门门氏杆杆菌中中发现现。大大肠杆杆菌、、芽孢孢杆菌菌属、、变形形杆菌菌属、、假单单胞菌菌属、、志贺贺氏菌菌属、、葡萄萄球菌菌属中中均发发现。。（一））原核核微生生物基基因重重组A、普遍性性转导导：噬噬菌体体本身DNA没有包包进去去，形形成缺缺陷型型，同同时误包供供体菌菌中的的任何何基因因(包括质质粒)，使受体体菌实实现各各种性性状的的转导导。分为完完全普普遍转转导（（完全全转导导）和和流产产普遍遍转导导（流流产转转导））。（一））原核核微生生物基基因重重组完全转转导：：鼠伤伤寒沙沙门氏氏菌野野生型型菌株株作供供体菌菌，营营养缺缺陷型型为受受体菌菌，P22噬菌体体作为为转导导媒介介。当当P22在供体体菌内内增殖殖时，，宿主主染色色体组组断裂裂，待待噬菌菌体成成熟之之际，，极少少数(10-6—10-8)噬噬菌体体衣壳壳误包包与噬噬菌体体DNA相仿的的供体体菌DNA片段(约1%)，，形成成完全不不含噬菌体体本身身DNA的假噬噬菌体体(一一种完完全缺缺陷的的噬菌菌体)。供供体菌菌裂解解时，，如把把少量量裂解解物与与大量量的受受体菌菌群相相混，，这种种特殊殊噬菌菌体将将外源源DNA片段导导入受受体菌菌。（一）原核核微生物基基因重组1个完全缺缺陷的假噬噬菌体只能能感染1个个受体细胞胞，受体细细胞不会发发生溶原化化和裂解。。导入的供供体DNA片段可与受受体染色体体组上的同同源区段配配对，再通通过双交换换而重组到到受体菌染染色体上，，形成遗传传性稳定的的转导子。。外源染色体体片段(双链DNA)通过双交换换形成一个稳稳定的转导导子图示（一）原核核微生物基基因重组流产转导：：在获得供供体菌DNA片段的受体体菌内，转转导DNA不能与受体体菌DNA进行重组并并复制，也不迅速速消失，（（只是借住住而已）仅仅表现稳定定转录、转转译、表达达的现象。。受体菌进行行分裂时，，只有一个个子细胞获获得这段DNA，另一子细细胞仅获得得供体基因因的产物—酶，在表型型上出现供供体菌的某某一特征。。并且，每每经过一次次分裂，就就受到一次次“稀释”。所以，只只能在选择择性培养基基平板上形形成一个微微小菌落（（即其中只只有一个细细胞是转导导子）。流产转导示示意图（一）原核核微生物基基因重组B、局限转导：：通过部分分缺陷的温温和噬菌体体把供体菌菌的少数特特定基因携携带到受体体菌中，并并获得表达达的转导现现象。①只能转导导供体菌的的个别特定定基因(一一般为噬菌菌体整合位位点两侧的的基因)；；②该特定定基因由部部分缺陷（（与完全缺缺陷相对而而言）的噬噬菌体携带带。分为低频转转导和高频频转导。（一）原核核微生物基基因重组低频转导(LFT)：：用低感染复数数的LFT裂解物感染染宿主，获得极少量量局限转导导子的方式式。（宿主主染色体被被不正常切切离的频率率极低，故故只能获得得极少量部部分缺陷噬噬菌体，即即极少量局局限转导子子）（一）原核核微生物基基因重组当温和噬菌菌体感染受受体菌后，，其染色体体开环，以以线状形式式整合到宿宿主染色体体的特定位位点上，使使宿主细胞胞发生溶原原化。该溶溶原菌因诱诱导而发生生裂解时，，有极少数数(～10-5)的前噬菌菌体发生不不正常切离离，将插入入位点两侧侧之一的少少数宿主基基因，连接接到噬菌体体DNA上，噬菌体体也将相应应的一段DNA遗留在宿主主的染色体体组上，通通过衣壳的的“误包””，形成一一种特殊的的噬菌体——（部分））缺陷噬菌菌体。当它它感染宿主主并整合在在宿主基因因组上时，，可使宿主主细胞成为为一个局限限转导子，，而不是一一个溶原菌菌，不具有有对相同温温和噬菌体体的免疫性性。低频转导(LFT)裂解物的形形成（一）原核核微生物基基因重组高频转导(HFT)：用高感染复复数的HFT裂解物感染染其它E.coligal-受体菌，高高频率地转转化为E.coligal+转导子的方方式。（一）原核核微生物基基因重组用高感染复复数的LFT裂解物感染染E.coligal-受体菌（不不发酵半乳乳糖的营养养缺陷型）），凡感染染λdgal（带供体菌gal基因）噬菌菌体的细胞胞，几乎同时感感染正常的的λ噬菌体。两两种噬菌体体同时整合合在一个受受体菌核染染色体组上上，受体菌成为为双重溶原原菌。当双双重溶原菌菌被紫外线线等诱导时时，正常λ噬菌体（助助体或辅助助噬菌体））的基因可可补偿λdgal所缺失的部部分基因功功能，两种噬菌体体同时获得得复制的机机会；裂解解物含有等等量λ和λdgal粒子，称HFT裂解物。（一）原核核微生物基基因重组-溶原转变：：温和噬菌菌体感染宿宿主使之溶溶原化，使使宿主获得得除免疫性性以外的新新性状的现现象。当宿宿主丧失这这一噬菌体体时，通过过溶原转变变而获得的的性状也同同时消失。。区别：1、、温和噬菌菌体不携带带供体菌基基因；2、、噬菌体完完整，没有有缺陷。典型例子：：不产毒白白喉棒状杆杆菌菌株（（β噬菌体）－－产白喉毒毒素。鸭沙沙门氏菌（（ε15噬菌体）－－细胞表面面多糖结构构变化。红红霉素链霉霉菌（P4噬菌体）－－红霉素生生物合成及及形成气生生菌丝等能能力。（一）原核核微生物基基因重组3、接合：：通过供体体菌和受体体菌完整细细胞间直接接接触而传传递大段DNA的过程。细菌以生活活在肠道内内的大肠杆杆菌、沙门门氏菌、志贺氏菌、赛氏杆菌、弧菌、固氮菌、克克氏杆菌和和假单胞杆杆菌等属的的一些种最最为常见。。放线菌研究究得最多的的是链霉菌菌属、诺卡卡氏菌属等等，尤以天蓝色色链霉菌最最为详细。。接合还可发发生在不同同属之间，如大肠杆菌菌与鼠伤寒寒沙门氏菌菌或鼠伤寒寒沙门氏菌菌与痢疾志志贺氏菌之之间。研究细菌接接合方法的的基本原理理（一）原核核微生物基基因重组大肠杆菌F因子(即致致育因子或或性质粒)：独立于染色色体外的小小型的环状状DNA，，一般呈超超螺旋状状态，具具有自主主的与染染色体进进行同步步复制和和转移到到其他细细胞中去去的能力力。还带带有一些些对细胞胞生命活活动关系系较小的的基因。。分子量5×107，DNA含量2%，1～～4个／／细胞。。属于附附加体质质粒，既既可脱离离染色体体独立存存在，也也可插入入(即整整合)到到染色体体组上；；既可经经过接合合作用而而获得，，也可通通过一些些理化因因素(如如吖啶橙橙、利福平、、环已亚亚胺和加加热等)的处理理从细胞胞中消失失。（一）原原核微生生物基因因重组大肠杆菌菌的4种类型：：F-(“雌性”)菌株：：没有F因子,表表面不具具性菌毛毛。F+(“雄性”)菌株：：细胞中中存在游游离F因子,表表面具性性菌毛，，数目与与因子数数相同。。Hfr(高频重组组)菌株：F因子被整整合在DNA上。-F′菌株：Hfr的F因子脱离离DNA,形成携带带一小段段(最多多可达1／3)染色体体基因的的游离F因子,特特称F′因子。该该菌株称称为初生生F′菌株。-（一）原原核微生生物基因因重组大肠杆菌菌的接合类型：1、F+F-：F+通过性菌菌毛将F因子转移移给F-成为F+。F因子传递递“滚环模型型”：①F因子的一一条DNA单链在特特定位置置上发生生断裂；；②断裂的单单链逐渐渐解开，同时以留留下的另另一条环环状单链链作模板板，通过模板板的旋转转，将解开的的单链通通过性菌菌毛推入入F-中，同时在供体细细胞内，重新合成成一条新新的环状状单链，取代解开开的单链链；③F-细胞中，外来DNA单链上也也合成一一条互补补的新DNA链，恢复成环环状双链链F因子，F-变成了F+。（一）原原核微生生物基因因重组2、F′′F-初生F′菌株与F-菌株接合合，使之之成为次次生F′菌株，含含有质粒粒基因和和若干原原属Hfr菌株的遗遗传性状状。通过质粒粒来传递递供体基基因的方方式，称称为F质粒转导导、F因子转导导、性导导、F质粒媒介介转导。。（一）原原核微生生物基因因重组-Hfr与F-：：接合时，Hfr染色体在在F因子处发发生断裂裂，由环状变变成线状状，F因子位于于最末端端。由于于种种原原因，这种线状状染色体体在转移移过程中中经常会会发生断断裂，越在前端端的基因因，进入的机机会就越越多，在F-中出现重重组子的的时间就就越早，频率也高高。F因子位于于最末端端，进入的机机会最少少，引起性别别转化的的可能性性也最小小。因此此，Hfr与F-接合的结结果重组组频率虽虽高，但却很少少出现F+的菌株，，大多数数情况下下，仍是是F-。。F因子的存存在方式式及其相相互关系系（二）真真核微生生物基因因重组1、有性性杂交：：指性细细胞间的的接合和和随之发发生染色色体重组组，并产生新新遗传型型后代的的一种方方式。能能产生有有性孢子子者，均均可采用用有性杂杂交。2、准性性生殖：：类似于于有性生生殖但更更为原始始的一种种生殖方方式。可可使同一一生物的的两个不不同来源源的体细细胞经融融合后，，不通过过减数分分裂而导导致低频频率的基基因重组组。（二）真真核微生生物基因因重组1、有性杂杂交—酿酒酵母母：将甲、乙乙两个双双倍体亲亲本，分分别接种种到产孢孢培养基基(醋酸酸钠培养养基等)斜面上上，使其其产生子子囊，减减数分裂裂，形成成4个单单倍体子子囊孢子子。用蒸蒸馏水洗洗下子囊囊，经机机械法(加硅藻藻土和石石蜡油，，在匀浆浆管中研研磨)或或酶法(如蜗牛牛酶)破破环子囊囊，离心心，获得得子囊孢孢子，涂涂布平板板，培养养，得到到单倍体体菌落。。把两个个亲体的的不同性性别的单单倍体细细胞密集集接触在在一起，，有机会会出现双双倍体的的杂交后后代。双双倍体细细胞和单单倍体细细胞有很很大不同同,易于于识别。。（二）真真核微生生物基因因重组2、准性性生殖：：菌丝联结：：形态没有有区别,遗遗传性上上有差别的的两个同种种亲本的单单倍体体细细胞间发生生菌丝联结结。形成异核体体：联结后后,原有的的两个单倍倍体核集中中到同一个个细胞中,形成双相相异核体。。异核体能能独立生活活。核配：异核核体中的双双核偶尔可可以发生核核融合,产产生双倍体体杂合子核核。如构巢巢曲霉、米米曲霉核融融合频率为为10-5～10-7。某些理化化因素如樟樟脑蒸汽、、紫外线或或高温等的的处理,可可以提高频频率。（二）真核核微生物基基因重组体细胞交换换和单倍体体化：体细细胞交换即即体细胞中中染色体的的交换,也也称有丝分分裂交换。双倍体杂合合子性状极极不稳定,在其进行行有丝分裂裂过程中,其中极少少数核中的的染色体会会发生交换换和单倍体体化,从而而形成了极极个别具有有新性状的的单倍体杂杂合子。如如对双倍体体杂合子用用紫外线、、γ射线等进行行处理,就就会促进染染色体断裂裂、畸变或或导致染色色体在两个个子细胞中中分配不均均,因而有有可能产生生各种不同同性状组合合的单倍体体杂合子。。半知菌的准准性生殖示示意图第三节微微生物育种种目前，微生生物发酵已已由野生型型菌株发酵酵向代谢调调控发酵转转移。代谢调控发发酵：利用用遗传学原原理和方法法，在DNA水平人为地地改变和控控制微生物物代谢，使使目的产物物大量积累累的发酵。。关键之一：：选育从遗遗传角度解解除了微生生物正常代代谢机制的的突变株。。方法：主要要是诱变、、杂交、遗遗传工程等等。一、突变与与育种（一）、自自发突变与与育种：1、生产选选育：富于于实际经验验并且善于于细致观察察的人们在在日常生产产过程中，，发现自然然突变，选选育优良菌菌株。2、定向培育育：用某一一特定因素素长期处理理某一微生生物培养物物，同时不不断对它们们进行传代代，以达到到累积并选选择相应的的自发突变变体的一种种古老的育育种方法。。过程十分分缓慢，“守株待兔”。一、突变与与育种分离筛选步步骤1、采样（（土壤、食食品等）2、增殖培培养（数量量不足时））3、纯种分分离（稀释释、划线、、组织分离离等）4、纯培养养（扩大））5、生产性性能测定一、突变与与育种（二）、诱诱变育种：：利用物理理或化学诱诱变剂处理理均匀分散散的细胞群群，大幅度度提高突变变频率，通通过简便、、快速和高高效的筛选选，从中挑挑选符合育育种目的的的突变株。。发酵工业和和其他微生生物生产部部门使用的的高产菌株株，几乎都都是通过诱诱变育种而而大大提高高了生产性性能的。提提高产量、、改进质量量、扩大品品种和简化化生产工艺艺等，是使使用最广泛泛的育种手手段之一。。一、突突变与与育种种1、诱诱变育育种的的基本本结果果：以以高产产突变变株为为例--------诱变出出发发菌株株－－－{绝绝大多多数死死亡----------------------少数存存活{-多数未未变-多数负负变----------------------------少数突突变{-少数正正变少少数正正变{-多数幅幅度小小---------------------------------------少数幅幅度大大{多多数不不宜投投产少数适适宜投投产一、突突变与与育种种2、诱变育育种的的基本本路线线：确定出出发菌菌株→→纯化化选优优→性性能测测定→→同步步培养养→制制备单单细胞胞（单单孢子子）悬悬液→→活菌菌浓度度测定定→诱诱变剂剂选择择与剂剂量确确定预预试验验→诱诱变处处理→→平板板分离离→计计数（（变异异菌落落与突突变率率）→→挑取取疑似似菌落落纯培培养→→突变变体初初筛→→复筛筛→摇摇瓶发发酵试试验→→选出出突变变体→→生产产试验验或重重复诱诱变处处理（（详情情见教教材））一、突突变与与育种种3、诱变变育种种的原原则：挑选优优良的的出发发菌株株-处理单单孢子子(或单细细胞)悬液选择简简便有有效、、最适适剂量量的诱诱变剂剂--一、突突变与与育种种出发菌菌株是是用于于育种种的原原始菌菌株。。①选用用单倍体体纯种种，排排除异异核体体和异异质体体影响响；②采用优优良性性状菌菌株；；③选择对对诱变变剂敏敏感的的菌株株，或或改变变菌株株的遗遗传型型，提提高菌菌株敏敏感性性；④高产突突变往往往需需要逐逐步累累积，，有必必要多多选一一些经经过诱诱变的的菌株株为出出发菌菌株，，进行行多步步育种种，确确保高高产菌菌株的的获得得。一、突突变与与育种种诱变育育种必必须使使用均均匀状状态的的单细细胞悬悬液。。诱变变剂剂一一般般只只作作用用于于DNA双链链中中的的某某一一条条单单链链，，因因此此，，处处理理多多核核或或单单核核细细胞胞、、孢孢子子时时，，某某一一突突变变无无法法反反映映在在当当代代的的表表型型上上。。只只有有经经过过DNA复制制和和细细胞胞分分裂裂，，表表型型才才会会发发生生变变异异，，出出现现不不纯纯菌菌落落，，称称为为““表表型型延延迟迟””。。这这是是初初次次分分离离的的菌菌株株经经传传代代后后很很快快出出现现生生产产性性状状“衰退退”的主主要要原原因因。。诱变变霉霉菌菌或或放放线线菌菌稍稍加加萌萌发发的的孢孢子子；；芽芽孢孢杆杆菌菌的的芽芽孢孢(只有有一一个个核核质质体体)；细细菌菌对对数数期期诱诱变变处处理理效效果果较较好好。。一、、突突变变与与育育种种诱变变剂剂主主要要有有物物理理诱诱变变剂剂和和化化学学诱诱变变剂剂。。如如紫紫外外线线、、X射线线、、γ射线线和和快快中中子子等等；；烷烷化化剂剂、、碱碱基基类类似似物物和和吖吖啶啶类类化化合合物物。。最最常常用用的的烷烷化化剂剂有有N-甲基基-N′′-硝基基-N-亚硝硝基基胍胍(NTG)、甲基基磺磺酸酸乙乙酯酯(EMS)、甲基基亚亚硝硝基基脲脲(NMU)、硫酸酸二二乙乙酯酯(DES)、氮芥芥、、乙乙烯烯亚亚胺胺和和环环氧氧乙乙烷烷等等。。物理理诱诱变变剂剂剂剂量量：：强强度度××时时间间，，紫紫外外线线强强度度单单位位是是尔尔格格，，X射线线单单位位是是伦伦琴琴或或拉拉得得等等；；化化学学诱诱变变剂剂剂剂量量：：一一定定温温度度下下诱诱变变剂剂浓浓度度和和处处理理时时间间。。常常采采用用杀杀菌菌率率作作各各种种诱诱变变剂剂的的相相对对剂剂量量。。一、、突突变变与与育育种种诱变变剂剂的的作作用用：：①提高高突突变变频频率率；；②扩大大产产量量变变异异幅幅度度；；③使产产量量变变异异向向正正变变(提高高)或负变变(