免疫组织化学及相关技术之细胞培养的基本技术

细胞培养的基本技术（一）基本操作和要求1.培养前准备2.培养室和超净工作台的消毒无菌培养室：0.2%的新洁尔灭或2%～5%来苏儿拖地，紫外线照射消毒30～50min。超净工作台：台面用75%酒精擦洗，紫外线消毒30min。

其它：移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内，再经紫外线照射消毒。细胞培养的基本技术（一）基本操作和要求3.洗手和着装：工作服可经紫外线照射30min。4.无菌培养操作：布局合理、火焰烧灼动作准确敏捷不用手触及已消毒物品操作面布局合理操作保持一定顺序组织或细胞在未做处理前或培养液在未用前，勿过早暴露在空气中；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口。防止各种用液的交叉污染不向操作野讲话或咳嗽细胞培养的基本技术（二）原代培养：组织细胞在体外进行的首次培养。

1.组织块培养法

2.消化培养法1.组织块培养法细胞培养的基本技术2.消化培养法

原代培养取材过程中的注意事项：（1）取材要准确真正取到目的组织，而且要尽量剔除干净附带的其它组织成分或结构成分。（2）不同组织的取材及制备培养材料的步骤在具体操作过程中，需根据具体实验对象，调整基本步骤。（3）注意取材过程的速度、力度、温度、组织营养等。（4）无菌操作技术：无菌观念和无菌操作必须贯穿整个体外培养过程的始终。3.注意事项酶消化法的注意事项：

用胰蛋白酶溶液过度消化细胞也会对细胞造成较大伤害。因此，必须注意控制酶量（酶浓度）、作用时间长短以及酶处理温度。配制消化酶溶液时应注意使用适当的溶液（不含Ca2+、Mg2+），调节至合适的酸碱度。到底使用哪一种消化酶溶液，要根据拟解离组织的细胞外基质的具体构成成分而定。3.注意事项4.细胞纯化原代培养获得成分复杂的多种细胞复合物。如何从中获取单一的细胞类型，是细胞培养重要的过程。酶消化法机械刮除法差速粘附法密度梯度离心法流式细胞分选术

免疫磁珠分离术基本原理是利用磁珠作为携带抗体的载体。当磁珠上的抗体与相应的细胞或特异性抗原物质结合后，则形成抗原-抗体-磁珠免疫复合物，在磁铁磁力的作用下定向移动，使复合物与其他物质分离，而达到分离、浓缩、纯化细胞的目的.免疫磁珠分离术胶原、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸、层粘连蛋白、纤连蛋白等。多聚赖氨酸溶液的配制及包被方法多聚赖氨酸一般使用浓度为0.1~1mg/ml，可用Tris-HCl（0.15mol/L,pH8.4）缓冲溶液或蒸馏水配制，过滤除菌。将其加到培养瓶皿内（使用量以覆盖住生长表面为宜），过夜。再用无Ca2+、Mg2+BSS或PBS浸洗，使用前用培养液浸泡备用。5.生长基质（三）传代培养细胞培养的基本技术（三）传代培养细胞培养的基本技术吸除培养液消化前细胞加消化液消化后细胞吸除消化液加培养液终止消化吹打制成细胞悬液计数接种细胞培养的基本技术（四）细胞的冻存和复苏

保存一个细胞系或细胞株，是细胞培养中的重要工作。细胞可永久储存在液氮中(-196℃)。基本原则：慢冻快融，这样可以最大限度地减少细胞在冻存和复苏过程中的损害，保存细胞活力。细胞的冻存：保护剂：二甲基亚砜(DMSO)细胞培养的基本技术方法与过程：（1）选择指数生长期的细胞。在冻存前一天换一次培养液。（2）配制含10%DMSO的冻存培养液。（3）消化细胞，用冻存培养液吹打制成细胞悬液，移入冻存管并作好标记。（4）将冻存管放入4℃冰箱，约40min。（5）将冻存管置于-20℃冰箱，约30~60min。（6）将冻存管置于-80℃超低温冰箱中过夜。（7）将冻存管置于-196℃液氮罐中长期保存。注意事项：①DMSO不需要进行高压灭菌，因为它本身就有灭菌的作用，高压灭菌反而会破坏它的分子结构，降低冷冻保护效果。常温下DMSO对人体有害，故在配制时最好戴上手套操作。②不宜将冻存细胞放置在0℃～-60℃这一温度范围内过久，因为低温损伤主要发生在这一温度区内，这是“危险温区”。③注意定期检查液氮罐内液氮量，及时添加。细胞的冻存：细胞培养的基本技术2.细胞的复苏：复苏与冻存的要求相反，要快速融化。（1）将水浴锅预热至37℃。（2）从液氮罐中取出冻存管。迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中解冻（3）约1~2min后冻存管内液体完全溶解。取出冻存管，以1000rpm离心3min。（4）用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，放入超净台内。（5）吸弃上清液，向离心管内加入培养液，吹打制成细胞