低氧联合NaCl胁迫下蚕豆发芽富集γ

低氧联合NaCl胁迫下蚕豆发芽富集Y-氨基丁酸培养条件优杨润强;陈惠;顾振新【摘要】以蚕豆（启豆2号）为原料，研究了低氧联合NaCl胁迫下培养条件对Y-氨基丁酸（GABA）富集的影响。结果显示：非胁迫培养时间、培养pH和胁迫培养时间显著影响发芽蚕豆GABA积累。蚕豆发芽富集GABA最佳培养条件是非胁迫培养1.5d、培养液pH3.5和低氧联合NaCl胁迫4d，在此条件下其GABA含量可达1.06mg/gDW,为原料蚕豆的7.57倍。%Thecultureconditionof丫-aminobutyricacidaccumulationingerminatingfavabean（QiBean2）seedsunderhypoxiacombinedwithNaClwasinvestigated.Theresultsshowedthatnon-stressculturetime,pHandstresstimeimpactedtheaccumulationofGABAsignificantly.Theoptimumconditionwasculturingfor1.5days,pH3.5andstressfor4days.TheGABAcontentwas1.06mg/gDWandwas7.57-foldofthatinun-germinatedlavabean.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷)，期】2012(038)005【总页数】4页(P77-80)【关键词】蚕豆;发芽；Y-氨基丁酸;富集;低氧胁迫；NaC1胁迫【作者】杨润强;陈惠;顾振新【作者单位】南京农业大学食品科技学院，江苏南京210095；南京农业大学食品科技学院,江苏南京210095；南京农业大学食品科技学院，江苏南京210095【正文语种】中文【中图分类】S718.43蚕豆富含蛋白质、淀粉、氨基酸、维生素和矿物质等，是人体良好的营养来源。发芽是改善豆类种子营养成分和降低抗营养因子的有效方法。发芽能提高豆类生理活性物质的含量，如发芽可提高蚕豆中L-二羟苯丙氨酸(L-DOPA)和总酚［1］,尤其Y-氨基丁酸(GABA)含量［2］。GABA是一种非蛋白质氨基酸，具有降血压、降血脂等生理功能。植物在热击、冷害、机械损伤、盐胁迫和低氧等逆境胁迫条件下，均能强烈激活谷氨酸脱羧酶(GAD)和二胺氧化酶(DAO)活性，促进GABA的合成［3］。低氧胁迫下，植物细胞中H+浓度提高，导致细胞质酸化，为GABA的合成提供了条件［4］。盐胁迫可使细胞中Ca2+浓度升高，促使钙调蛋白(CaM)表达水平提高，GAD被Ca2+/CaM激活，从而促进GABA积累［5］。本文采用低氧联合NaCl胁迫的方式处理发芽蚕豆，探讨了培养条件对蚕豆发芽富集GABA的影响。通过正交试验对培养时间、pH和胁迫时间进行优化，确定最佳培养条件，为开发功能性蚕豆食品提供科学依据。蚕豆品种:启豆2号，购自江苏沿江地区农业科学研究所。蚕豆种子于2011年收获后密闭保存于4°C下聚乙烯容器中，备用。称取一定量蚕豆，用蒸馏水清洗后，1%的次氯酸钠消毒30min，蒸馏水洗净残留的次氯酸钠。于蒸馏水中30C浸泡8h，取出吸干表面水分，置于铺有2层纱布的托盘(长、宽、高分别为20cm、15cm和5cm)中，上面覆盖2层湿纱布，于33±1C避光培养。非胁迫培养:取30±2g经8h浸泡处理的蚕豆，置于铺有2层纱布的托盘(长、宽、高分别为20cm、15cm和5cm)中，上面覆盖2层湿纱布，分别避光培养0、0.5、1、1.5、2、2.5和3d后，测定GABA含量。pH:取30±2g经前期培养的蚕豆，置于具塞培养瓶中，加入pH值分别为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0和6.5的60mmol/LNaCl溶液250mL，参考Li等［6］的方法［(33±1)1，通气量为1.2L/min］避光培养4d。胁迫培养:取30±2g置于具塞培养瓶中，加入含有60mmol/L的NaCl溶液的柠檬酸缓冲液(pH3.5),于(33±1)°C下低氧胁迫0、1、2、3、4、5和6d。以培养时间、胁迫时间和pH为3个影响因素，各取3水平，进行L9(34)正交试验，研究发芽蚕豆中GABA含量变化，试验设计与结果见表。游离氨基酸:采用水合茚三酮显色法测定［8］。称取1.0g鲜重的发芽蚕豆于研钵，加5mL7%的乙酸研磨成浆。按照Bai等［7］的方法对样品进行纯化。浆液静置提取1h,6000r/min离心15min取上清液，加入5ml无水乙醇，在0~4C放置2h，以沉淀多糖和杂蛋白;之后6000r/min离心20min。上清液在0.1MPa,45C条件下真空干燥，残余物溶于2mL1MNaHCO3(pH9.0)缓冲溶液，4000r/min离心10min，上清液备用。GABA测定采用高压液相色谱HPLC(Agilent1200,USA),色谱柱为ZORBAXEclipseAAAreversed-phasecolumn(3.5pm),4.6x150mm,条件参照Yang等［8］的方法。取1mL(pH9.0)氨基酸溶液，加入2mg/mL的二甲氨基苯磺酰氯的丙酮溶液1mL,于67C保温10min后用冰浴终止反应，然后使用DAD检测器于425nm紫外检测。流动相A为乙睛，流动相B为0.045MCH3COONa(pH4)缓冲液，上样量为20pL,流速为1mL/min，分离时间30min，柱度30C。试验设3次重复，结果换算成干基重，以平均值士SD表示，数据采用SPSS(18.0)软件处理，设置显著性水平为P<0.05。如图1所示，随非胁迫培养时间的延长，蚕豆中GABA含量呈先增加后减少的趋势，培养1.5d时，发芽蚕豆中GABA含量达到最大值（1.02mg/gDW），为0d的3.43倍。因此，选择培养时间1.5d为后续试验的非胁迫培养时间。由图2可知，随着发芽蚕豆培养液pH值的升高，GABA含量呈先下降后上升的变化趋势。培养液pH值为3.0时，蚕豆GABA含量最高;但由于此pH条件下蚕豆发芽率很低，蚕豆生命活动很弱，从而容易腐烂或有异味。因此，选择pH值3.5作为后续试验缓冲液pH值。胁迫时间对GABA含量的影响见图3。GABA含量随胁迫时间的延长先逐渐增加后趋于平衡。当胁迫4d时，GABA含量达到最大值（1.02mg/gDW），此后，其含量趋于平衡。因此，选择4d为后续试验所需的胁迫时间。选取单因素试验得到的发芽蚕豆富集GABA最佳培养时间、培养pH和胁迫时间为中间值，以培养时间（0.5d、1.5d和2.5d）、培养pH（3.5、4.0和4.5）和胁迫时间（2d、4d和6⑴进行3因素3水平正交试验，实验结果见表1。表1极差分析结果表明，各因素对发芽蚕豆中GABA含量影响的主次顺序为C、A、B，即培养胁迫时间〉培养时间＞pH。比较各水平的K值可知，发芽蚕豆富集GABA的最佳培养条件为A2B1C2，即培养时间1.5d、培养pH3.5和胁迫时间4d（表中第4组）。植物受到低氧、冷激、干旱、盐胁迫和机械伤害等逆境胁迫时，体内GABA含量显著增加[9],其中低氧和盐胁迫是富集GABA最安全有效的方法。但由于低氧和盐胁迫均为逆境，若直接将植物种子置于其中，势必长势不佳，因此最有效的方法是先将植物种子正常培养一段时间，之后置于低氧和盐胁迫等逆境中进行胁迫培养。因此，本研究采用此培养方法研究低氧联合NaCl胁迫下培养条件对蚕豆GABA富集的影响。植物中GAD的最适反应pH值通常在5.5~6.0之间[10],说明植物体内GAD在微酸性环境下活性高。Carroll等［11］研究表明，酸性环境激活了胡萝卜细胞的GAD活性，导致GABA积累，当胞质pH恢复正常后GAD活性降低。Crawford等［12］研究发现，夕卜源加入透膜性弱酸15s后，芦笋叶肉细胞出现GABA的积累。这些实验为植物细胞质pH值变化影响GABA合成提供了证据。由于植物体内L-Glu脱羧，造成反应体系pH升高，偏离了GAD的最适pH，使GABA富集速度下降。将反应置于缓冲体系中，可以稳定反应的pH值，提高GABA产量。白青云［13］研究表明，缓冲液类型影响GABA富集，柠檬酸缓冲液培养的粟谷生长情况良好，而醋酸缓冲液粟谷芽生长受到抑制。粟谷富集GABA的最适pH值为5.8，与GAD的最适pH值相近。李岩［6］则采用pH3.19的柠檬酸-磷酸缓冲液富集蚕豆GABA。本研究选择更安全可靠的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液进行GABA的富集研究。结果表明，培养pH3.5时，蚕豆生长良好，GABA的富集量达到1.02mg/gDW。此pH值明显低于大豆(pH4.1)［14］、糙米(pH5.6)［15］和粟谷(pH5.8)［16］。这是由于蚕豆子叶厚实、籽粒较大，因此外界环境中pH值必须足够低才能维持体内低pH条件。低氧联合NaCl胁迫下，培养时间、培养pH和胁迫时间显著影响发芽蚕豆GABA积累，并且三者对GABA含量影响的顺序是:培养pH＞培养时间〉胁迫时间。KeywordsFavabean,germination,y-aminobutyricacid,accumulation,hypoxiastress,NaClstress【相关文献】［1］RandhirR,ShettyP,ShettyK.L-DOPAandtotalphenolicstimulationindarkgerminatedfavabeaninresponsetopeptideandphytochemicalelicitors［J］.ProcessBiochemistry,2002,37(11):1247-1256.［2］Martinez-VillaluengaC,KuoYH,LambeinF,etal.Kineticsoffreeproteinaminoacids,freenon-proteinaminoacidsandtrigonellineinsoybean(GlycinemaxL.)andlupin(LupinusangustifoliusL.)sprouts[J].EuropeanFoodResearchandTechnology,2006,224(2):177-186.XingSG,JunYB,HauZW,etal.Higheraccumulationofgamma-aminobutyricacidinducedbysaltstressthroughstimulatingtheactivityofdiarnineoxidasesinGlycinemax(L.)Merr.roots[J].PlantPhysiologyandBiochemistry,2007,45(8):560-566.PerataP,VernieriP,ArmelliniD,etal.Immunologicaldetectionofacetaldehyde-proteinadductsinethanol-treatedcarrotcells[J].PlantPhysiology,1992,98(3):913-918.KinnersleyAM,TuranoFJ.Gammaaminobutyricacid(GABA)andplantresponsestostress[J].CriticalReviewsinPlantSciences,2000,19(6):479-509.LiY,BaiQ,JinX,WenH,etal.Effectsofcultivarandcultureconditionsony-aminobutyricacidaccumulationingerminatedfavabeans(ViciafabaL.)[J].JournaloftheScienceofFoodandAgriculture,2010,90(1):52-57.BaiQ,FanG,GuZ,etal.Effectsofcultureconditionsongamma-aminobutyricacidaccumu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