分子遗传学8章基因操作技术及其应用

第八章基因操作技术及其应用分子遗传学8章基因操作技术及其应用共55页，您现在浏览的是第1页!一、重组DNA技术二、PCR技术三、基因文库及分子杂交技术分子遗传学8章基因操作技术及其应用共55页，您现在浏览的是第2页!克隆(clone)---无性繁殖分子克隆–DNA的无性繁殖技术重组DNA技术的重大突破带动了现代生物技术的兴起，并很快产生了许多生命科学的高技术产业二、重组DNA技术是基因工程的核心技术一、重组DNA技术重组DNA技术，又称为基因克隆或分子克隆技术。它是基因工程的核心技术。分子遗传学8章基因操作技术及其应用共55页，您现在浏览的是第3页!应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(rebinantDNA)。

DNA克隆定义分子遗传学8章基因操作技术及其应用共55页，您现在浏览的是第4页!（1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因组DNA文库，从中钓取目的基因。（2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段，建立全长cDNA文库或EST文库；从文库直接筛选所需基因。（3）根据同源克隆等原理克隆需要的目的基因片段。（4）直接化学合成。(一)、获得目的基因的方法：分子遗传学8章基因操作技术及其应用共55页，您现在浏览的是第5页!根据其来源命名。如：

属名

菌株名

EcoRI

种名

编号EcoRI来源于大肠杆菌E.coli的RY13菌株,I指在该菌株中分离的个限制酶。命名分子遗传学8章基因操作技术及其应用共55页，您现在浏览的是第6页!不论DNA的来源如何，同一种限制酶切割后产生的粘性末端容易重新连接。因此可将不同种属的DNA重组。如人和质粒DNA等。用于人类基因组的DNA分析，具特定的酶切位点。Gene突变改变酶切位点的消失或新产生将改变酶切片段长度。应用于限制性片段多态性分析。根据上述限制酶的特点，在基因工程和基因诊断中的重要用途：分子遗传学8章基因操作技术及其应用共55页，您现在浏览的是第7页!克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。分子遗传学8章基因操作技术及其应用共55页，您现在浏览的是第8页!1.质粒(plasmid)分子遗传学8章基因操作技术及其应用共55页，您现在浏览的是第9页!3.柯斯质粒(cosmidvector)：粘粒

是将质粒和λ噬菌体改建的一种载体.它含COS序列,插入一小plasmid–而得名Cosmid。改建后的粘粒含有λ噬菌体的复制起点和cos末端，全长8kb。可感染大肠杆菌。大片段外源DNA插入后，在体外包装进而被克隆。可包装30~50kb长的DNA片段，多用于基因文库构建。

分子遗传学8章基因操作技术及其应用共55页，您现在浏览的是第10页!（四）、外源DNA片断和载体的连接1.粘性末端连接方式：(1)同一限制酶切位点连接

(2)不同限制酶切位点连接配伍末端连接非配伍末端连接分子遗传学8章基因操作技术及其应用共55页，您现在浏览的是第11页!不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接EcoRⅠ切割位点Bg

lⅡ切割位点+EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切T4

DNA连接酶15ºC重组体配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。分子遗传学8章基因操作技术及其应用共55页，您现在浏览的是第12页!目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组体载体自连目的基因自连分子遗传学8章基因操作技术及其应用共55页，您现在浏览的是第13页!5´3´3´5´载体DNA5´3´3´5´目的基因限制酶或机械剪切限制酶5´3´3´5´5´3´T(T)nT

T(T)nT3´5´5´

3´3´5´5´3´A(A)nA

A(A)nA3´5´λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端转移酶+dATP末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA连接酶15ºC重组体分子遗传学8章基因操作技术及其应用共55页，您现在浏览的是第14页!人工接头及其应用CCGAATTCGGGCTTAAGC5´-3´-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ分子遗传学8章基因操作技术及其应用共55页，您现在浏览的是第15页!转染（infection）：是特殊形式的转化，是离体状态的完整的病毒噬菌体DNA/RNA感染受体菌而引起的后者遗传型和表型发生的变化。转导（transduction）：当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用。转化（transformation）通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用。分子遗传学8章基因操作技术及其应用共55页，您现在浏览的是第16页!四环素标记筛选抗药标记分子遗传学8章基因操作技术及其应用共55页，您现在浏览的是第17页!重组DNA技术操作过程总结：分分离目的基因切限制酶切目的基因与载体接拼接重组体转转入受体菌筛筛选重组体分子遗传学8章基因操作技术及其应用共55页，您现在浏览的是第18页!1)原理：模拟体内DNA复制条件，应用DNA聚合酶反应，特异性扩增某一DNA片段。2)反应体系：DNA模板，引物，dNTP，TaqDNA聚合酶，buffer3)反应程序：

变性

(94~95oC)

退火

延伸

(37~55oC)(70~72oC)72oC延伸10min30-35cycles

DNA扩增100万倍分子遗传学8章基因操作技术及其应用共55页，您现在浏览的是第19页!PCR特点及应用优点：（1）特异性强、灵敏度高、稳定可靠、快速；

（2）微量的模板DNA即可扩增大量产物。应用：（1）基因组DNA分析；

（2）遗传物质的鉴定；

（3）遗传病的诊断。缺点：（1）需靶DNA序列的信息；

（2）产物短小，DNA复制不精确。分子遗传学8章基因操作技术及其应用共55页，您现在浏览的是第20页!基因组DNA文库（genomicDNAlibrary）将某一基因组DNA用适当的限制酶切断后，与载（质粒或噬菌体）体DNA重组，再全部转化宿主细胞，存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合称为G文库（一）、基因文库分子遗传学8章基因操作技术及其应用共55页，您现在浏览的是第21页!限制酶切位点限制酶消化除去中间片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色体DNA限制酶部分消化外源DNA与载体DNA混合连接反应体外包装用重组噬菌体感染大肠杆菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文库分子遗传学8章基因操作技术及其应用共55页，您现在浏览的是第22页!组织或细胞RNA提取反转录cDNA(doublestrand)克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌受体菌cDNA文库构建流程图分子遗传学8章基因操作技术及其应用共55页，您现在浏览的是第23页!（二）、分子杂交技术

分子杂交（molecularhybridization）：标记的探针DNA变性后与变性后的靶DNA/RNA通过碱基互补配对结合，形成杂种分子的过程。分子杂交包括：

DNA-DNA杂交（Southernblot）;

DNA-RNA杂交（Northernblot）;

蛋白-蛋白杂交（Westernblot）。

分子遗传学8章基因操作技术及其应用共55页，您现在浏览的是第24页!NickTranslationOHpOH+PPDNAdNTP，DNA酶I，DNA聚合酶I32P-dNTP

Bio-dNTP分子遗传学8章基因操作技术及其应用共55页，您现在浏览的是第25页!DNA末端标记分子遗传学8章基因操作技术及其应用共55页，您现在浏览的是第26页!Southernblot分子遗传学8章基因操作技术及其应用共55页，您现在浏览的是第27页!2、Northernblot原理和步骤提取T、Cell总RNA

提纯分离mRNA凝胶电泳分离RNA变性转移至尼龙膜杂交洗膜、放射自显影、结果分析分子遗传学8章基因操作技术及其应用共55页，您现在浏览的是第28页!3、Westernblot原理和步骤提取T、Cell蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白变性转移至尼龙膜抗体杂交分子遗传学8章基因操作技术及其应用共55页，您现在浏览的是第29页!（1）获得目的基因；（2）与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子；（3）用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；（4）对转化子筛选和鉴定；（5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。重组DNA操作一般步骤：分子遗传学8章基因操作技术及其应用共55页，您现在浏览的是第30页!(二)、限制酶的发现和应用则是DNA重组的关键限制性内切核酸酶(restrictiveendonucle-ases)，又称限制酶。是识别并特异性地切割双链DNA序列的一种核酸内切酶。（“分子手术刀”）发现于原核生物体内，现已分离出100多种，几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组DNA技术和基因诊断中重要的一类工具酶。限制酶（“基因剪刀”）

分子遗传学8章基因操作技术及其应用共55页，您现在浏览的是第31页!每种限制酶能识别和切割的通常4~8个核苷酸序列，称为限制性位点（restrictionsites）或切点。（回文结构）

如：HareIII5’-GGCC-3’

3’-CCGG-5’

BamHI5’-GGATCC-3`3’-CCTAGG-5’

平末端(bluntend)对称轴切，连接效果差切割形式

粘性末端（stickyend）交错切切割形式

分子遗传学8章基因操作技术及其应用共55页，您现在浏览的是第32页!载体（Vector）:将外源目的DNA导入受体细胞，并能自我复制和增殖的工具。（三）、基因转运载体及其选择常用载体：质粒、噬菌体、粘粒、大片段克隆载体（BAC，YAC等）。分子遗传学8章基因操作技术及其应用共55页，您现在浏览的是第33页!1、能自主复制；且插入外源DNA后，不影响其复制能力；2、具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；3、有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；4、分子量小，以容纳较大的外源DNA；5、具生物安全性。载体的选择标准分子遗传学8章基因操作技术及其应用共55页，您现在浏览的是第34页!2.λ-噬菌体(λphage)置换λ载体

–溶解途径载体和外源DNA整合到宿主菌DNA中。可克隆23kb的外源DNA。插入载体

–裂解途径

DNA在宿主细胞中复制，然后包装成噬菌体，裂解宿主，释放噬菌体。可克隆5kb的cDNA。

是一种可在体外包装的细菌病毒,可高效感染大肠杆菌。λ-噬菌体DNA是线状双链DNA分子，全长约50kb，每条链各带12bp长的单链互补末端-粘末端(COS序列)。进入宿主细胞后不久，COS序列碱基配对环化。可包装37~52kbDNA分子。

改建后的λ噬菌体发展了多种较大型的克隆载体，如：分子遗传学8章基因操作技术及其应用共55页，您现在浏览的是第35页!4.其他载体：大片段DNA克隆载体细菌人工染色体

(bacterialartificialchromosome,BAC)

约300kb噬菌体PI人工染色体（PIartificialchromosome,PAC）约100kb酵母人工染色体

(yeastartificialchromosome,YAC)200kb—2000kb动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）分子遗传学8章基因操作技术及其应用共55页，您现在浏览的是第36页!BamHⅠ切割反应

GGATCCCCTAGGT4

DNA连接酶15ºCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割载体DNA用BamHⅠ切割重组体载体自连目的基因自连同一限制酶切位点连接分子遗传学8章基因操作技术及其应用共55页，您现在浏览的是第37页!2.平端连接适用于：限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端分子遗传学8章基因操作技术及其应用共55页，您现在浏览的是第38页!3.同聚物加尾连接在末端转移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。分子遗传学8章基因操作技术及其应用共55页，您现在浏览的是第39页!4.人工接头(linker)连接由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。

分子遗传学8章基因操作技术及其应用共55页，您现在浏览的是第40页!受体菌条件安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态(petent)导入方式转化(transformation)转染(transfection)感染(infection)（五）重组DNA导入受体菌感受态细胞：受体细胞经处理后处于最适摄取和容忍重组体的状态。分子遗传学8章基因操作技术及其应用共55页，您现在浏览的是第41页!（五）重组体的筛选(1)抗药性标记选择(2)标志补救(markerrescue)(3)分子杂交法原位杂交Southernblot分子遗传学8章基因操作技术及其应用共55页，您现在浏览的是第42页!蓝白斑筛选标志补救分子遗传学8章基因操作技术及其应用共55页，您现在浏览的是第43页!三、PCR技术：聚合酶链式反应

（polymerasechaineaction,PCR

）KaryB.Mullis1993，KaryB.MullisPCR是模拟体内DNA复制条件，应用DNA聚合酶反应，特异性扩增某一DNA片段的技术。体外程序化的DNA合成技术。分子遗传学8章基因操作技术及其应用共55页，您现在浏览的是第44页!分子遗传学8章基因操作技术及其应用共55页，您现在浏览的是第45页!四、基因文库与分子杂交技术（一）、基因文库基因组文库cDNA文库（一）、基因文库Southernblot（二）、分子杂交技术NorthernblotWesternblot分子遗传学8章基因操作技术及其应用共55页，您现在浏览的是第46页!组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组文库构建流程图分子遗传学8章基因操作技术及其应用共55页，您现在浏览的是第47页!cDNA文库(cDNAlibrary)

以某种细胞的全部mRNA为模板，利用逆转录酶合成与mRNA互补的DNA（cDNA）再复制成