卫生指标菌的检测OK

第五章卫生指标细菌的检验

12/14/20221卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第1页!节食品中菌落总数的测定12/14/20222卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第2页!一、菌落总数概念：是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后,单位质量（g）、容积（mL）或表面积（cm2）内所形成的好氧或兼性厌氧细菌菌落的总数。

是活菌计数，需氧菌数；不代表实际所有的细菌总数。12/14/20223卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第3页!三、菌落总数测定的方法※平板倾注法＃平板表面涂布法平板表面点滴法12/14/20224卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第4页!检验步骤(程序)：12/14/20225卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第5页!（一）样品稀释及做平板12/14/20226卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第6页!（二）培养倒放平板普通食品：36℃±1℃48h±2h水产品:30℃±1℃72h±3h如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的平板计数琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4mL），凝固后翻转平板，按上步条件进行培养。12/14/20227卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第7页!1、菌落的选择（1）单个菌做一个菌落计（2）呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算。（3）如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。12/14/20228卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第8页!式中：N——样品中菌落数；ΣC——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；n1——稀释度（低稀释倍数）平板个数；n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；d——稀释因子（稀释度）。12/14/20229卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第9页!（2）如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告（3）如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告（4）如菌落数有的大于300，有的又小于30，不在30～300之间，以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告（5）如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告。

12/14/202210卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第10页!12/14/202211卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第11页!6、为防止细菌增殖产生片状菌落，在检液加入平皿后，应在20min倾入琼脂，并立即使之与琼脂混合均匀。(在平面上先左右摇动，后顺时针和逆时间旋转)7、加入平皿内的检样稀释液有时带有检样颗粒，需加做平皿放在4℃的环境中，以便计数时排除颗粒的影响。8、稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，不可作为检样计数报告的依据。(四)检验注意事项12/14/202212卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第12页!第二节食品中大肠菌群的检验12/14/202213卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第13页!属代表种致病性埃希氏菌属（Escherichia）大肠埃希氏菌(E.coli)

肠道外感染，急性腹泻志贺氏菌属（Shigella）痢疾志贺氏菌(Sh.dysenteriae)细菌性痢疾爱德华氏菌属（Edwardsiella）迟纯爱德华氏菌(E.tarda)蛇类等血动物的正常肠道寄居菌，偶见于健康人或腹泻者粪便内沙门氏菌属（Salmonella）伤寒沙门氏菌(S.typhi)肠热症、急性肠炎、败血症枸橼酸杆菌属(Citrobacter)弗劳地氏枸橼酸杆菌(C.freundii)条件致病菌，引起继发性感染克雷伯氏菌属(Klebsiella)肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)肺炎，泌尿系、创伤感染败血症等阴沟肠杆菌(Enterobacter)产气杆菌(E.aerogenes)很少引起原发性感染哈夫尼亚菌属(Hafnia)蜂窝啥夫尼亚菌(H.alvei)

对人无致病性沙雷氏菌属(Serrati)粘质沙雷氏菌(S.marcescens)条件致病菌，引起泌尿系，呼吸道及创伤感染变形杆菌属(Proteus)普通变形杆菌(P.vulgaris)食物中毒，泌尿系、呼吸道感染等耶尔森氏菌属(Yersinia)

鼠疫耶尔森氏菌(Y.pestis)鼠疫欧文氏菌属(Erwinia)草原居民欧文氏菌(E.herbicola)

植物寄生菌，曾从人体肠道及化脓扁桃体中分离到12/14/202214卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第14页!2、以大肠菌群作为粪便指标菌原因在粪便中数量最大；在外环境中存活的时间与致病菌大体相同；检测方法简便容易。二、大肠菌群检验的卫生学意义12/14/202215卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第15页!三、大肠菌群的生物学特性1.形态与染色：革兰氏染色阴性，无芽胞杆菌。2.发酵乳糖产酸产气

3.培养特性：在EMB琼脂上的典型菌落:呈深紫黑色或中心深紫色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，常有金属光泽；在麦康凯琼脂上的典型菌落:呈桃红色或中心桃红、圆形，扁平，光滑湿润。12/14/202216卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第16页!麦康凯琼脂平板Ageofcultureis24h呈桃红色或中心桃红、圆形，扁平，光滑湿润12/14/202217卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第17页!GB4789.3-2010月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LaurylSulfateTryptose，LST）肉汤煌绿乳糖胆盐（BrilliantGreenLactoseBile，BGLB）肉汤12/14/202218卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第18页!MPN法简介TheMostProbableNumberMethod12/14/202219卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第19页!检样稀释处理EMB等革兰氏染色乳糖发酵管革兰氏阴性无芽胞产气革兰氏阳性大肠杆菌阴性大肠杆菌阴性报告不产气乳糖胆盐发酵管产气不产气大肠杆菌阴性报告报告报告大肠杆菌阳性三步法简介12/14/202220卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第20页!第三节粪大肠菌群的检验粪大肠菌群：是大肠菌群的一种，又称为耐热大肠菌群，是指一群需氧及兼性厌氧，在44.5℃培养24h内能发酵乳糖产酸产气和分解色氨酸产生靛基质的革兰氏阴性无芽胞杆菌。12/14/202221卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第21页!粪大肠菌群检验程序12/14/202222卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第22页!1、从制备样品匀液至稀释完毕,全过程不得超过15min。2、对产酸但未看到气泡的乳糖发酵，用手轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，应考虑可能有气体产生，应作进一步试验。

3、不可用其他胆盐代替指定的胆盐。六、检验注意事项12/14/202223卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第23页!大肠杆菌检验的卫生学意义多数为肠道正常菌群，并产生有益的作用；直到20世纪中叶，才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有致病性，它们能引起食物中毒，统称为致病性大肠杆菌；大肠杆菌学用作受粪便污染的重要指标；存活时间与一些常见的肠道病原菌接近，它们的出现可能预示首某些肠道疾病的病原菌存在，如志贺氏菌、沙门氏菌等。12/14/202224卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第24页!12/14/202225卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第25页!第五节大肠菌群快速检验食品大肠菌群快速检验方法：LTSE法TTC显色法；DC试管法；纸片法。12/14/202226卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第26页!LTSE检验程序P17812/14/202227卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第27页!（三）DC法

(去氧胆酸钠半固体法)P183~18512/14/202228卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第28页!（一）食品饮料大肠菌群快速检验纸片

使用方法：1.样品稀释同国标法2.接种：饮料和饮用水采用原液、1:10、1:100三个稀释度，固体食品采用1:1、1:10和1:100三个稀释度。用1mL灭菌吸管吸取1mL同一稀释度的稀释液均匀涂布到袋中的纸片上，做三个重复。12/14/202229卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第29页!（二）餐具大肠菌群快速检验(纸片法)使用方法：1.

采样6—10份。碗、盘、杯等每份贴纸片两张，用无菌生理盐水湿润纸片后，立即贴于食具内侧表面，30s后取下，置于原塑料袋内。筷子以5只为一份样品，用吸管吸取生理盐水湿润纸片后，立即将筷子进口端（约5cm）抹拭两张，放入原塑料袋内。12/14/202230卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第30页!食品冷饮大肠菌群检验纸片

冷饮、乳制品和调味品等大肠菌群的测定12/14/202231卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第31页!餐具大肠菌快速检验纸片

餐具卫生消毒效果检测12/14/202232卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第32页!实例：水的大肠菌群检验大肠菌群MPN/100mL细菌总数CFU/mL

生活饮用水

≤3/L＜100

瓶装饮用纯净水

≤3

≤20

饮用天然矿泉水罐装产品0＜50地面水质量标准

＜10000个/L

准备加氯消毒后供饮用的水≤1000准备加氯消毒后供饮用的水≤10000游泳池水≤100＜100012/14/202233卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第33页!（二）、生活饮用水或食品生产用水的检验（大肠菌群）

各加10ml各加100ml水样初发酵三料乳糖胆盐50毫升装三料乳糖胆盐5毫升装EMB分离36℃培养24h复发酵乳糖发酵镜检36℃培养24h12/14/202234卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第34页!（三）、瓶装矿泉水的检验

（大肠菌群）

原水样双料乳糖胆盐发酵管10毫升装37℃培养24h产酸产气者亮绿乳糖胆盐发酵管37℃培养48h产酸产气者查表报告各加入10ml水样12/14/202235卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第35页!(四)、水源水的检验接种量严重污染水：1、0.1、0.01、0.001ml各1份总量：1.111ml中度污染水：10、1、0.1、0.01ml各1份总量：11.11ml轻度污染水：100、10、1、0.1ml各1份总量：111.1ml12/14/202236卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第36页!LST肉汤月桂基硫酸钠的作用是抑制革兰氏阳性球菌，同乳糖胆盐培养基中的胆盐作用是一样的。12/14/202237卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第37页!EMB平板照片及原理12/14/202238卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第38页!二、菌落总数测定的意义1、判定食品被细菌污染的程度及卫生质量。2、了解细菌在食品中的繁殖动态。3、预测食品贮藏期限的长短。12/14/202239卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第39页!四、平板倾注法测定菌落总数

GB4789.2-2010原理：样品经过稀释后，使样品悬液中的细菌分期存在，接种一定量（一般为1mL）到培养基中，再加入适量的培养基，充分混匀。从理论上讲，微生物在培养基中分散呈单个存在，一个菌体长出一个肉眼可见的菌落。12/14/202240卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第40页!（一）样品稀释及做平板1ml1ml1ml1ml1:101:10001:1001:100001ml1ml1ml加入46℃营养琼脂15~20mL25g/ml样品生理盐水12/14/202241卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第41页!

检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min，以防止细菌有所死亡或繁殖。

12/14/202242卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第42页!（三）计数和报告

到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于0~4℃，但不得超过24h。12/14/202243卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第43页!2、平板菌落计数的选择(1)

选取菌落数在30～300之间的平板（SN标准要求为25～250个菌落）若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）样品中菌落总数结果。若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算：12/14/202244卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第44页!注意：旧版标准的做法为：比值小于或等于2取平均数，比值大于2则其较小数字12/14/202245卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第45页!3、菌落数的报告菌落数在1～100时，按“四舍五入”原则，以整数报告；如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。固体检样以克（g）为单位报告，CFU/g;液体检样以毫升（mL）为单位报告，CFU/mL;表面涂擦则以平方厘米（cm2）报告，CFU/cm2;。

12/14/202246卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第46页!(四)检验注意事项1、对照平板出现几个菌落时，要追加对照平板；2、吸管进出瓶子或试管时，吸管口不得触及瓶口、管口的外围部分；3、吸管插入试样液内的深度不得小于2.5cm,调整时要使管尖与容器内壁紧贴;4、进行稀释时,吸管口不得与稀释液接触;5、检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min.12/14/202247卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第47页!复习题1、什么是菌落总数？2、测定食品、饮料等产品的菌落总数有什么意义？3、画出平板倾注法测定菌落总数的示意图。4、在测定菌落总数时，如何选择菌落进行计数？5、在菌落总数的检验中，要注意哪些事项？6、在菌落总数的检验中，如何根据样品的特性选择培养温度和时间？12/14/202248卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第48页!一、大肠菌群

1、

什么是大肠菌群？

指一群在37℃能分解乳糖产酸、产气，需氧及兼性厌氧的革兰氏染色阴性无芽胞杆菌。2、大肠菌群的组成:大肠埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属(又叫产气杆菌属，包括阴沟肠杆菌和产气肠杆菌)、克雷伯氏菌属的一部分和沙门氏菌属的第III亚属。12/14/202249卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第49页!1、粪便污染的指标菌：可作为粪便污染的指标有：大肠杆菌、粪链球菌、产气荚膜梭菌；大肠杆菌更适合作为指标菌，但该菌群可因环境而导致菌型的改变；大肠杆菌检验方法繁杂，且并不确切；大肠菌群是更合适的指标菌。二、大肠菌群检验的卫生学意义12/14/202250卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第50页!（1）判断食品中否受到粪便污染。（2）有利于控制肠道传染病的发生和流行。（3）有利于控制食品在生产加工、运输、保存等过程中的卫生状况。3、大肠菌群检验的意义二、大肠菌群检验的卫生学意义12/14/202251卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第51页!EMB平板照片及原理呈深紫黑色或中心深紫色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，常有金属光泽12/14/202252卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第52页!四、大肠菌群检验方法及操作方法国家标准(2003版)：三步法：乳糖胆盐发酵试验→分离培养→证实试验(乳糖发酵试验)

行业标准：两步法：推测试验→证实试验国家标准(2010版)：两步法：LST发酵→BGLB复发酵12/14/202253卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第53页!大肠菌群检验中常用的抑菌剂胆盐、洗衣粉、SDS、煌绿、结晶紫、孔雀绿等。我国常用胆盐作为抑菌剂，猪、牛、羊3种胆盐检验效果无差别。3号胆盐、混合胆盐、去氧胆酸钠、兔胆盐会影响大肠菌群的检验结果。用量、品牌、规格会影响结果。12/14/202254卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第54页!12/14/202255卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第55页!1:1001:10各加入1ml各加入10ml各加入1ml单料乳糖胆盐发酵管单料乳糖胆盐发酵管双料乳糖胆盐发酵管初发酵检样稀释检样量1g/ml检样量0.1g/ml检样量0.01g/mlEMB分离培养证实试验乳糖发酵管镜检查MPN表报告结果12/14/202256卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第56页!表1粪大肠菌群在几种常用分离培养上的菌落特征培养基菌落特征伊红兰培养基(EMB)紫黑色、有金属光泽，紫黑色、不带或略带光泽，淡紫红色、中心紫黑色、黑红或深紫红色品红亚硫酸纳(远藤氏平板)紫红色、有金属光泽，深红色、不带或略带金属光泽，淡红色、中心较深中国兰平板深蓝色，浅蓝色、中心深蓝色麦康凯平板(MacC)桃红色，粉红色、中心桃红色12/14/202257卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第57页!12/14/202258卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第58页!第四节食品中大肠杆菌计数大肠杆菌（Escherichiacoli），学名大肠埃希氏菌，被归为肠杆菌科，属于埃希氏菌属，革兰氏阴性短杆菌，能在44.5℃发酵乳糖、产酸、产气，IMViC生化试验为++--，或为-+--。12/14/202259卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第59页!检验程序：靛基质(I)、甲基红(M)、VP(Vi)、柠檬酸盐(C)++---+--12/14/202260卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第60页!复习题1、什么是大肠菌群？大肠菌群由哪些微生物组成？2、测定食品、饮料等产品的大肠菌群数有什么意义？3、大肠菌群具有哪些生物学特性？4、在大肠菌群数的检验中，要注意哪些事项？5、在水的大肠菌群数检验中，如何进行水样的采集？12/14/202261卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第61页!(一)LTSE法LTSE培养基(Lactose-Tryptone-SodiumDodecylsulfate-TraceElements，LTSE)：P180原理：不同细菌以不同的途径分解糖类，在其代谢过程中产生了丙酮酸及转变为各种酸类，大肠菌群能分解乳糖，由于具有甲酸解氢酶作用于甲酸，产生H2和CO2气体，因此气体的产生是在产酸的同时进一步分解酸而形成的。据次将样品接种到LTSE培养基肉汤内15h，观察有无气体产生，然后加氧化酶试验和涂片革兰色镜检结果综合判断是否有大肠菌群的存在。

12/14/202262卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第62页!(二)TTC法

(氯化三苯四氮唑快速显色法)P18112/14/202263卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第63页!（四）纸片法P185~18612/14/202264卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第64页!3.培养：将接种好的纸片轻轻压平（可叠放），在36℃下培养15－24h观察结果。4.结果判定:纸片上出现紫红色斑点,其周围有黄圈者,为阳性.纸片为一种着色,无菌落生长者为阴性.纸片呈紫兰色,有紫红色斑点，其周围地黄圈者阴性.酸性食品接种后,纸片变黄,经培养后无紫红色斑点为阴性12/14/202265卫生指标菌的检测OK共74页，您现在浏览的是第65页!2.将已采样的纸样置于37°C培养15h.纸片在黄色背景上出现红色斑点为阳性，纸片在紫兰色背景上呈现红色斑点，但周围没有黄晕均为大肠菌群阴性。同一份样