微生物102、3第十章微生物的遗传变异和育种课件

第十章微生物的遗传变异和育种

第十章微生物的遗传变异和育种1第二节基因突变与自然选育第二节基因突变与自然选育2突变是工业微生物产生变种的根源，是育种的基础，但也是菌种发生退化的主要原因。突变泛指微生物细胞内遗传物质的结构或数量突然发生的可遗传的变化。基因突变的特点：自发性、不对应性、稀有性、独立性、可诱变性、稳定性、可逆性。一、突变突变是工业微生物产生变种的根源，是育种的基础，但也是菌种发生31.突变包含狭义的突变和广义的突变。狭义的突变专指基因突变，也称点突变，涉及一对或少数几对核苷酸的增加、减少或取代。同义突变：突变后密码子编码的仍是同一种氨基酸；错义突变：编码另外一种氨基酸；无义突变：突变后为终止密码；移码突变：突变点后遗传密码的阅读框架发生移动。1.突变包含狭义的突变和广义的突变。4广义的突变包括基因突变和染色体畸变。

染色体畸变指的是染色体结构的改变，包括缺失、重复、倒位和易位等。广义的突变包括基因突变和染色体畸变。52.突变包含自发突变和诱发突变。自发突变是在没有采用诱变手段下野生菌群体中自然发生的突变体。诱发突变是采用物理或化学手段(即诱变剂)，处理后得到的突变体。自发突变和诱变本质上是相同的，都是以一定的概率产生的。2.突变包含自发突变和诱发突变。61.自然选育的概念自然选育：在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自然突变(SpontaneousMutation)而进行的菌种筛选过程，又叫自然分离。二、自然选育1.自然选育的概念二、自然选育7自然突变的原因：（1）多因素低剂量的诱变效应由一些原因不详的低剂量诱变因素引起的长期综合效应，如充斥空间的各种短波辐射、自然界中普遍存在的低浓度诱变物质、微生物自身代谢产生的诱变物质如H2O2等的作用。（2）互变异构效应自然突变的原因：8胸腺嘧啶(T)和鸟嘌呤(G)的第六位上可以酮式或烯醇式出现，胞嘧啶(C)和腺嘌呤(A)第六位可以氨基式或亚氨基式出现，平衡一般倾向于酮式和氨基式，但在偶然情况下，会出现稀有的烯醇式和亚氨基式，使DNA双链结构中常出现的AT和GC碱基对变成GT和AC，发生突变，几率约为10-8～10-9。胸腺嘧啶(T)和鸟嘌呤(G)的第六位上可以酮式或烯醇式出现，9微生物102、3第十章微生物的遗传变异和育种课件102.自然选育的目的发酵工业使用的生产菌株，几乎都是经过人工诱变处理后获得突变株，遗传特性往往不够稳定，容易继续发生变异，变异的方向一个是菌种衰退，造成发酵产量的降低，另一个是菌种变异获得优良性状，使发酵产量提高。经常进行自然选育工作，可以淘汰衰退的菌株，保存优良的菌株，稳定和提高发酵产量。2.自然选育的目的11

3.自然选育的一般程序：采用单菌落分离法单细胞或单孢子悬浮液要求有良好的分散度：细菌应转种到新鲜肉汤液体中培养，取得分散的菌体放线菌或霉菌的孢子，采用玻璃珠或石英砂振荡打散孢子后在过滤,对粘性大的孢子，可以加入0.05%的分散剂(如Tween80，一种非离子活性剂)3.自然选育的一般程序：124.自然选育的特点简单易行；效率低、进展慢、难以使生产水平大幅度提高，需要与诱变育种结合交替使用。4.自然选育的特点13第三节突变的诱发与微生物诱变育种

第三节突变的诱发与微生物诱变育种14微生物育种过程分为三个阶段：菌种基因型改变→→→筛选菌种，确认并分离出具有目的基因型或表型的变异株→→→产量评估，全面考察变异株在工业化生产上的接受性。微生物育种过程分为三个阶段：菌种基因型改变→→→筛选菌种，确15一、突变诱发过程从诱变剂进入细胞到突变型出现的整个过程都会有一些因素影响突变的诱发。1诱变剂接触DNA分子前一、突变诱发过程从诱变剂进入细胞到突变型出现的整个过程都会有162DNA损伤的修复五种修复方式：光复活作用；切补修复；重组修复；SOS修复系统；DNA多聚酶的校正作用。2DNA损伤的修复17微生物102、3第十章微生物的遗传变异和育种课件18（D）SOS修复系统这是一种能够造成误差修复的“呼救信号”修复系统。当DNA受到诱变剂损伤而阻断DNA复制过程时，DNA损伤相当于一个呼救信号，促使细胞中的有关酶系解除阻遏，而进行DNA的修复。在修复过程中，DNA多聚酶在无模板的情况下进行DNA的修复（D）SOS修复系统19（E）DNA多聚酶的校正作用除了上述种种修复作用以外，细胞还具有对复制过程中出现的差错加以校正的功能。大肠杆菌中的DNA复制依赖于三种DNA多聚酶的作用，这三种酶除了对于多核苷酸的多聚作用以外，还具有3′到5′核酸外切酶的作用。一般认为依靠DNA多聚酶的这一作用，能在复制过程中随时切除不正常的核苷酸。如果DNA多聚酶发生突变而使其核酸外切酶活性减弱，那么它切除不正常核苷酸的能力减弱，菌体的突变率相应地提高，成为增变突变型，DNA多聚酶为DNA修复作用所必需，所以增变突变型对于诱变剂的作用格外敏感。（E）DNA多聚酶的校正作用203从前突变到突变诱变剂造成的DNA分子的某一位置的结构改变称为前突变。前突变可以通过影响DNA复制而成为真正的突变，也可以经过修复不发生突变。一般认为光复活作用、切补修复和DNA多聚酶的校正作用具有校正功能而不利于突变的诱发，而重组修复和SOS修复系统具有引起差错的性质而有利于突变的发生。3从前突变到突变21一切影响DNA修复系统中酶活性以及与突变相关的酶活性的因素都能影响由前突变向突变的转变。例如：咖啡碱能抑制切补修复系统，从而增强诱变作用；SOS修复系统和重组修复依赖于蛋白质合成，因而利于蛋白质合成的因素有利于提高突变率；Ba2+（钡）通过对DNA多聚酶的3’核酸外切酶活性的抑制提高突变率。一切影响DNA修复系统中酶活性以及与突变相关的酶活性的因素都224从突变到突变型表型的改变落后于基因型改变的现象称为表型延迟。分离性延迟和生理性延迟分离性延迟：经诱变后，细胞中野生型基因和突变型基因并存于同一细胞中，突变型基因由于属于隐性基因而没有表达，需要经过复制、分离，在细胞中只有突变型基因，没有野生型基因时，其性状才得到表达。4从突变到突变型23生理性延迟：在突变基因已经为纯的状态后，突变表型还不一定出现，必须等到原有基因的产物稀释到某一程度才表现出来，而这些原有基因产物的浓度降低到能改变表型的临界水平前，细胞已经分裂多次，经过多个世代。（如噬菌体菌株的表达会出现）生理性延迟：24二、诱变育种的方案设计诱变育种包括三个环节：突变的诱发、突变株的筛选、突变高产基因的表现，根据这三个环节进行方案设计。二、诱变育种的方案设计诱变育种包括三个环节：突变的诱发、突变25

制定筛选目标对于随机出现的多种变异性状，筛选的目标除了要求高产量之外，还应从生产的角度考虑其它有利性状如：生长速度快、产孢子多；消除某些色素或无益组分等。但是所定的筛选目标不可太多。工作量大，考虑实现目标的可能性。制定筛选目标26诱变育种的步骤和方法包括：出发菌株的选择，菌悬液的制备，诱变剂及诱变剂量的选择，诱变的处理方式方法，纯化分离等。三、诱变育种的步骤与方法诱变育种的步骤和方法包括：出发菌株的选择，菌悬液的制备，诱变27（一）出发菌株出发菌株的选择是决定诱变效果的重要环节。对菌种的遗传背景、稳定性、纯一性以及形态、生理、生化等特性研究，都有利于提高诱变效果。（一）出发菌株282出发菌株的纯化确定诱变出发菌株之后，就要进行纯化。纯种分离方法，常用划线分离法和稀释分离法。采用显微操纵仪分离单个孢子，培养形成单菌落，这样可以得到完全真实的纯菌株。2出发菌株的纯化29稀释平板分离法：倾注平板法和涂布平板法。基本过程：（1）梯度稀释过程；（2）分离培养过程涂布倾注梯度稀释过程10-110-210-310-410-510-6稀释平板分离法：倾注平板法和涂布平板法。涂布倾注梯度稀30（二）单孢子悬浮液的制备供试细胞在生理活性方面既要同步，又要处在最旺盛的对数期。菌悬液中的菌体应该是单细胞或单核的孢子。生理盐水或缓冲液配制。（二）单孢子悬浮液的制备31（三）诱变剂其他诱变剂诱变剂物理因素化学因素紫外线激光离子束X射线r射线快中子与碱基反应的物质碱基类似物改变DNA结构的物质烷化剂亚硝酸类吖啶类（三）诱变剂其他诱变剂诱变剂物理因素化学因素紫外线与碱基反应32“生物化学统一性”法则：人和细菌在DNA的结构及特性方面是一致的，能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA，使其发生突变，最后造成癌变或其他不良的后果。诱变剂的共性原则：化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比超过95%的致癌物质对微生物有诱变作用90%以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用

“生物化学统一性”法则：诱变剂的共性原则：33（四）影响突变率的因素a.菌种的生理状态与诱变效果有密切关系b.诱变前后的培养条件对诱变效果有明显影响c.其他外界条件如温度、氧气、pH、可见光等对诱变也有影响（四）影响突变率的因素34（五）突变株的筛选菌体细胞经诱变处理后，要从大量的变异菌株中，把一些具有优良性状的突变株挑选出来，需要明确的筛选目标和筛选方法。育种工作中常用随机筛选和理性筛选这两种方法。1随机筛选随机筛选即菌种经诱变处理后，进行平板分离，随机挑选菌落，从中筛选出高产菌株。a.摇瓶筛选法b.琼脂块筛选法c.筛选自动化和筛选工具微型化。（五）突变株的筛选菌体细胞经诱变处理后，要从大量的变异菌株中352理性化筛选由于诱变后出现正突变株的几率小，用随机筛选的方法要耗费大量的人力物力，因而筛选方法逐渐转向理性化筛选。理性化筛选：运用遗传学、生物化学的原理，根据产物已知的或可能的生物合成途径、代谢调控机制和产物分子结构来进行设计和采用的一些筛选方法，以打破微生物原有的代谢调控机制，获得能大量形成产物的高突变菌株。2理性化筛选362.1初级代谢产物高产菌株的筛选a.降低终产物浓度筛选终产物营养缺陷型；筛选细胞膜透性改变的突变株；b.筛选抗反馈突变菌株筛选结构类似物(抗代谢物)抗性突变株；2.1初级代谢产物高产菌株的筛选372.2次级代谢产物高产菌株的筛选(主要是抗生素)a.利用营养缺陷型筛选b.筛选负变株的回复突变株c.筛选去磷酸盐调节突变株d.筛选去碳源分解代谢调节突变株e.筛选氨基酸结构类似物抗性突变株f.筛选二价金属离子抗性突变株g.筛选前体或前体结构类似物抗性突变株h.筛选自身所产的抗生素抗性突变株2.2次级代谢产物高产菌株的筛选(主要是抗生素)382.3根据菌株其它生理特性的筛选用于菌株理性化筛选的除了代谢产物高产菌株的筛选，根据制定的筛选目标，还有其它类型的突变株，包括组成性突变株、消除无益组分的突变株、能有效利用廉价的发酵原材料的突变株、细胞形态改变利于分离提取工艺的突变株、抗噬菌体突变株等等。这些筛选目标虽然不直接以产量为目标，但它们所具备的优良特性往往能导致产量的提高。2.3根据菌株其它生理特性的筛选39营养缺陷型突变株的筛选方法诱变检出营养缺陷型淘汰野生型鉴定营养缺陷型富集培养（抗生素法）（菌丝过滤法）夹层培养法限量补充培养法逐个检出法影印平板法生长谱法营养缺陷型突变株的筛选方法诱变检出营养缺陷型淘汰野生型鉴定营40（六）菌种特性研究高产菌株选育之后，为了推广到大生产中去，需要研究菌种的纯度、遗传稳定性、菌落类型、群体的形态、生活能力、产孢子多少，保藏培养基及保藏方法；研究菌种碳、氮源利用情况、菌丝生长速度、菌丝量、发酵液粘度、过滤难易状况；还要注意考察菌种抗生素的组分变化，色素等其他质量问题；还要研究最适移种期、移种量、通气搅拌、温度、pH等等。对于这些重要发酵条件，一般在小型发酵罐和发酵罐之间摸索其间的相关性，为工业化生产提供更为接近的发酵条件。（六）菌种特性研究41Theend!Theend!42第十章微生物的遗传变异和育种

第十章微生物的遗传变异和育种43第二节基因突变与自然选育第二节基因突变与自然选育44突变是工业微生物产生变种的根源，是育种的基础，但也是菌种发生退化的主要原因。突变泛指微生物细胞内遗传物质的结构或数量突然发生的可遗传的变化。基因突变的特点：自发性、不对应性、稀有性、独立性、可诱变性、稳定性、可逆性。一、突变突变是工业微生物产生变种的根源，是育种的基础，但也是菌种发生451.突变包含狭义的突变和广义的突变。狭义的突变专指基因突变，也称点突变，涉及一对或少数几对核苷酸的增加、减少或取代。同义突变：突变后密码子编码的仍是同一种氨基酸；错义突变：编码另外一种氨基酸；无义突变：突变后为终止密码；移码突变：突变点后遗传密码的阅读框架发生移动。1.突变包含狭义的突变和广义的突变。46广义的突变包括基因突变和染色体畸变。

染色体畸变指的是染色体结构的改变，包括缺失、重复、倒位和易位等。广义的突变包括基因突变和染色体畸变。472.突变包含自发突变和诱发突变。自发突变是在没有采用诱变手段下野生菌群体中自然发生的突变体。诱发突变是采用物理或化学手段(即诱变剂)，处理后得到的突变体。自发突变和诱变本质上是相同的，都是以一定的概率产生的。2.突变包含自发突变和诱发突变。481.自然选育的概念自然选育：在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自然突变(SpontaneousMutation)而进行的菌种筛选过程，又叫自然分离。二、自然选育1.自然选育的概念二、自然选育49自然突变的原因：（1）多因素低剂量的诱变效应由一些原因不详的低剂量诱变因素引起的长期综合效应，如充斥空间的各种短波辐射、自然界中普遍存在的低浓度诱变物质、微生物自身代谢产生的诱变物质如H2O2等的作用。（2）互变异构效应自然突变的原因：50胸腺嘧啶(T)和鸟嘌呤(G)的第六位上可以酮式或烯醇式出现，胞嘧啶(C)和腺嘌呤(A)第六位可以氨基式或亚氨基式出现，平衡一般倾向于酮式和氨基式，但在偶然情况下，会出现稀有的烯醇式和亚氨基式，使DNA双链结构中常出现的AT和GC碱基对变成GT和AC，发生突变，几率约为10-8～10-9。胸腺嘧啶(T)和鸟嘌呤(G)的第六位上可以酮式或烯醇式出现，51微生物102、3第十章微生物的遗传变异和育种课件522.自然选育的目的发酵工业使用的生产菌株，几乎都是经过人工诱变处理后获得突变株，遗传特性往往不够稳定，容易继续发生变异，变异的方向一个是菌种衰退，造成发酵产量的降低，另一个是菌种变异获得优良性状，使发酵产量提高。经常进行自然选育工作，可以淘汰衰退的菌株，保存优良的菌株，稳定和提高发酵产量。2.自然选育的目的53

3.自然选育的一般程序：采用单菌落分离法单细胞或单孢子悬浮液要求有良好的分散度：细菌应转种到新鲜肉汤液体中培养，取得分散的菌体放线菌或霉菌的孢子，采用玻璃珠或石英砂振荡打散孢子后在过滤,对粘性大的孢子，可以加入0.05%的分散剂(如Tween80，一种非离子活性剂)3.自然选育的一般程序：544.自然选育的特点简单易行；效率低、进展慢、难以使生产水平大幅度提高，需要与诱变育种结合交替使用。4.自然选育的特点55第三节突变的诱发与微生物诱变育种

第三节突变的诱发与微生物诱变育种56微生物育种过程分为三个阶段：菌种基因型改变→→→筛选菌种，确认并分离出具有目的基因型或表型的变异株→→→产量评估，全面考察变异株在工业化生产上的接受性。微生物育种过程分为三个阶段：菌种基因型改变→→→筛选菌种，确57一、突变诱发过程从诱变剂进入细胞到突变型出现的整个过程都会有一些因素影响突变的诱发。1诱变剂接触DNA分子前一、突变诱发过程从诱变剂进入细胞到突变型出现的整个过程都会有582DNA损伤的修复五种修复方式：光复活作用；切补修复；重组修复；SOS修复系统；DNA多聚酶的校正作用。2DNA损伤的修复59微生物102、3第十章微生物的遗传变异和育种课件60（D）SOS修复系统这是一种能够造成误差修复的“呼救信号”修复系统。当DNA受到诱变剂损伤而阻断DNA复制过程时，DNA损伤相当于一个呼救信号，促使细胞中的有关酶系解除阻遏，而进行DNA的修复。在修复过程中，DNA多聚酶在无模板的情况下进行DNA的修复（D）SOS修复系统61（E）DNA多聚酶的校正作用除了上述种种修复作用以外，细胞还具有对复制过程中出现的差错加以校正的功能。大肠杆菌中的DNA复制依赖于三种DNA多聚酶的作用，这三种酶除了对于多核苷酸的多聚作用以外，还具有3′到5′核酸外切酶的作用。一般认为依靠DNA多聚酶的这一作用，能在复制过程中随时切除不正常的核苷酸。如果DNA多聚酶发生突变而使其核酸外切酶活性减弱，那么它切除不正常核苷酸的能力减弱，菌体的突变率相应地提高，成为增变突变型，DNA多聚酶为DNA修复作用所必需，所以增变突变型对于诱变剂的作用格外敏感。（E）DNA多聚酶的校正作用623从前突变到突变诱变剂造成的DNA分子的某一位置的结构改变称为前突变。前突变可以通过影响DNA复制而成为真正的突变，也可以经过修复不发生突变。一般认为光复活作用、切补修复和DNA多聚酶的校正作用具有校正功能而不利于突变的诱发，而重组修复和SOS修复系统具有引起差错的性质而有利于突变的发生。3从前突变到突变63一切影响DNA修复系统中酶活性以及与突变相关的酶活性的因素都能影响由前突变向突变的转变。例如：咖啡碱能抑制切补修复系统，从而增强诱变作用；SOS修复系统和重组修复依赖于蛋白质合成，因而利于蛋白质合成的因素有利于提高突变率；Ba2+（钡）通过对DNA多聚酶的3’核酸外切酶活性的抑制提高突变率。一切影响DNA修复系统中酶活性以及与突变相关的酶活性的因素都644从突变到突变型表型的改变落后于基因型改变的现象称为表型延迟。分离性延迟和生理性延迟分离性延迟：经诱变后，细胞中野生型基因和突变型基因并存于同一细胞中，突变型基因由于属于隐性基因而没有表达，需要经过复制、分离，在细胞中只有突变型基因，没有野生型基因时，其性状才得到表达。4从突变到突变型65生理性延迟：在突变基因已经为纯的状态后，突变表型还不一定出现，必须等到原有基因的产物稀释到某一程度才表现出来，而这些原有基因产物的浓度降低到能改变表型的临界水平前，细胞已经分裂多次，经过多个世代。（如噬菌体菌株的表达会出现）生理性延迟：66二、诱变育种的方案设计诱变育种包括三个环节：突变的诱发、突变株的筛选、突变高产基因的表现，根据这三个环节进行方案设计。二、诱变育种的方案设计诱变育种包括三个环节：突变的诱发、突变67

制定筛选目标对于随机出现的多种变异性状，筛选的目标除了要求高产量之外，还应从生产的角度考虑其它有利性状如：生长速度快、产孢子多；消除某些色素或无益组分等。但是所定的筛选目标不可太多。工作量大，考虑实现目标的可能性。制定筛选目标68诱变育种的步骤和方法包括：出发菌株的选择，菌悬液的制备，诱变剂及诱变剂量的选择，诱变的处理方式方法，纯化分离等。三、诱变育种的步骤与方法诱变育种的步骤和方法包括：出发菌株的选择，菌悬液的制备，诱变69（一）出发菌株出发菌株的选择是决定诱变效果的重要环节。对菌种的遗传背景、稳定性、纯一性以及形态、生理、生化等特性研究，都有利于提高诱变效果。（一）出发菌株702出发菌株的纯化确定诱变出发菌株之后，就要进行纯化。纯种分离方法，常用划线分离法和稀释分离法。采用显微操纵仪分离单个孢子，培养形成单菌落，这样可以得到完全真实的纯菌株。2出发菌株的纯化71稀释平板分离法：倾注平板法和涂布平板法。基本过程：（1）梯度稀释过程；（2）分离培养过程涂布倾注梯度稀释过程10-110-210-310-410-510-6稀释平板分离法：倾注平板法和涂布平板法。涂布倾注梯度稀72（二）单孢子悬浮液的制备供试细胞在生理活性方面既要同步，又要处在最旺盛的对数期。菌悬液中的菌体应该是单细胞或单核的孢子。生理盐水或缓冲液配制。（二）单孢子悬浮液的制备73（三）诱变剂其他诱变剂诱变剂物理因素化学因素紫外线激光离子束X射线r射线快中子与碱基反应的物质碱基类似物改变DNA结构的物质烷化剂亚硝酸类吖啶类（三）诱变剂其他诱变剂诱变剂物理因素化学因素紫外线与碱基反应74“生物化学统一性”法则：人和细菌在DNA的结构及特性方面是一致的，能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA，使其发生突变，最后造成癌变或其他不良的后果。诱变剂的共性原则：化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比超过95%的致癌物质对微生物有诱变作用90%以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用

“生物化学统一性”法则：诱变剂的共性原则：75（四）影响突变率的因素a.菌种的生理状态与诱变效果有密切关系b.诱变前后的培养条件对诱变效果有明显影响c.其他外界条件如温度、氧气、pH、可见光等对诱变也有影响（四）影响突变率的因素76（五）突变株的筛选菌体细胞经诱变处理后，要从大量的变异菌株中，把一些具有优良性状的突变株挑选出来，需要明确的筛选目标和筛选方法。育种工作中常用随机筛选和理性筛选这两种方法。1随机筛选随机筛选即菌种经诱变处理后，进行平板分离，随机挑选菌落，从中筛选出高产菌株。a.摇瓶筛选法b.琼脂块筛选法c.筛选自动化和筛选工具微型化。（五）突变株的筛选菌体细胞经诱变处理后，要从大量的变异菌株中772理性化筛选由于诱变后出现正