血液系统疾病常见动物模型

血液系统疾病常见动物模型造血系统疾病〔Diseaseofhematopoieticsystem〕，除了地中海贫血等少数疾病具有明型，就成为争辩造血系统疾病的发病机理、探究型治疗技术和药争辩的根本工具。一、缺铁性贫血动物模型缺铁性贫血〔irondeficiencyanemia，IDA〕是体内用来合成血红蛋白〔HGB〕的贮存铁缺乏，HGB合成削减而导致的小细胞低色素性贫血，主要发生于以下状况：〔1〕铁需求增加而摄入缺乏，见于饮食中缺铁的婴幼儿、青少年、孕妇和哺乳期妇女〔2〕铁吸取不良，见于胃酸缺乏、小肠粘膜病变、肠道功能紊乱、胃空肠吻合术后以及服用抗酸和H2受体及抗剂等〔3〕铁丧失过多，见于反复屡次小量失血，如钩虫病、月经量过多等。IDA是一种多发性疾病，据报道，在多数进展中国家，约2/3的儿童和育龄妇女缺铁，1/3IDAIDA的预防和治疗具有重要的意义。在这些争辩中，缺铁性贫血的动物模型〔AnimalmodelofIDA〕，又是实施争辩的根底工具。常见的IDA动物模型的构建技术如下：试验动物：一般选用SD大鼠，465g左右，HGB≥130g/L。AOACEDTA浸泡处理以去除饲料中的铁，饲料中的含铁量是诱导SD大鼠形成缺铁性贫血模型的关键，现有争辩说明，饲喂含铁量<15.63mg/Kg35天，SDIDA表现，而饲喂含铁40.30mg/Kg的饲料SD大鼠消灭缺铁，但并不表现贫血病症。建模时一般承受去离2静脉放血法，1～1.5ml/次，2次/周。模型指标：〔1〕HGB≤100g/L；〔2〕中心淡染区扩大，MCV减小、MCHC降低；〔3〕血清铁〔SI〕降低，常小于10μmol/L，血清总铁结合力〔TIBC〕60μmol/L。需要指出的是，以上模型不能用于铁吸取不良相关IDA的防治争辩。依据具体的争辩需要，也可以适当调整建模方法。二、再生障碍性贫血动物模型再生障碍性贫血〔aplasticanemia〕，简称再障，系多种病因引起的造血系统退行性变，合征。再障的发病机制尚未完全说明，目前存在四种假说：〔1〕“种子”学说，有证据表明，再障与患者造血干细胞存在某种内在缺陷有关。〔2〕“土壤”学说，有证据说明，再障与患者的造血微环境存在某种缺陷，对造血支持不良有关。〔3〕“虫子”学说，有证据说明，免疫反响、药物、病毒损伤造血干细胞可致再障发生。〔4〕“遗传”学说，有证据说明再障具有遗传易感性。动物模型。目前已报道的再障动物模型构建技术有：〔一〕化学方法建模腺嘌呤致大鼠肾性贫血模型试验动物：SD大鼠，雌雄不拘。建模方法：腺嘌呤肾毒性建模法，由肾脏分泌的粗红细胞生成素〔EPO〕是红系、巨核系分化、成熟所必需的细胞因子，腺嘌呤可导致肾脏病变，使EPO分泌缺乏，进而导致红系和巨核系造血障碍。王威等于 1999年报道，利用饲喂含腺嘌呤 0.75%，投饲量300mg/(kg.d)，连续喂养7周，获得肾衰竭贫血模型，试验动物红细胞、血红蛋白及红细胞压积等主要红系指标均、血小板均显著下降。用途：可作为肾性贫血的发病机制争辩、疾病进展争辩和治疗药物筛选的动物模型。马利兰致骨髓抑制的再障模型试验动物：小鼠、SD大鼠、家兔，雌雄不拘。给药，均可导致造血干细胞、骨髓微环境的抑制，形成再障。〔1〕口服给药，15mg/kg/周或30mg/kg/118-153mg/kg时，可致家兔的再障，消灭全血细胞削减、淋巴细胞比值增加、骨髓黄化和骨髓纤维化。〔2〕一次性给药，35mg/kg腹腔注射，可致大鼠再障。〔3〕口服给药，18mg/kg/天，连续给药10天，可致NIH小鼠再障，消灭血细胞削减和骨髓有核细胞降低，建模稳定、试验动物存活率高。苯致骨髓抑制的再障模型试验动物：CD1小鼠、家兔。建模方法：苯类化学物质进入动物体内后，在骨髓富集〔可达血清浓度的20倍〕，对骨〔1〕1:1混合物，4.0ml/kg3次/周，共给药25次，可致CD1小鼠再障，表现为全血细胞削减、骨髓黄化、脂肪细胞等非〔0.5-1.0ml/kg/天，3次/2周以上，可致全血细胞削减、造血细胞削减。〔二〕物理方法建模外部照耀建模法试验动物：小鼠，雌雄不拘。建模方法：γ射线等高能射线可穿透机体，起DNA损伤，干扰DNA复制，阻断有丝分裂，对造血干细胞等分裂增值活泼的细胞有强抑制作用。使用钴60等放射性同位素，亚致死剂量〔6.0Gy〕辐照以后，可致小鼠全血再障，维持时间较长，但辐照的剂量不好把握，稍大易致小鼠死亡，稍低则个别小鼠不易到达造血抑制效果。内部照耀建模法试验动物：小鼠，雌雄不拘。153Sm〔钐〕、89Sr〔锶〕、32P〔32磷〕、186Re(186铼)、188Re(188铼)、105Rh〔105铑〕、177LU〔177镥〕60Co〔60钴〕，能产生β射线及亲6.4或2μCi腹腔11~12周龄的小鼠，6μCi35d后全部死亡．2μCi组动物全部存活。6μCi21d后股骨骨髓显示为脂肪髓。全血细胞削减，骨髓有核细胞数和CFU-S32P1.4mCi/kg体重也可导致再障。三、溶血性贫血动物模型溶血性贫血(hemolyticanemia,HA)是一种常见的贫血类型，是指由于某种缘由使红细胞存活期缩短，破坏增加，超过了骨髓代偿力量所引起的一类贫血，是常见的造血系统疾病。【造模机制】动物注射肯定量的乙酰苯肼(acetylphenylhydrazine,APH)，APH是一种强糖-6-磷酸脱氢酶，促进血红蛋白变性而形成海氏小体，也可直接破坏红细胞的膜蛋白和脂类，使膜溶解裂开，红细胞崩解，造成溶血性贫血。【造模方法】1、4、7APH0.2g/kg、0.1g/kg、0.2g/kg9天造模成功，其他给药方法也可以造成此模型。大鼠第1、4天皮下注射APH0.16g/kg、0.08g/kg8天造模成功；0.2g/kg10天造模成功。家兔以2％APH生理盐水溶液给试验动物皮下或肌内注射2～30.1g/kg，即可建立溶血性贫血模型。观看指标：一般生长状态观测，包括一般行为、毛发、出血点及死亡状况；外周血常规参数测定，如血红细胞计数、白细胞计数、血小板计数和血红蛋白含量；血细胞化学指标变化，如中性粒细胞的碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、三磷腺苷酸酶、琥珀酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸酶和网织红细胞计数，海氏小体，骨髓象检查等指标。【模型特点】注射APH后，试验组动物间续消灭活动削减、毛发暗淡无光泽、摄食削减、体重下降、疲乏无力、嗜睡、皮肤苍白等现象。外周血血红蛋白和红细胞进展性下降；网织红细胞、海氏小体和白细胞总数则显著增多。中性粒细胞的碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、三磷腺苷酸酶、琥珀酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸酶，骨髓均有不同程度特别变化。【模型评估和应用】用注射强氧化剂APH的方法可制作出符合临床特征的溶血性贫血动物模型，APH用量可通过预试验摸索，上述剂量可供参考。本方法建模周期短，操作简性溶血性贫血供给了一种简易模型。四、白细胞削减症动物模型人类白细胞削减症是临床上常见的病症白细胞的药物，可用环磷酰胺、马利兰等化学物质，过量x射线、γ射线辐射损伤，细菌、真菌感染和遗传因素来建立白细胞削减症动物模型。环磷酸胺诱发的白细胞削减症动物模型(animalnmodelofcyclophosphamideinducedlenkocytopenia)【造模机理】白细胞生成削减。【造模方法】以小鼠作为试验动物模型，按每公斤体重腹腔注射或皮下注射环磷酰胺50~70mg。用2mg/m10.5mL，即可成功地复制白细胞削减症动物模型，按同样方法亦可复制白细胞削减症的大鼠模型。食物中毒性白细胞缺乏症猫模型(catmodelofalimentarytoxicaleucia)【造模机理】ATA是由于人食用真菌污染的食物引起致死的真菌中毒。人的ATA表现为白细胞进展性削减、贫血、坏死性咽峡炎、发热、出血及脓毒血症。【造模方法】1981年，Lutsky等用倍半萜(Sesquiterpene)T-2毒素(从镰刀菌属的类分支孢菌中分别出来的单端孢菌素)48h0.08mg/kg体重，直至发病．建立了食物中毒有全身脆弱无力，便血、后腿共济失调、呕吐、厌食、脱水、体重减轻。【模型应用】血液学、生物化学、免疫学及临床方面的问题。但是，小鼠、大鼠、脉鼠、免、犬、猪、绵ATA的动物模型。周期性粒细胞削减症犬模型(dogmodelofcyclicneutropenia)【造模机理】21d(14~25d)发作一次，每次持续约1周。发作时有全身不适、头痛、感染、发热。婴儿患者病死率高。【造模方法】10h[(0~100)×105／L]9~13d发作一次，2~5d。伴严峻感染，待粒细胞恢复后1~3d1~2岁，严峻，死亡更早。60Co-γ射线辐射建立小鼠白细胞削减症模型【造模机理】人类在自然条件下受到自然和辐射的影响常引发白细胞削减等病理现象,在临床上放疗也是治疗肿瘤的主要方法之一,但放疗的主要副反响为骨髓抑制，从而导致外周血白细胞下降。【造模方法】小鼠32只，雌雄各半，分为4组：ICR小鼠雌性组、ICR小鼠雄性组、C57BLP6J小鼠雌性组和C57BLP6J小鼠雄性组,每组8只。自眼眶静脉丛取全血20μL，测定正常小鼠外周血白细胞总数后,承受60Co-γ射线一次性全身照耀小鼠,源皮距为1.5m，照耀剂量为5Gy，照耀后第3d测定外周血白细胞总数。结果显示无论雄性还是雌性ICR小鼠的正常白细胞数量均极显著低于C57BLP6J说明雄性C57BLP6J在照耀后第3d白细胞数量显著高于其雌性小鼠,提示雄性C57BLP6J5Gy的照耀剂量下,小鼠的白细胞数量随时间持续降低,而且随时间推移小鼠消灭被毛蓬松,活动减5dICR小鼠有死亡现象发生。由此提示在造模后应马上开头进展药物干预,可以到达较佳的治疗效果，药物干预最迟不行超过照耀后第3d。五、白血病动物模型类白血病可以用化学(如烷化刑)、物理(如电离辐射)、生物(如逆转录病毒)以及转基因方法，在不同动物〔小鼠、豚鼠、大鼠、猫、牛、长臂猿等〕诱发白血病，建立动物模型。T淋巴细胞白血病小鼠(L615)动物模型(animalmodelofT1ymPhocytic1eukemia)【造模方法】1965年，由中国医学科学院血液争辩所用津638病毒诱发的昆明小鼠白血病组织的无61581d埋伏期，取一只患白血病小鼠，用生理盐水制备脾细胞悬液(25％)4615小鼠，均发生白血病，平均存活时间为29.7d，以患病小鼠的脾脏为瘤源，在615小鼠连续移植传代，能百分之百发病，且存活时30代后建成稳定的白血病模型．称L615白血病。L615小鼠存活时间为(6.7±1.2)d，除皮下接种外，腹腔接种亦可百分之百发病，存活时间稍短，但无腹水形成。L615小鼠白血病对各类抗肿瘤药物有不同程度的敏感性。在7665氟尿嘧啶和5氟尿嘧啶核苷可使4％1个月以上；16种烷化剂中，149种药物可使局部动物存活1个月以上。L615T细胞白血病小鼠的脾细胞悬浮体外培育还建立了L615T细胞白血病细胞系，可在体外长期传代培育，亦可长期冷冻保存备用。L615T细胞TT细胞白血病发鼠白血病模型系统，如L7212、L7710、L7711、L759、L7811等均为T淋巴系统白血病。粒单核细胞白血病〔WEHI-3〕小鼠模型(animalmodelofmyelomonocyticleukemia)【造模方法】用矿物油注入小鼠体内造成产生白血病的体内环境。1966年．Qsserman等建立粒—单7BALB/c18只，每只小鼠腹腔注射医用石0.4mL1115周龄时各重复注射一次。在714周龄之间，皮下注射0.01mg(0.05m1橄榄油中)5次，170.25mg一次。其个11只小鼠发生肿瘤，第一批是在6月龄时〔即停顿注射石蜡油2个月后)发生肿9~15月龄间发生。这种肿瘤称为wEHI-3。从原代粒—单核细胞白血病小鼠取数个实体瘤制备单细胞悬液8只受体小17~21d4只小鼠脾细胞悬液再移植传代，每种悬液注4320d，以后的传代时间14d4个亚系即为WEHI-3A、B、C、D。A50%40条染色体，B39C亚系：非绿色白血病．40条染色体。D亚系：绿色白血病，为四倍体核型。其核型在移植传代过程中可发生变化，如B亚系，第2、第3次移植传代时，391条具有近端着丝粒的标记染色体，而在14~15次移植传代之间就变成中间着丝粒的标记染色体，在移植过程中患粒一单核细胞白血病的BALB/c小鼠血象与骨髓象均有变化。人类白血病的小鼠模型(micemodelofhumanmyeloidleukemia)【造模机理】用免疫耐受性强的人类胎儿骨片植入重症联合免疫缺陷病(SCID)血细胞与造血微环境均植入小鼠，建立具有人类造血功能的SCID小鼠模型称为SCID－hu小鼠。再将髓系白血病患者的骨髓细胞植入SCID－hu小鼠皮下的人类胎儿骨片内，植入的髓系白血病细胞选择性生长在SCID－hu小鼠体内的人类造血微环境中，即为人类髓系白血病SCID小鼠是由于其scid所致。T、B淋巴细胞功能联合缺陷，这种小鼠能承受人类器官移植物。【造模方法】SCID-hu小鼠：CB-17scid/scid生殖的近交小鼠(SCID)，6~8周龄时用抗生素处理。在无菌条件下，从19~23妊娠周龄的胎儿取出股骨和胫骨，剪成5mm×５mm×l０mm的骨片，植入SCID小鼠皮下，并从每个胎儿供体制备胸腺细胞用于检测同种异体HLA。白血病细胞注射：急性髓性白血病患者骨髓细胞(0.4～2)×104个活细胞(常用冻存解冻后的细胞)10％胎牛血清的ＲPMＩ164020d,用微注射器将细胞悬液直接注射人6~8周前植入SCID-hu小鼠的人胎骨片内HLA病细胞的骨移植片再制备细胞悬液，取(0.5~2)×1062SCID-hu受体小鼠的移植骨片内。处理小鼠MHC-I(主要组织相容性复合体I类)抗原的单抗，直接与染料荧光素异硫氰化物或藻红蛋白结合，用流式细胞仪将细胞分类并分析细胞来源。2～3周时，骨片内有坏死与纤维化，CFU－GMBFU－E削减，未见造血中心；移植4～5周时，骨片内消灭由淋巴系与未成熟的髓系细胞组成的造血中心；6～820周。用MEＭ－43(人类细胞抗原的特异抗体)与Ly5.1(小鼠血细胞的特异抗体)类细胞占705％~20％。胎儿骨片内的人类基质细胞可刺激人的造血干细胞的增殖与分化，以维持正常造血。将人的急性髓性白血病细胞注入SCID-hu小鼠的一块胎骨片内，4~6周后，胎儿骨片内的正常造血细胞被急性白血病细胞的增殖所取代，而且还选择性地转移到植入的其他胎骨片内。【模型应用】该模型是人类白血病细胞生长在小鼠体内的人类造血微环境中立原理与方法也适用于其他白血病与恶性肿瘤动物模型的建立片与成人骨舱造血钉些不同。急性B淋巴细胞白血病动物模型的建立【造模机理】急性白血病是儿童常见的血液系统肿瘤,急性淋巴细胞白血病(ALL)约占70%,其中80%来自B细胞系,Nalm-6是急性人B淋巴细胞系白血病细胞株,在一般的RMPI-1640培育基中简洁生长，生殖快，恶性度高,能引起弥散性疾病,可移植入裸鼠或SCID小鼠。裸鼠T淋巴细胞缺陷，而SCID小鼠T、B淋巴细胞联合缺陷,更简洁移植成功,但是价格昂贵。为此，本试验承受裸鼠建立白血病动物模型。【造模方法】①用无菌PBS液将环磷酰胺浓度调整到10mg/mL,腹腔注射环磷酰胺2mg/只,连续注射2d;24h后,收集处于对数生长期的Nalm-6细胞,1000r/min离心5min后,悬浮于无菌PBS中,调整细胞密度至2.5×107个/mL,尾静脉注射5×106个/只(200μL)②每隔1～2d观看小鼠病症,以后肢消灭瘫痪为发病标准,记录小鼠发病和死亡日期。③待小鼠濒死时,颈椎脱臼法将其处死,马上取小鼠的肝、脾、肺、心脏、肾、肠、脑组织、骨髓、胰腺、睾丸、卵巢等,经10%中性福尔马林固定脱水、透亮、浸蜡、包埋,制成石蜡切片,H-E染色后在光镜下观看各个组织肿瘤细胞浸润状况。图1裸鼠B系ALL白血病动物模型Fig.1ThenudemicemodelofB-ALL肿瘤模型小鼠组织内有大量肿瘤细胞浸润(见箭头所示)图3小鼠组织病理检查结果(×100倍)Fig.3 Thehistopathologicalexaminationofeachorgan(×100)【模型特点】白血病小鼠的发病时间不仅与小鼠周龄有关,也与注射的肿瘤细胞数目有亲热关系,但Gunther用6周龄的SCID小鼠,每只注射1×106个Nalm-6细胞,平均32d后肢行动缓慢,39d瘫痪;Uckun用6～7周龄的雌性SCID小鼠[5],每只注射1×106个Nalm-6细胞,有56%的小鼠平均33d发生瘫痪,39d全部死亡,两争辩小鼠发病时间相像;Herrera用10～13周龄的SCID小鼠[6],注射5×106个Nalm-6细胞后平均36d承受5～6周的裸鼠,每只注射5×106个Nalm-6细胞,平均20d发病,模型建立成功率100%,但是发病时间比上述报道早,可能是由于使用的小鼠周龄小,注射肿瘤细胞数目多,进入小鼠体内后生长生殖较快,导致小鼠发病较早。2.人慢性粒细胞白血病动物模型的建立【造模机理】目前建立人慢性粒细胞白血病动物模型的方法主要有3种,包括用慢性粒细胞白血病细胞种植免疫缺陷鼠(SCID或NOD/SCID)、用表达P210bcr/abl逆转录病毒载体转染小鼠骨髓细胞并移植入正常鼠体内和构建bcr/abl转基因鼠。【造模方法】免疫缺陷小鼠－人慢粒白血病模型：2023年Ramshaw等觉察在体外半固体培育基上用人GM－CSF拮抗剂E21R可抑制全部7个CML患者CML细胞的克隆形成，继而他们承受人CML细胞(1×108细胞／只)分别输入SCID鼠和人GM－CSF转基因SCIDCML细胞在SCID小鼠体内难以定植，而在转人GM－CSF基因的SCID小鼠体内6周后CML明人CML细胞在体内、体外生长均依靠人GM－CSF[7]。Nicolini等用表达人特异性的造血生长因子IL23GM－CSFSF的逆转录病毒载体转染的小鼠骨髓细胞接种NOD／SCID小鼠，324周后小鼠血清IL23、GM－CSF、SF可达ng／ml水平,将人造血干细胞或胎肝细胞移植到这些NOD／SCIDNOD／SCID,而红系细胞和淋巴系细胞明显削减[8]。由此可见，转人GM－CSF基因的SCID鼠或NOD／SCID小鼠可用于制备较为抱负的人CML动物模型。用表达P210bcrPabl逆转录病毒载体转染小鼠骨髓细胞并移植正常鼠：Daley等分别雌性BALB／c小鼠的骨髓细胞，用表达bcr／abl融合基因的逆转录病毒载体转染，筛选后56～12周龄经致死剂量(900cGy)照耀的同源雄性BALB／cCML相关病症以及急性淋巴细胞性白血病[9]。bcrPabl转基因小鼠模型：Honda等[18]P210bcr／abl转基因小鼠进展深入争辩。TecTec启动子调控的基因仅特异性地表达在造血干细胞的细胞质中。他们用小鼠的Tec基因的启动子序列(-1948至+22)代替以前所使用的MT87只转基因鼠中,84只转基因小鼠首先消灭粒细胞特别增生、高血小板血症，经肯定时间后发生骨髓增殖综合征(MPD)CML但它们的子代经过一段埋伏期后表现骨髓增生综合征CML转基因鼠是格外重要的。【模型应用】CML动物模型的争辩进展快速,分子遗传学和分子生物学技术的进步使我们有可能制备出更加完善的CML动物模型,用于我们对CML发病机理的争辩和有效治疗方法的探究。六、出血性疾病动物模型特别、凝血系统的特别以及纤溶系统的特别。特发性血小板削减性紫癜〔ITP〕，因血小板因素特别导致。获得性血友病A则因凝血系统的特别导致。目前，该两种疾病已有相应的动物模型，均为兔和小鼠。特发性血小板削减性紫斑(idiopathicthrombocytopenicpurpura,ITP)兔、小鼠模型【造模机理】动物体内血小板消耗而导致血小板数量削减．故又称为免疫性消耗性血小板削减症。【造模方法】ITP兔模型：承受西兰白兔，雄雌均可，体重2～4kg；脉鼠，大于3月龄均可，雌雄不拘。豚鼠抗兔血小板血清的(GP-APs)制备：用米巴比妥钠(30mg/kg体重)从耳缘静脉注6:1(V/V)从免颈动脉取全血与酸性枸椽酸右旋糖(Acidcitratedextrose，ACD)混合，pH值4.5，经离心，分别血小板，并洗涤，用生理盐水稀释制成混悬液。用上述血小板混悬液(10９血小板)123次(3×10９个血小饭)。末次注射后的第6天，从脉鼠心脏穿刺取血，离心后取上层血清，随即分别用等量1:1(V/V)兔压紧红细胞和洗涤过的兔淋巴细胞各吸附血清一次，用生理盐水稀释，即为豚鼠抗免血小板抗血清，分装后储存于-70℃冰箱待用、按ELISA法和放射免疫沉淀法检测抗血清效价。ITP模型的建立：急性短期兔ITP模型：苯巴比妥钠麻醉兔，插入颈动脉套管后。耳缘静脉注射豚鼠抗兔