基因工程基础知识填空【实用文档】doc

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专题一基因工程基因工程基础知识填空【实用文档】doc文档可直接使用可编辑，欢迎下载1。1DＮA重组技术的基本工具一、基因工程的基本概念1.概念：基因工程是指按照人们的愿望,进行严格的设计，并通过＿__＿_________和______＿____等技术,赋予生物以新的__＿＿__＿___，从而创造出更符合人们需要的新的_＿__＿_＿＿_＿和＿________＿_。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的,因此又叫做___＿_＿________＿_＿。2。基本原理：＿__＿_＿_＿______３.理论基础（１)不同生物的基因可以拼接的结构基础-—细胞生物的遗传物质都是＿______，都是以_________＿___为基本单位构成的双链大分子。（2）目的基因转入后可以表达的基础——所有生物共用一套_____＿____。（3）生物遗传信息的表达都遵循___＿＿＿_＿＿.4。优点（1）目的性强，能＿__＿___的改造生物的性状.（2）克服_＿＿＿＿____＿______的障碍。二、限制性核酸内切酶——分子手术刀１．简称:________＿＿.２。来源：主要是从________＿_中分离纯化而来。3。功能特点：特异性，即识别双链ＤＮＡ分子某种特定＿____＿____，并且使每一条链中__＿＿_＿_____＿的两个核苷酸之间的__＿______断开.4．酶切结果：_＿_＿___末端和_______末端。画出EcｏRⅠ酶切后的结果：↓GAATTCCＴTＡAＧ↑三、ＤNＡ连接酶——“分子缝合针”１．作用实质:将双链DNA片段“缝合"起来,恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的_＿＿＿_＿__。2.作用前提:两个ＤNA分子必须含有＿__＿＿___＿。３.种类(１)E·ｃoliDNA连接酶①来源:＿＿＿_＿_＿____②功能：只能连接_＿＿_______＿(２）T４DＮA连接酶①来源：_＿__＿_＿_＿__＿②功能：既可以连接___＿__＿_＿__，又可以连接＿____＿___，但连接＿________时效率比较低。【拓展】比较DNA连接酶与DNA聚合酶DＮA连接酶DNＡ聚合酶作用实质都是催化两个核苷酸之间形成＿_＿__＿_是否需模板_＿＿___＿＿_＿____连接DNA链____链＿___链作用过程在两个ＤＮA片段之间形成__________将____＿__＿_加到已存在的核苷酸链上,形成____＿__＿_＿__作用结果将两个DNA片段连接成_____＿＿___合成______＿_＿__四、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”1．基因工程中最常用的载体——___＿_＿_(１）来源:_＿__＿__＿等微生物（２）结构：裸露的、结构简单、独立于___＿______＿之外，并具有＿＿_______＿__的___＿_＿__＿_＿分子。２.基因的载体必须具备的条件（1）有____＿______＿＿_个限制酶切割位点,供外源DNA片段（基因）插入其中.（２）能在宿主细胞内_＿＿_＿＿_＿＿，或整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行_______＿.(3）有特殊的________＿__,如四环素抗性基因等，供重组DNA的鉴定和选择。(4)必须是＿_＿＿__的，不会对受体细胞有害。（5）＿___＿＿＿适合，以便提取和在体外进行操作。3.载体的种类：除质粒外，还有_______＿____、__＿__＿_＿___＿＿_____等。4．在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过_______＿_的.１。2基因工程的基本操作程序一、基因工程的基本操作程序1.______＿______的获取.2.＿___＿________的构建。3.将目的基因____＿____＿_＿_。4.目的基因的_＿_________＿_。二、目的基因的获取1。目的基因主要是＿_____＿__的结构基因.２。获取目的基因的方法(1)从基因文库中获取目的基因①基因文库概念：将含有某种生物不同基因的许多______＿__＿,导入＿____＿＿的群体中储存，各个__＿____分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库.②基因文库分类：可分为_＿___＿文库和________文库(如ｃDNA文库）.(2)利用PCR技术扩增目的基因①PCR技术是_＿_＿__＿＿___＿_的缩写。PCR是一项在生物体外_＿__＿_____＿__的核酸合成技术.②PCR技术的原理：ＤNA的____＿____。③PCＲ扩增的前提：要有一段已知目的基因的_＿_＿__＿,以便根据这一序列合成引物。④PCＲ扩增的条件:_____、_____（目的基因),原料-—＿_________＿＿___（即ｄCTP、dATＰ、dGＴP、dTTP)，耐高温的__＿＿＿_＿___酶（Taq酶）.⑤PCR扩增的过程a．变性：加热到90－９5℃b。复性(退火）：冷却到55-60℃ｃ。延伸：加热到70-75℃⑥结果：目的基因以____的方式成指数形式扩增。(3）人工合成法：如果基因比较_＿＿,且________，可以通过＿＿__＿_＿__＿＿用化学方法直接人工合成。【拓展】PCR技术和ＤＮA复制的比较PCＲ技术DNA复制相同点原理＿_________＿_____＿_原料_________＿_____＿__条件_____、_＿___、____＿不同点解旋_＿___解旋_____＿_催化场所＿____复制_____＿__酶热稳定的DNA聚合酶细胞内含有的DNA聚合酶结果在短时间内形成____＿____形成_________＿三、基因表达载体的构建基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步,也是基因工程的_______1.基因表达载体构建目的：使目的基因在受体细胞中__________，并且可以_______给下一代，同时，使目的基因能够＿___＿_____。2.基因表达载体的组成：除了目的基因外，还必须有_______、_＿___＿_以及＿_____＿＿__等。(１)启动子：位于目的基因的＿______，是一段有特殊结构的DNA序列,是＿__＿_＿__＿_＿__识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出ｍRＮA，最终获得所需的蛋白质，即转录开始的部位。(2）终止子:位于目的基因的______,也是一段有特殊结构的DNA序列，使转录在所需的地方停止下来,即转录停止的部位。（3）标记基因:用于鉴别受体细胞中是否＿____＿_＿,从而将含有目的基因的细胞_______出来，常为＿____＿__＿____，如氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因。3．表达载体构建过程中,获取目的基因与切割质粒时一般用_＿_____限制性核酸内切酶，目的是产生相同的_____＿_＿_＿＿，以便于连接。四、将目的基因导入受体细胞_____＿的概念：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程,称为_______。1.将目的基因导入植物细胞(1)常用受体细胞:植物的＿_＿＿＿_＿＿或____＿___。(2）方法：_________＿＿＿法、＿__＿_＿___法、＿__＿＿_＿＿_法,其中，＿________＿＿法是导入植物细胞最常用的方法。①农杆菌特点:易感染双子叶植物和裸子植物.当植物体受到伤害是,伤口处的细胞会分泌大量的__＿＿_＿＿__＿_，吸引农杆菌移向这些细胞,这时农杆菌中的_____＿__上的_______＿(可转移的DNA）可转移到受体细胞染色体的ＤＮA上。②转化过程：将______＿__插入到＿____＿＿_＿__上，通过农杆菌的转化作用，可以使目的基因进入植物细胞,并将其插入到植物细胞中染色体的DＮA，使目的基因的遗传特性得以_＿___＿___＿____＿＿_。２.将目的基因导入动物细胞（1）常用受体细胞:____＿＿____。(2）常用方法：__________＿＿__。（３）基本操作程序：＿____含有目的基因的表达载体→_＿____(受精卵）→_＿＿_＿_____→胚胎移植→新性状动物３。将目的基因导入微生物细胞(1)常用受体细胞：_＿＿_＿_＿_细胞，其中__＿_____最为广泛。（2)原核生物的特点：①__＿_____；②多为单细胞;③遗传物质相对__＿___（３)转化方法:__＿_＿________法。（4）转化过程①用＿______＿_处理受体细胞(如大肠杆菌),使细胞处于一种能吸收周围环境中DＮA分子的生理状态，这种细胞称为＿_________＿_。②将重组表达载体DＮA分子溶于＿＿_____中与____＿＿__混合，在一定____＿下促进＿____＿____吸收DＮＡ分子，完成转化过程。五、目的基因的检测与鉴定目的基因导入受体细胞是否可以_______＿__＿___，只有通过检测与鉴定才能知道，这是基因工程的第四步,也是检查基因工程是否成功的一步。类型步骤检测内容方法结果显示_＿＿＿检测第一步检测转基因生物的染色体上是否插入了目的基因_＿＿_＿____________(ＤＮA探针+转基因生物DNA）是否＿__＿_______第二步检测目的基因是否转录＿______＿___＿＿___＿_(DNA探针＋转基因生物mRNA)是否____＿_＿__＿_第三步检测目的基因是否翻译成蛋白质____________＿＿_____是否＿______________水平的检测包括抗虫、抗病的接种实验,以确定是否具有抗性的及抗性程度；基因工程产品需要与天然产品的功能进行活性比较等１.3基因工程的应用一、植物基因工程硕果累累植物基因工程技术主要用于提高农作物的__＿＿____＿___（如抗除草剂、抗虫、抗病、抗干旱和抗盐碱等)，以及改良农作物的____＿＿和利用植物生产___＿＿__等方面。动物基因工程前景广阔动物基因工程主要应用于动物品种______、建立___＿_＿__、器官移植等多方面.(１）用于提高动物生长速度：将__＿__＿＿___＿_＿__导入动物体内，以提高动物生长速率。（２)用于改良畜产品的品质。(3）用转基因动物生产药物：将药用蛋白基因与____＿＿_＿_＿__的启动子等调控组件重组在一起，通过＿___＿＿＿___等方法,导入哺乳动物的＿_＿_＿__中,然后,将受精卵送入母体内，使其生长发育成＿＿__＿＿_＿。转基因动物进人泌乳期后，可以通过分泌的＿_＿___来生产所需要的药品，称为乳腺（房)生物反应器。（4）用转基因动物作器官移植的供体:将器官供体基因组导入某种调节因子，抑制_____________或设法除去＿________＿_，再结合_＿＿___＿__＿，培育出没有_____＿______＿_＿__的转基因克隆动物器官.三、基因工程在医学、药学上的应用1。基因工程药物:利用“工程菌”生产基因工程药品包括_＿__＿＿____、______、＿＿____、____＿_、______等.工程菌：用基因工程的方法，使外源基因得到高效率表达的菌类细胞株系一般称为“工程菌”。2.基因治疗:是把_＿_＿_____导入病人体内,使该基因的＿____＿_＿发挥功能，从而达到治疗疾病的目的,这是治疗遗传病的最有效的手段,包括＿_＿＿__＿____和_＿_＿_＿_____＿。补1:用于基因治疗的基因有三种类型：①＿_＿_＿＿＿____＿_______＿__＿___＿＿_＿_；②__________＿_＿_＿_______＿＿＿＿_____；③＿___＿_＿_＿_＿_＿________＿_________。补２：基因诊断。原理：__＿_______＿__;工具__＿____＿_＿_１.4蛋白质工程1.实质：根据的关系，通过，对现有蛋白质进行改造或创造自然界不存在的蛋白质。2．基本原理：预期→设计→推测→找到→合成3.蛋白质工程与基因工程区别蛋白质工程基因工程实质通过，以定向改造或生产人来需要的蛋白质,甚至是自然界不存在的蛋白质定向改造生物的遗传特性,以获得符合人类需要的生物类型会生物产品结果可以合成自然界的蛋白质只能生产自然界的蛋白质联系蛋白质工程是在基因工程基础上，延伸出的工程基因工程的定义:按照预先设计好的蓝图,利用现代分子生物学技术，特别是酶学技术，对遗传物质DNＡ直接进行体外重组操作与改造,将一种生物(供体)的基因转移到另外一种生物（受体）中去,从而实现受体生物的定向改造与改良。基因工程的基本过程:切、接、转、增、检基因工程理论依据：a）生物的遗传物质是DNA。b）DNA的双螺旋结构和半保留复制机理.c）遗传信息的传递方式(中心法则）和三联体密码子系统的建立遗传工程：指以改变生物有机体性状为目标，采用类似工程技术手段而进行的对遗传物质的操作,以改良品质或创造新品种.包括细胞工程和基因工程等不同的技术层次。克隆。指由同个祖先经过无性繁殖方式得到的一群由遗传上同一的DNＡ分子、细胞或个体组成的特殊生命群体。限制性核酸内切酶。是一类能识别双链DNＡ中特殊核苷酸序列,并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。限制性内切酶由三个基因位点所控制:hsdR-－—限制性内切酶，hsｄＭ—-－限制性甲基化酶，ｈｓdS———控制两个系统的表达.HｓdS-识别特定DＮA序列，HsdM－甲基化,HsdR-限制性内切酶功能。命名法:例如Ｈａemoｐhｉlｕsinfｌuenzue)d株中分离的第三个酶：ＨｉndＩＩI同裂酶:不同来源的限制酶具有相同的识别位点和切割位点。同尾酶:来源不同、识别序列不同,但产生相同粘性末端的酶粘性末端：DNＡ末端一条链突出的几个核苷酸能与另一个具有突出单链的DＮA末端通过互补配对粘合,这样的DNA末端，称之。酶活性单位.在合适的温度和缓冲液中，在50μｌ反应体系中,1小时内完全切割1微克DNA所需的酶量为１个酶活性单位Ｕ.星活性：指限制性内切酶在非标准条件下,对与识别序列相似的其它序列也进行切割反应，导致出现非特异性的ＤNＡ片段的现象。引起星活性原因:若使用buｆfer不当,会有sｔaｒａctｉvｉty,而sｔaraｃｔivｉty是指限制酶对所作用的ＤNA及序列失去专一性，当酶辨认切割位置的能力降低,导致相似的序列或是错误的辨认序列长度也会作用，而产生错误的结果.连杆:化学合成的8～12个核苷酸组成的寡核苷酸片段.以中线为轴两边对称，其上有一种或几种限制性核酸内切酶的识别序列,酶切后可产生一定的粘性末端,便于与具有相同粘性末端的另一ＤNA片段连接。底物位点优势效应：酶对同一个DNA底物上的不同酶切位点的切割速率不同衔接头：化学合成的寡核苷酸，含有一种以上的限制性核酸内切酶识别序列。其一端或两端具有一种或两种内切酶切割产生的黏性末端.逆转录酶：以mＲNA为模板合成其互补DＮA。RNＡ聚合酶：以DNA为模板合成ｍRNＡ,不需引物,但必须有启动子。末端转移酶:不依赖于DＮA的DNＡ聚合酶,来自于小牛胸腺组织,在DNA分子的3端增加一个或多个脱氧核苷酸。多核苷酸激酶:对核酸末端羟基进行磷酸化的酶。防止载体分子的自身环化作用：使用不同的限制酶切;碱性磷酸酶预先处理质粒载体;DNA片段5’端脱磷酸化作用后连接。;ＤNA片段末端同聚物加尾后进行连接载体：指能够运载外源DＮA片段（目的基因）进入受体细胞，具有自我复制能力,使外源DＮA片段在受体细胞中得到扩增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类ＤNA分子。功能:1运送外源基因高效转入受体细胞2为外源基因提供复制能力或整合能力3为外源基因的扩增或表达提供条作为工程载体必备的条件：具有多个单一的限制酶切位点；有复制起点，在受体细胞中能自我复制,或整合到染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制；具有筛选转化子的选择性标记基因;安全，不含对受体细胞有害的基因,不会任意转入受体细胞以外的其它生物细胞中;分子量小，拷贝数多;携带外源基因的幅度宽.克隆载体：用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体.一般具有较低的分子量、较高的拷贝数和松弛型复制子。表达载体。指专用于在宿主细胞中高水平表达外源蛋白质的载体,可将重组体ＤNA导入适合的受体细胞,使所载的目的基因能够复制、转录和翻译.穿梭载体:能在两种不同的生物体内复制的载体。主要用于原核细胞与真核细胞之间进行基因转移质粒：指独立存在于宿主细胞染色体外、能够自我复制的DNA分子.严谨型质粒：拷贝数为1至几个的质粒.松弛型质粒:拷贝数多于１0个的质粒。氯霉素扩增:用氯霉素抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制时，带有pMB1或ColＥI复制子的质粒扔会利用丰富的原料大量复制的的现象.质粒不亲和性:指在无选择压力的情况下,两种亲缘关系密切的不同质粒不能在同一个寄主细胞中稳定共存的现象。接合质粒。指质粒所携带的基因的功能是使细胞彼此有效地接触，以便将质粒DNA从供体细胞转移至受体细胞的质粒。质粒有哪些性质:自主复制性、可扩增性、不亲和性、转移和迁移、重组性。cos位点：指在连接酶的作用下，连接黏性末端结合形成的双链ＤNＡ区段.柯斯质粒载体:是一类人工构建的含有DNAcos位点、噬菌体包装有关的DNＡ短序列、质粒DNA复制起点、抗生素标记基因等元件的特殊质粒载体.在宿主细胞中可以作为正常噬菌体进行复制，但不表达噬菌体的任何功能。人工染色体:指人工构建的含有天然染色体基本功能单位的载体系统。主要有酵母人工染色体（ＹＡＣ,在大规模的测序中例如人类基因组计划是非常有用的还有用于高等生物构建基因组文库，缺点是：1存在嵌合现象，嵌合体比例比较高，2YAC克隆的稳定性差,插入片段存在重排和丢失现象,３插入片段的分离和纯化困难，不容易与酵母自身染色体相分离。)、细菌人工染色体（BＡC）、源于噬菌体P１的人工染色体（PＡＣ),它们的特点是载体的容载能力扩大，人工染色体具备三个元件:复制起始区／自主复制序列,参与染色体DNA复制起始结构的形成;着丝粒，负责染色体向子细胞传递；端粒,对染色体ＤNA两个末端起封口和保护作用。λ-DNＡ作为载体的优点:１)λ-DＮＡ可在体外包装成噬菌体颗粒,能高效感染大肠杆菌；2）λ—ＤNA作为载体，其装载外源DNA的能力为25kb,远远大于质粒的装载量;3)重组λ-DＮA的筛选较为方便，可进行正向筛选和杂交筛选；4)重组λ—ＤＮA分子的提取比质粒容易PCＲ反应体系的成份:Taｑ酶、模板DNA、引物、dNTP、PCＲ缓冲液PCＲ反应的步骤:①DNA变性：(９0℃—96℃）：双链DNＡ模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。②退火：(60℃－6５℃)：系统温度降低，引物与DNA模板结合,形成局部双链。③延伸:(７０℃－7５℃）:在Tａq酶(在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dＮTP为原料，从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸,合成与模板互补的DNＡ链。探针：具有一定序列的核苷酸片段,能与互补的核酸序列复性杂交,并且能通过适当标记进行检测。目的基因.是指已被或欲被分离、改造、扩增和表达的特定基因或DＮA片段.基因文库：是某种特定的生物所含有的能够包含所有基因的足够数目的克隆的集合cＤNA文库。以mRNA为模板,经反转录产生的各种cDNA片段分别与克隆载体重组，贮存在一种受体菌群体中，这样的群体称为cDＮＡ文库。构建步骤：分离纯化总ＲNＡ及ｍＲNＡ；•ｃDNA第一链的合成•双链cDNA合成•与载体重组、转化基因组文库：某种生物的基因组的全部遗传信息通过克隆载体贮存在一个受体菌的群体中,这个群体即为这种生物的基因组文库.探针杂交原理。任意两条单链核酸分子都有相互形成碱基对的趋势.但形成的大多数分子对由于只有少数链间氢键形成，杂交结构并不稳定.如果多聚核苷酸链是互补的,碱基对的大量形成使双链分子稳定。原位杂交技术：基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列,将有放射性或非放射性的外源核酸（即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNＡ或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。ｃDNA文库的构建步骤:分离纯化总ＲNＡ及ｍRNA（Ｐ10４—110)、ｃDNA第一链的合成、双链ｃＤNA合成、与载体重组、转化从基因文库中获取目的基因的方法:ＰCR法、化学合成法、分离目的基因的方法和原理:1从生物基因组群体中分离目的基因(原核生物基因组较小，基因容易定位，用限制性内切酶将基因组切成若干段后，用带有标记的核酸探针，从中选出目的基因.真核生物一般通过基因组文库的方法获得目的基因。）2人工合成目的基因DＮＡ片段(人工合成目的基因ＤＮＡ片段有化学合成和酶促合成法两条途径．一般是采用ＤＮA合成仪来合成长度不是很大的DNA片段.）３PCＲ反应合成ＤNA(PCR是以ＤNA变性、复制的某些特性为原理设计）受体细胞选择的原则;•外源DNＡ分子能稳定存在，限制酶缺陷型;•重组基因缺陷型；•易于转化/转导；•易筛选•遗传稳定性高,易于扩大培养;•安全性高；•内源蛋白酶基因缺失或缺陷；•遗传密码无明显偏好性;•具有较好的转译加工机制；•较高的理论和实践应用价值。转化：以质粒为载体的重组ＤＮA分子引入受体细胞的过程。转染：以噬菌体或病毒为载体的重组DNＡ分子引入受体细胞的过程。转导：是指通过λ噬菌体(病毒）颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA分子转移到受体细胞内的过程。感受态细胞：指处于能吸收周围环境中DＮA分子的生理状态的细胞.转化率:是指DNA分子转化受体菌获得转化子的效率几种常见的转化方法:1化学转化法:•原理:0ºC、低浓度（5０~100mM）CaＣl2,Ca2+改变细胞膜的磷脂层结构，提高膜的通透性，而且增强进入细胞的DNA分子抗DNasｅ的能力。特点：操作简便,不需特殊仪器,一般实验室均可进行。2电激法•原理：利用高压电脉冲作用，在细菌细胞膜上进行电穿孔,形成可逆的瞬间通道,促进外源DNA的有效吸收。•特点：感受态细胞制备简单；用途广泛，但需特殊仪器电激仪。原生质体转化、噬菌体转化。正向选择•重组子在培养基上能生长，而非重组子不能生长。根据插入序列的表型特征进行筛选:1限制性内切酶法：可以通过限制性酶酶切重组质粒,电泳分析插入片段长度是否正确。2PCＲ法：如果已知插入DNA片段的某些序列,就可以通过PCR的方法进行鉴定。3菌落原位杂交法：直接把菌落或噬菌斑印迹转移到杂交膜上,不必进行核酸分离纯化、限制酶酶切及凝胶电泳分离等操作,而是经溶菌和变性处理后使DＮA暴露出来并与杂交膜结合,再与特异性标记探针杂交,筛选出含有插入序列的菌落或噬菌斑。4基因产物检测法：如果使用的是表达载体,那么就可以通过鉴定基因产物的方法鉴定正确的克隆.α-互补：laｃZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体lacZ’可以与带有完整的近操纵基因区段的β—半乳糖苷酶阴性突变体之间实现互补。根据载体的选择标记的初步筛选：①抗药性选择标记插入失活/插入表达筛选法（正向选择•重组子在培养基上能生长，而非重组子不能生长。）②β-半乳糖苷酶显色反应筛选法（α—互补筛选）(α—互补概念)③利用报告基因筛选植物转化细胞（通过不同报告基因产生不同的酶而采用不同的手段筛选)④利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞外源基因表达系统：指目的基因与表达载体重组后,导入合适的受体细胞，并能在其中有效表达，产生目的基因产物。大肠杆菌基因表达载体的重要组成元件:•复制起始区(oｒｉ）•选择标记•正确插入的多克隆位点（控制有效转录、翻译调控）•启动子：Lａc和Tac；PL和PR；T７•核糖体结合位点•翻译起始点AUG等真核基因在大肠杆菌中表达遇到的问题和对策：细菌不能识别真核基因的表达信号.解决的方法是将外源基因插入载体中，使其处于一系列的E.colｉ表达信号的控制之下。这样基因可以转录和表达.克隆载体提供了表达的信号，所以可以用来生产重组蛋白,被称为表达载体。或者:1)外源基因可能含有内元。E．colｉ缺乏切除内元的机制。２）外源基因可能含有在E.coｌi作为终止子的序列。3）基因的密码子可能不适合于E.cｏli中翻译。解决策略：1)如果克隆的基因含有内元，可以使用mRNA。2）定点突变的方法改变可能的终止序列。3用E。coli偏爱的密码子.融合蛋白：将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，没有改变两个基因的阅读框，以这种形式表达的蛋白，称之.分泌型蛋白：外源基因的表达产物N端连有一信号肽序列,通过运输和分泌的方式穿过细胞的外膜进入培养基中.包涵体:一定条件下，外源基因表达产物在大肠杆菌中积累并致密地聚集在一起形成无膜的裸露结构,称为包涵体。基因表达产物的检测方法：•报告基因的酶法检测•酶联免疫吸附法•Weｓterｎ印迹法•表达产物生物学活性检测植物遗传转化的方法：1直接基因转移技术(基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、PEG介导转化方法）2生物介导的转化方法(农杆菌介导和病毒介导两种转化方法）,常用于双子叶植物。Ti质粒的结构植物基因工程的应用：一。利用植物转基因技术研究基因的表达与调控(可以利用报告基因研究环境因素的变化对基因表达的影响;Ｔi质粒上的T－DＮA能随机整合入植物染色体中，因而已广泛应用于植物基因的定性及分离上.）二。利用转基因植物生产外源蛋白质（利用转基因植物作为生物反应器，生产异源蛋白质及其它高分子化合物)三.改良植物品种（可以通过转基因来控制植物果实的成熟时间，也可以培育抗虫害、抗病、坑除草剂和抗逆境的植物，还可以改变花型和花色及改良作物品质）转基因安全性:标记基因是否有害；环境危害；不同的酶对离子强度要求不同,所以当ＤＮA同時以两种限制酶处理时,选择可使两种酶活性反应均可达7５﹪以上的reｓtricｔｉoｎbuｆｆｅｒ，若找不到适当的ｂuｆfｅr则先加低盐的ｂuｆｆer使其中一酶作用后，再加入高盐buffeｒ使另一酶作用,若无法以盐的高低分別加入不同的ｂｕffｅr,则先加入一种buffer作用后,加9５﹪alｃohol沉淀DNA，再加另一种ｂuffｅr作用。载体的类型：•应用范围:克隆载体、表达载体。•应用对象：原核载体、真核载体（酵母、植物和动物）、穿梭载体。•构建来源:质粒载体、噬菌体载体、单链DNA噬菌体载体、粘粒载体、人工染色体载体。基因工程基础知识梳理（二）三、基因工程的应用1．植物基因工程的成果提高农作物的____＿能力、改良农作物的品质、利用植物生产_＿_＿＿等.(１)抗虫转基因植物①方法:将_＿__＿导入植物体，使其具有抗虫性。②成果：各种抗虫作物，如抗虫水稻、抗虫棉、抗虫玉米等。③意义:减少＿__＿＿，降低生产成本,减少环境污染.④主要杀虫基因：＿＿＿__、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等。(2）抗病转基因植物①方法：将__＿＿_导入植物体中,使其具有抗病特性。②成果:多种抗病作物,如抗病的烟草、小麦、甜椒、番茄等。③意义：提高作物抗病力,增产。④主要抗病基因:抗病毒的_＿_＿＿和病毒的复制酶基因；抗真菌的＿＿__＿基因和抗毒素合成基因.（3)抗逆转基因植物①方法：将_＿_＿_基因导入植物体，获得抗逆作物。②成果：多种抗逆植物，如抗盐碱和干旱的烟草、抗寒番茄、抗除草剂大豆和玉米等。③意义：提高作物抗逆能力,稳定高产.④主要抗逆基因：抗盐碱、抗干旱的_＿_＿_基因、耐寒的___＿＿基因、抗除草剂基因。（４)利用转基因改良植物的品质①方法：将优良性状基因导入植物体，获得__＿__。②成果:＿__＿_含量较高的玉米、耐储存番茄、新花色的矮牵牛。③意义：改良植物的某些品种。④主要优良性状基因:＿＿___的蛋白质编码基因、控制番茄果实成熟的基因、与植物花青素代谢有关的基因.2．动物基因工程的成果（1)提高动物的生长速度①生长基因:外源__＿_＿基因.②成果：转基因绵羊、转基因鲤鱼。（2)改善畜产品的品质①优良基因:肠＿＿＿＿＿基因.②成果:转基因牛乳汁中_＿＿_＿含量少.（3)转基因动物生产药物①基因来源：药用蛋白基因＋乳腺蛋白基因的__＿__.②成果：乳腺生物反应器.(４)转基因动物作器官移植的供体①器官供体：抑制或除去＿＿＿＿_。②成果：利用＿＿___培育没有免疫排斥反应的猪器官。3．基因工程药物(１)来源:转基因＿＿＿_＿。（２）成果：_＿_＿＿、抗体、疫苗、激素等。(3）作用：预防和治疗人类肿瘤、心血管疾病、遗传病、各种传染病、＿＿＿_＿、类风湿等疾病。4．基因治疗（1）特点:把＿____导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能,从而达到治疗疾病的目的。(２)成果：将腺苷酸脱氨酶基因导入患者的_＿＿＿_，治疗复合型免疫缺陷症.（3）方法：分为体外基因治疗法和_＿__＿基因治疗法。四、蛋白质工程1．蛋白质工程的崛起（1）实质：将一种生物的_＿＿_＿转移到另一种生物体内，后者产生它本不能产生的蛋白质，从而产生新性状。(2）目的：生产符合人们生活需要的、并非自然界已存在的＿__＿＿。（３)实例:天冬氨酸激酶和＿_＿____＿的活性受细胞内__＿＿__＿＿__的影响，当赖氨酸浓度达到一定量时会抑制这两种酶的活性，改变两种酶的特性后，玉米游离赖氨酸含量提高。2。蛋白质工程原理（1）目的：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质结构进行分子设计。（2）原理：__＿_＿＿____＿_＿＿＿。(3）过程：预期蛋白质功能→设计_＿＿_＿结构→推测应有的氨基酸序列→找到对应的＿＿＿__序列（基因）。3．蛋白质工程进展前景广阔，但目前成功的例子不多。【答案】三、1。抗逆药物杀虫基因农药用量Ｂｔ毒蛋白基因抗病基因病毒外壳蛋白基因几丁质酶抗逆渗透压调节抗冻基因优良品质植物赖氨酸提高必需氨基酸含量2．生长激素乳糖酶乳糖启动子抗原决定基因克隆技术3．工程菌淋巴因子糖尿病4．正常基因淋巴细胞体内四、1．基因蛋白质二氢吡啶二羧酸合成酶赖氨酸浓度２．基因改造预期的蛋白质脱氧核苷酸选修3易考知识点背诵专题1

基因工程基因工程的概念基因工程的别名

基因拼接技术或DNA重组技术操作环境

生物体外操作对象

基因操作水平

DNＡ分子水平基本过程

剪切→拼接→导入→表达结果

产生人类需要的基因产物特点

打破种的界限，定向改造生物本质

基因重组(一）基因工程的基本工具1。“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）（1）来源:主要是从原核生物中分离纯化出来的。（2）功能：能够识别双链DNＡ分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有特异性。（3）结果:经限制酶切割产生的DＮA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。2．“分子缝合针”——ＤNA连接酶（1)两种DＮA连接酶(E·coliDNＡ连接酶和Ｔ４－DＮA连接酶)的比较：①相同点:都缝合磷酸二酯键.②区别:E·coｌiＤNＡ连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来;而T4DNA连接酶能缝合两种末端,但连接平末端的之间的效率较低.(2）与DＮA聚合酶作用的异同：..。DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端,形成磷酸二酯键。3.“分子运输车"-—载体（１）载体具备的条件:①能在受体细胞中复制并稳定保存.②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入.③具有标记基因，供重组DNＡ的鉴定和选择.（2)最常用的载体是。质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。(３)其它载体：噬菌体、动植物病毒(二）基因工程的基本操作程序第一步:目的基因的获取1。目的基因是指:是人们所需要转移或改造的基因2。获取目的基因的方法__＿__