DNA体外重组技术介绍课件

第五章DNA体外重组技术第五章DNA体外重组技术1概述一、DNA重组技术相关概念

克隆(clone)来自于同一始祖的一群相同分子、细菌、细胞或动物（常被成为副本或拷贝）。克隆化(cloning)获取大量单一拷贝的过程，也称无性繁殖。概述一、DNA重组技术相关概念克隆(2DNA克隆(DNAcloning)应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子。继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞。再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，又称基因克隆(genecloning)或分子克隆(molecularcloing)。

DNA克隆(DNAcloning)应用酶学的方法，在体外将3“克隆”某一基因或DNA片段过程中，将外源DNA插入载体分子所形成的复制子是杂合分子－嵌合DNA，所以DNA克隆又称重组DNA(recombinantDNA)。

实现DNA克隆所用的方法及相关的工作称DNA重组技术(recombinantDNAtechnology)，又称基因工程(geneticengineering)。“克隆”某一基因或DNA片段过程中，将外源DN4二、DNA重组技术基本程序外源DNA的获取DNA导入受体菌目的基因与载体的连接克隆载体的选择与构建重组体的筛选克隆基因的表达

二、DNA重组技术基本程序外源DNA的获取DNA导入受体菌目5三、DNA重组的基本步骤++连接转化、筛选和鉴定阳性克隆含重组子的阳性克隆载体目的基因分、切、接、转、筛克隆基因表达三、DNA重组的基本步骤++连接转化、筛选和鉴定阳性克隆含重6第一节DNA体外重组载体的种类与选择载体（vector）：能携带外源基因进入受体细胞,并在其中进行扩增或诱导外源基因表达的工具。第一节DNA体外重组载体的种类与选择载体（vector）：能7

作为基因工程载体所需具备的基本条件：1.有自身的复制子，能借助自身的复制和调控对携带的目的基因进行复制和增殖。3.有多个利于选择和筛选的遗传表型或标志，包括抗药性、营养缺陷型、噬菌斑形成及显色反应。2.有多克隆位点(多种酶单一位点)，易于外源DNA分子与载体及重组。4.表达型载体还应有强启动子、前导序列、增强子等调控元件。作为基因工程载体所需具备的基本条件：1.有自身的复制子8（一）按功能分类（二）按受体细胞分类（三）按载体来源分类一、载体的分类克隆型载体表达型载体原核细胞载体真核细胞载体（穿梭载体）原核克隆型载体原核表达型载体真核表达型载体真核转递型载体质粒载体噬菌体载体病毒载体酵母人工染色体粘性载体（一）按功能分类（二）按受体细胞分类（三）按载体来源分类一、9

细菌培养质粒扩增并表达蛋白质大肠杆菌染色质质粒定义:细菌染色质以外的双链环状DNA，能自我复制和表达其携带的遗传信息。二、不同载体的特点与分类（一）质粒载体1.质粒(plasmid)细菌培养质粒扩增并表达蛋白质大肠杆菌染色质质粒定义:细10基因克隆的质粒载体具备的特点：分子相对较小，具有较高的拷贝数含高效的复制子，可用氯霉素阻止细菌蛋白质的合成，非使质粒的拷贝数增加。具有多种遗传选择标记，包括各种抗药基因或营养代谢基因等。基因克隆的质粒载体具备的特点：分子相对较小，具有较高的拷贝数11抗药基因或营养代谢基因氨苄青霉素抗性基因（ampr）:编码β-内酰胺酶，水解ampβ-内酰胺环使amp失效四环素抗性基因（tetr）：编码转膜泵将tet从细胞移出大肠杆菌LacZ基因：编码半乳糖苷酶，分解X-gal，使菌落为蓝色。抗药基因或营养代谢基因氨苄青霉素抗性基因（ampr）:编码β12AmprORITetrpBR322质粒：一种克隆质粒ORI：复制起始点，保证高拷贝自我复制。结构：Ampr,

Tetr：两个抗性基因用于筛选阳性克隆。PstI,BamHI：两个单酶切位点用于插入目的基因AmprORITetrpBR322质粒：一种克隆质粒ORI：13AmprLacZMCSpfxBlue:克隆质粒MCS：MultipleClonningSite提供多个单酶切位点用于克隆操作LacZ:蓝白斑筛选阳性克隆AmprLacZMCSpfxBlue:克隆质粒MCS：Mu14pUC18/pUC19pUC192686bpAmprLacZP(BLA)PlacOriAvaI(413)BamHI(418)EcoRI(397)HindIII(448)PstI(440)SmaI(415)XmaI(413)ApaLI(178)ApaLI(1121)ApaLI(2367)MCSpUC18/pUC19pUC192686bpAmprLac15pcDNA3：真核细胞表达质粒Pcmv：CMV增强子/启动子驱动目的基因在真核细胞内表达BGHpA：加尾信号目的基因转录后加上polyA尾，使其更稳定。pcDNA3：真核细胞表达质粒Pcmv：CMV增强子/启动子16（二）噬菌体

AWBDEFZ

JattxisNclcroOPQSR结构区重组区调控区裂解区cos位点

cos位点ARAREcoRI目的基因EcoRIEcoRI插入型置换型（二）噬菌体AWBDEFZJatt17

噬菌体作为载体具有两个特点①噬菌体生长繁殖所必需的序列位于其左右二臂上，噬菌体基因组中央含有30%的DNA是噬菌体生长所非必需的。②噬菌体的成熟需要包装，当与外源DNA重组后的大小介于原来的75%～105%之间时，重组的DNA分子才可包装为成熟的噬菌体颗粒。

噬菌体的种类：Charon系列、gt系列、EMBL系列噬菌体作为载体具有两个特点①噬菌体生长繁殖18（三）粘粒载体（cosmid)质粒序列：复制原点，抗性标志噬菌体：cos粘端序列插入片段长度可以是载体本身长度的7-10倍（三）粘粒载体（cosmid)质粒序列：复制原点，抗性标志19（四）酵母人工染色体载体(YAC)质粒pBR322衍生物酵母基因着丝粒端粒自主复制顺序复制起点(ori)Ampr基因组成用途构建真核生物基因组DNA文库（四）酵母人工染色体载体(YAC)质粒pBR322衍生物酵20第二节基因工程中常用工具酶第二节基因工程中常用工具酶21一、限制性核酸内切酶(II型)切——分子克隆的手术刀定义：由细菌自己产生的一种能识别和切割DNA内部特定序列的一类核酸酶有严格的识别、切割顺序，以内切方式水解双链DNA中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5′端为P，3′端为OH。识别顺序一般为4～6个碱基，通常为回文结构，即具有180°反向重复。如CATATG一、限制性核酸内切酶(II型)切——分子克隆的手术刀定义：由22(1).产生平头末端(bluntend)HaeⅢ*************GGCC**************************CCGG*************5′3′5′3′Ⅱ型酶切割双链DNA产生：一、限制性核酸内切酶EcoR

I**********GAATTC******************CTTAAG********5′3′5′3′(2).产生粘性末端(stickyend)(1).产生平头末端(bluntend)HaeⅢ****23一、限制性核酸内切酶酶单位定义：在适当反应条件下，1h内在50μl体系中完全酶解1μg特定DNA底物所需酶量，定为1个活性单位。出售的内切酶几乎均以λDNA作底物测其酶活性单位。星活性:酶切反应条件不能满足最适条件,导致某些酶产生第二活性.EcoR

I*GAATTCAATT一、限制性核酸内切酶酶单位定义：在适当反应条件24标准的酶切体系1μgDNA，20μl总反应体积，1U酶，推荐的Buffer和温度，反应1h酶切体系组成内切酶根据实验目的选择，保存，使用，稀释（避免失活与污染）DNA底物纯度，含量反应buffer严格按产品说明书高、中、低盐酶切反应体系的建立：标准的酶切体系1μgDNA，20μl总反应体积，1U酶，推荐25酶切温度与时间一般为37℃,1h酶切反应过程容积：20μl，50μl,酶容积≤10%,即甘油≤5%注意混匀反应终止：三种方法:①10mMEDTA或0.1%SDS;②65℃，20min;③酚/氯仿抽提，乙醇沉淀酶切鉴定：琼脂糖凝胶电泳酶切反应体系的建立：酶切温度与时间一般为37℃,1h酶切反应过程容积：226二、DNA聚合酶含3种酶活性：1.大肠杆菌DNA聚合酶I5′→3′聚合酶活性

5′→3′外切酶活性3′→5′外切酶活性催化DNA缺口平移反应,制备DNA探针(5′→3′外切酶活性)主要用途DNA序列分析应用：二、DNA聚合酶含3种酶活性：1.大肠杆菌DNA聚合酶I527二、DNA聚合酶I2.Klenow片段随机引物标记法标记探针主要用途双脱氧末端终止法进行DNA测序cDNA第二链的合成DNA3′突出末端进行末端标记用途：(大肠杆菌DNA聚合酶I大片段，缺5′→3′外切酶活性)二、DNA聚合酶I2.Klenow片段随机引物标记法标记探28二、DNA聚合酶IPCR反应主要用途DNA测序用途：3.TaqDNA聚合酶(65kD)耐热，在70～75℃时具有最佳的生物活性，无3′→5′外切酶活性(无校正功能）二、DNA聚合酶IPCR反应主要用途用途：3.Taq294.反转录酶

(ReverseTranscriptase,RT)功能：以RNA为模板，以带3′-OH末端的DNA片段为引物，沿5′至3′方向合成DNA链。3′AAAAAAUCUGUCCUA……5′dNTPMg2+反转录酶3′AAAAAAUCUGUCCUA……5′5′TTTTTTT—OH3′AGACAGGAT……3′1.RNA指导的DNA聚合酶活性5′TTTTTTT4.反转录酶

(ReverseTranscriptase,302.DNA指导的DNA聚合酶活性；RNA酶H(3′→5′RNA外切酶)活性.4.反转录酶功能：后者可降解DNA-RNA杂交分子中的RNA反转录酶缺乏3′→5′核酸外切酶活性,故未校正功能,会出现错配.应用最主要是将mRNA逆转录为cDNA2.DNA指导的DNA聚合酶活性；RNA酶H(3′→5′R31三、DNA连接酶(DNAligase)

——基因工程的缝纫针

催化双链DNA相邻碱基5′P和3′-OH间磷酸二酯键形成的酶。T4噬菌体DNA连接酶最常用

①催化两个独立DNA片段(粘性末端和平末端)

5′P和3′-OH之间形成磷酸二酯键。主要功能与用途：催化平末端连接要比粘性末端效率低得多。②修复双链DNA分子中单链缺口。三、DNA连接酶(DNAligase)

32三、DNA连接酶(DNAligase)修复双链DNA分子中单链缺口,并可催化互补粘性末端的连接.主要用于cDNA第二链的合成.主要功能与用途：(二)大肠杆菌DNA连接酶连接粘性末端可代替T4DNA连接酶.三、DNA连接酶(DNAligase)修复双33四、其他修饰酶功能：催化多个脱氧核苷酸依次加到单链或双链DNA分子的3′-OH末端。(一)末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)

用途：1.主要作用是在载体或目的基因3′末端加上同源多聚尾巴，形成人工粘性末端，便于DNA重组。2.DNA3′末端的同位素标记。四、其他修饰酶功能：催化多个脱氧核苷酸依次加到单链或双链DN34催化DNA，RNA以及核糖和脱氧核糖三磷酸上的5′磷酸基团水解。用途：1.在连接反应中去除载体DNA片段5′-P，防止载体自我连接.2.用32P标记5′末端时，用此酶去除5′-P，再用激酶进行5′的32P标记.(二)碱性磷酸酶功能：(三)多聚核苷酸激酶(四)RNase(五)DNase催化DNA，RNA以及核糖和脱氧核糖三磷酸上的5′磷酸基35第三节目的基因的获得和修饰分通过基因组文库分离、筛选基因通过cDNA文库分离、筛选基因应用PCR或RT-PCR获得目的基因人工合成基因第三节36一、采用限制性内切酶酶切法直接分离目的基因从原核基因组中制备从真核基因组中制备二、采用PCR或RT-PCR方法制备目的基因获得已知的基因构建RT-PCR文库法并获得未知基因计算机克隆一、采用限制性内切酶酶切法直接分离目的基因从原核基因组中制备37三、基因组文库或cDNA文库的构建和筛选

基因组文库(genomiclibrary，G文库)用基因克隆的方法保存宿主细胞中的DNA重组分子中的集合,所有重组子所含的插入片段的总和代表某种生物基因组全部核苷酸序列。分离、筛选基因方法：分子杂交及探针技术用目的基因上的一段DNA做成探针与文库中的DNA作核酸杂交，从基因文库中“钓出”有目的基因的克隆。G文库构建方法：鸟枪法三、基因组文库或cDNA文库的构建和筛选基因38

cDNA文库(cDNAlibrary，C文库)用基因克隆的方法保存在宿主细胞中的DNA重组体的群体，每一重组子只含一种mRNA信息，这些重组子的总和包含某种生物的全部mRNA序列。C文库构建方法：反转录法合成的cDNA与合适的载体重组并导入宿主细胞而形成的分离、筛选基因方法：分子杂交及探针技术C文库的优势与局限性cDNA文库(cDNAlibrary，C文39本方法适用于氨基酸残基数目较少的蛋白基因。缺点：2.如目的基因DNA序列需通过氨基酸序列推测，难于保证与天然基因序列一致，往往导致表达效率大大降低。使用DNA合成仪1.只能合成较小片段的DNA四、化学合成法制备基因片段本方法适用于氨基酸残基数目较少的蛋白基因。缺点：40第四节目的基因的载体连接--接，分子克隆的核心第四节目的基因的载体连接41一、PCR产物的克隆策略（一）限制性内切酶酶切位点添加法（二）T/A克隆法一、PCR产物的克隆策略（一）限制性内切酶酶切位点添加法42定向克隆将外源DNA片段定向插入到载体中的方法对于双向插入，如为扩增型载体并无影响；如为表达型载体，反向插入则可导致不表达，故一定要保证正向插入常用方法：双酶切定向克隆将外源DNA片段定向插入到载体中的方法43NdeICATATGGTATACHindⅢAAGCTTTTCGAANdeICATATGGTATACHindⅢAAGCTTTT44TA克隆定义

利用嗜热聚合酶如Taq聚合酶的模板非依赖性末端转移酶活性(在70～75℃活性高)，使PCR产物的3′末端加一个A的粘性端，将其直接克隆至3′粘性末端含一个T的线性克隆载体中.3′5′T载体3′5′载体T3′5′3′5′AAPCR产物TA克隆定义利用嗜热聚合酶如Taq聚合酶的模板非依赖45常规的克隆方法：PCR产物载体酶切酶切后PCR产物酶切后载体重组分子连接不足：①需要酶切②受酶切位点的限制常规的克隆方法：PCR产物载体酶切酶切后PCR产物酶切后载体46TA克隆方法(一步PCR克隆)PCR扩增+3′3′5′PCR产物AA5′T载体TT5′5′3′3′连接转化蓝白筛选校正聚合酶平端PCR产物Taq酶dATPTA克隆方法(一步PCR克隆)PCR扩增+3′3′5′PCR47（一）粘性末端连接法用同一种限制性内切酶酶切DNA连接酶重组质粒质粒目的基因适用于插入片段和载体具有相同的粘性末端高背景(自身环化)多拷贝插入双向(正、反)插入单酶切缺陷二、外源DNA片段和载体的连接（一）粘性末端连接法用同一种DNA连接酶重组质粒质粒目的基因48（二）平头末端连接法质粒产生平末端的内切酶DNA连接酶产生粘性末端的内切酶核酸酶S1目的基因重组质粒产生粘性末端的内切酶核酸酶S1本法适用于在质粒和目的基因上没有相同的酶切位点！（二）平头末端连接法质粒产生平末端的DNA连接酶产生粘性末端49（三）人工接头法用同一种限制性内切酶酶切DNA连接酶重组质粒质粒目的基因++DNA连接酶接头(linker)本法适用于在质粒和目的基因上没有相同的酶切位点（三）人工接头法用同一种DNA连接酶重组质粒质粒目的基因++50（四）同聚物接尾法DNA连接酶重组质粒质粒目的基因内切酶末端转移酶

+dGTP末端转移酶+dCTP本法适用于在质粒和目的基因上没有相同的酶切位点连接反应：16℃，16h如何实现？（四）同聚物接尾法DNA连接酶重组质粒质粒目的基因内切酶末端51第五节重组分子的扩增和鉴定第五节重组分子的扩增和鉴定52宿主细胞：被导入重组分子的细胞宿主细胞原核细胞：大肠杆菌、链霉菌及枯草杆菌真核细胞：酵母、昆虫细胞及哺乳动物细胞一、重组DNA分子导入受体细胞转宿主细胞：被导入重组分子的细胞宿主细胞原核细胞：大肠杆菌、链53大肠杆菌的转化

转化(transformation)转化原意：细菌细胞的生物学特性由于受纳了外源DNA而发生可遗传的改变。质粒DNA或以质粒为载体构建的重组DNA导入细菌的过程转化的关键：感受态细菌的制备大肠杆菌的转化转化(transformation)转化54感受态细胞competentcell用理化方法人工诱导细胞，使之处于易于吸收和容纳外源DNA分子的状态，此时的细菌称～。转化原理及转化、转染程序大肠杆菌膨胀成球形CaCl20～4℃DNA抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物附着细胞表面42℃90s热休克细胞吸收复苏分裂增殖原理化学转化法感受态细胞competentcell55重组质粒的导入方法化学法：需感受态细胞电击法：不需感受态细胞转化程序：对数生长期的细菌CaCl20～4℃感受态细菌(4℃保存24h)重组质粒DNA+细菌4℃30min热休克(42℃,90s)普通培养基温育涂布于含抗生素的培养基平板单菌落倒置培养37℃重组质粒的导入方法化学法：需感受态细胞转化程序：对数生长期的56基因

导入装置

(Bio-Rad)

基因

导入装置

(Bio-Rad)

57λ噬菌体转染受体细胞体外包装在离体条件下，将提取的包装蛋白与带COS位点的DNA混合，产生噬菌体颗粒的过程。通过噬菌体的释放和感染将DNA从一个细胞转移到另一个细胞的过程。转导--transductionλ噬菌体转染受体细胞体外包装在离体条件下，将提取的包装蛋白与58体外包装λ噬菌体的头部蛋白完整的噬菌体颗粒λDNA重组分子大肠杆菌体外包装液已商品化,106噬菌斑/μgDNA103～4噬菌斑/μgDNA体外包装λ噬菌体的头部蛋白完整的噬菌体颗粒λDNA重组分子大59二、重组DNA分子的鉴定非转化子转化子非重组子重组子鉴定二、重组DNA分子的鉴定非转化子转化子非重组子重组子鉴定60（一）抗生素平板筛选实为插入失活法AmprTetrKanrAmpsTetsKans单抗生素筛选非转化子转化子阳性重组子自身环化载体未酶解完全载体非目的基因插入载体仅作为初步筛选（一）抗生素平板筛选实为插入失活法AmprTetrK61AmprTerr插入失活的双抗生素对照筛选法AmprTerr插入失活的双抗生素对照筛选法62用PstI酶切DNA连接酶重组质粒目的基因AmprTetrPstI目的基因与pBR322经PstI酶切后进行重组如何筛选得到阳性克隆？思考题用PstI酶切DNA连接酶重组质粒目的基因AmprTetrP63克隆3,5,7,9,10

是阳性克隆AmpTet平板123456789101112123456789101112TetTet转化子非转化子(不能生长)克隆3,5,7,9,10是阳性克隆AmpTet平板123464插入失活筛选法(1’20’’)插入失活筛选法(1’20’’)65（二）X-gal筛选蓝/白筛选见于pUC系列，pEGM系列，M13乳糖葡萄糖+半乳糖β-半乳糖苷酶（Z）β-半乳糖苷酶基因来源Lac操纵子LacZ调节序列载体中编码β-半乳糖苷酶N-末端146个AA序列IPTG诱导宿主编码的β-半乳糖苷酶缺陷型基因+β-半乳糖苷酶（二）X-gal筛选蓝/白筛选见于pUC系列，pEG66AmprMCSLacZ在Laz中插入目的基因AmprMCSLacZ在Laz中插入目的基因67

X-gal蓝色化合物-半乳糖苷酶Lac-Z基因蓝白斑筛选X-gal蓝色化合物-半乳糖苷酶Lac-Z基因蓝白斑筛选68阳性克隆阴性克隆阳性克隆阴性克隆69α互补筛选法（2’37’’）α互补筛选法（2’37’’）70(三）酶切电泳鉴定琼脂糖凝胶电泳限制性内切酶酶切鉴定快速小量提取质粒DNA跑得慢--重组质粒跑得快--空载体以本人课题为例(三）酶切电泳鉴定琼脂糖凝胶电泳限制性内切酶酶切鉴定快速小量71重组CK2α亚基转化子的筛选第2,6,8,10,11,13号克隆是阳性克隆;第1,3,4,5,7,9,12号是阴性克隆重组CK2α亚基转化子的筛选72重组CK2β亚基转化子的筛选第1,2,3,5,7,9,10,11,12,13号克隆是阳性克隆;第4,6,8号是阴性克隆重组CK2β亚基转化子的筛选731.λDNA/EcoRI+HindⅢ2.recombinantplasmid/NdeI+HindIII3.recombinantplasmid/HindIII4.pT7-7/HindIII重组质粒的酶切鉴定1.λDNA/EcoRI+HindⅢ重组质74（四）序列分析以重组DNA为模板，按两侧引物进行PCR可扩增插入片段可直接进行DNA序列分析对于表达型重组子，插入片段必需是正确的序列，一般要进行DNA测序以本人课题为例（四）序列分析以重组DNA为模板，按两侧引物进行PCR可扩增75ABIPRISM310型DNA测序仪主要用于DNA序列分析(包括DNA测序,卫星序列、杂合子序列和三联体序列分析，单链构象多态分析,长片段PCR分析)，遗传疾病诊断，亲子鉴定等美国PE公司,95.8万元ABIPRISM310型DNA测序仪主要用于DNA序列76PE377型DNA测序仪PE377型77PE3700型DNA测序仪PE3700型DNA测序仪78克隆的人蛋白激酶CK2αcDNA

重组质粒中插入片段DNA测序结果pTCKA1测序结果Codon25GAT→GAC,Asp→AsppTCKA2测序结果完全正确pTCKA3测序结果Codon52GAA→GAG，Glu→GlupTCKA4测序结果完全正确克隆的人蛋白激酶CK2αcDNA

重组质粒中插入片段DNA79DNA体外重组技术介绍课件80（五）其他方法内切酶重组DNA目的基因分离电泳印迹到NC膜探针放射性非放射性分子杂交核酸分子杂交（五）其他方法内切酶重组DNA目的基因分离电泳印迹到NC膜探81覆盖滤膜取下沾有菌落的滤膜裂解、变性、固定等与探针杂交放射性自显影1234563和5是阳性克隆菌落或噬菌斑原位杂交覆盖取下沾裂解、与探针放射性123456382菌落印迹杂交(6’03’’)菌落印迹杂交(6’03’’)83SDSpurifiedrecombinanthumanCK2αsubunitanditsWesternblot免疫化学检测（westernblot)用已知的特异抗体检测目的基因蛋白SDSpurifiedrecombinant84SDSpurifiedrecombinanthumanCK2βsubunitanditsWesternblotSDSpurifiedrecombinant85演讲完毕，谢谢观看！演讲完毕，谢谢观看！86第五章DNA体外重组技术第五章DNA体外重组技术87概述一、DNA重组技术相关概念

克隆(clone)来自于同一始祖的一群相同分子、细菌、细胞或动物（常被成为副本或拷贝）。克隆化(cloning)获取大量单一拷贝的过程，也称无性繁殖。概述一、DNA重组技术相关概念克隆(88DNA克隆(DNAcloning)应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子。继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞。再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，又称基因克隆(genecloning)或分子克隆(molecularcloing)。

DNA克隆(DNAcloning)应用酶学的方法，在体外将89“克隆”某一基因或DNA片段过程中，将外源DNA插入载体分子所形成的复制子是杂合分子－嵌合DNA，所以DNA克隆又称重组DNA(recombinantDNA)。

实现DNA克隆所用的方法及相关的工作称DNA重组技术(recombinantDNAtechnology)，又称基因工程(geneticengineering)。“克隆”某一基因或DNA片段过程中，将外源DN90二、DNA重组技术基本程序外源DNA的获取DNA导入受体菌目的基因与载体的连接克隆载体的选择与构建重组体的筛选克隆基因的表达

二、DNA重组技术基本程序外源DNA的获取DNA导入受体菌目91三、DNA重组的基本步骤++连接转化、筛选和鉴定阳性克隆含重组子的阳性克隆载体目的基因分、切、接、转、筛克隆基因表达三、DNA重组的基本步骤++连接转化、筛选和鉴定阳性克隆含重92第一节DNA体外重组载体的种类与选择载体（vector）：能携带外源基因进入受体细胞,并在其中进行扩增或诱导外源基因表达的工具。第一节DNA体外重组载体的种类与选择载体（vector）：能93

作为基因工程载体所需具备的基本条件：1.有自身的复制子，能借助自身的复制和调控对携带的目的基因进行复制和增殖。3.有多个利于选择和筛选的遗传表型或标志，包括抗药性、营养缺陷型、噬菌斑形成及显色反应。2.有多克隆位点(多种酶单一位点)，易于外源DNA分子与载体及重组。4.表达型载体还应有强启动子、前导序列、增强子等调控元件。作为基因工程载体所需具备的基本条件：1.有自身的复制子94（一）按功能分类（二）按受体细胞分类（三）按载体来源分类一、载体的分类克隆型载体表达型载体原核细胞载体真核细胞载体（穿梭载体）原核克隆型载体原核表达型载体真核表达型载体真核转递型载体质粒载体噬菌体载体病毒载体酵母人工染色体粘性载体（一）按功能分类（二）按受体细胞分类（三）按载体来源分类一、95

细菌培养质粒扩增并表达蛋白质大肠杆菌染色质质粒定义:细菌染色质以外的双链环状DNA，能自我复制和表达其携带的遗传信息。二、不同载体的特点与分类（一）质粒载体1.质粒(plasmid)细菌培养质粒扩增并表达蛋白质大肠杆菌染色质质粒定义:细96基因克隆的质粒载体具备的特点：分子相对较小，具有较高的拷贝数含高效的复制子，可用氯霉素阻止细菌蛋白质的合成，非使质粒的拷贝数增加。具有多种遗传选择标记，包括各种抗药基因或营养代谢基因等。基因克隆的质粒载体具备的特点：分子相对较小，具有较高的拷贝数97抗药基因或营养代谢基因氨苄青霉素抗性基因（ampr）:编码β-内酰胺酶，水解ampβ-内酰胺环使amp失效四环素抗性基因（tetr）：编码转膜泵将tet从细胞移出大肠杆菌LacZ基因：编码半乳糖苷酶，分解X-gal，使菌落为蓝色。抗药基因或营养代谢基因氨苄青霉素抗性基因（ampr）:编码β98AmprORITetrpBR322质粒：一种克隆质粒ORI：复制起始点，保证高拷贝自我复制。结构：Ampr,

Tetr：两个抗性基因用于筛选阳性克隆。PstI,BamHI：两个单酶切位点用于插入目的基因AmprORITetrpBR322质粒：一种克隆质粒ORI：99AmprLacZMCSpfxBlue:克隆质粒MCS：MultipleClonningSite提供多个单酶切位点用于克隆操作LacZ:蓝白斑筛选阳性克隆AmprLacZMCSpfxBlue:克隆质粒MCS：Mu100pUC18/pUC19pUC192686bpAmprLacZP(BLA)PlacOriAvaI(413)BamHI(418)EcoRI(397)HindIII(448)PstI(440)SmaI(415)XmaI(413)ApaLI(178)ApaLI(1121)ApaLI(2367)MCSpUC18/pUC19pUC192686bpAmprLac101pcDNA3：真核细胞表达质粒Pcmv：CMV增强子/启动子驱动目的基因在真核细胞内表达BGHpA：加尾信号目的基因转录后加上polyA尾，使其更稳定。pcDNA3：真核细胞表达质粒Pcmv：CMV增强子/启动子102（二）噬菌体

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JattxisNclcroOPQSR结构区重组区调控区裂解区cos位点

cos位点ARAREcoRI目的基因EcoRIEcoRI插入型置换型（二）噬菌体AWBDEFZJatt103

噬菌体作为载体具有两个特点①噬菌体生长繁殖所必需的序列位于其左右二臂上，噬菌体基因组中央含有30%的DNA是噬菌体生长所非必需的。②噬菌体的成熟需要包装，当与外源DNA重组后的大小介于原来的75%～105%之间时，重组的DNA分子才可包装为成熟的噬菌体颗粒。

噬菌体的种类：Charon系列、gt系列、EMBL系列噬菌体作为载体具有两个特点①噬菌体生长繁殖104（三）粘粒载体（cosmid)质粒序列：复制原点，抗性标志噬菌体：cos粘端序列插入片段长度可以是载体本身长度的7-10倍（三）粘粒载体（cosmid)质粒序列：复制原点，抗性标志105（四）酵母人工染色体载体(YAC)质粒pBR322衍生物酵母基因着丝粒端粒自主复制顺序复制起点(ori)Ampr基因组成用途构建真核生物基因组DNA文库（四）酵母人工染色体载体(YAC)质粒pBR322衍生物酵106第二节基因工程中常用工具酶第二节基因工程中常用工具酶107一、限制性核酸内切酶(II型)切——分子克隆的手术刀定义：由细菌自己产生的一种能识别和切割DNA内部特定序列的一类核酸酶有严格的识别、切割顺序，以内切方式水解双链DNA中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5′端为P，3′端为OH。识别顺序一般为4～6个碱基，通常为回文结构，即具有180°反向重复。如CATATG一、限制性核酸内切酶(II型)切——分子克隆的手术刀定义：由108(1).产生平头末端(bluntend)HaeⅢ*************GGCC**************************CCGG*************5′3′5′3′Ⅱ型酶切割双链DNA产生：一、限制性核酸内切酶EcoR

I**********GAATTC******************CTTAAG********5′3′5′3′(2).产生粘性末端(stickyend)(1).产生平头末端(bluntend)HaeⅢ****109一、限制性核酸内切酶酶单位定义：在适当反应条件下，1h内在50μl体系中完全酶解1μg特定DNA底物所需酶量，定为1个活性单位。出售的内切酶几乎均以λDNA作底物测其酶活性单位。星活性:酶切反应条件不能满足最适条件,导致某些酶产生第二活性.EcoR

I*GAATTCAATT一、限制性核酸内切酶酶单位定义：在适当反应条件110标准的酶切体系1μgDNA，20μl总反应体积，1U酶，推荐的Buffer和温度，反应1h酶切体系组成内切酶根据实验目的选择，保存，使用，稀释（避免失活与污染）DNA底物纯度，含量反应buffer严格按产品说明书高、中、低盐酶切反应体系的建立：标准的酶切体系1μgDNA，20μl总反应体积，1U酶，推荐111酶切温度与时间一般为37℃,1h酶切反应过程容积：20μl，50μl,酶容积≤10%,即甘油≤5%注意混匀反应终止：三种方法:①10mMEDTA或0.1%SDS;②65℃，20min;③酚/氯仿抽提，乙醇沉淀酶切鉴定：琼脂糖凝胶电泳酶切反应体系的建立：酶切温度与时间一般为37℃,1h酶切反应过程容积：2112二、DNA聚合酶含3种酶活性：1.大肠杆菌DNA聚合酶I5′→3′聚合酶活性

5′→3′外切酶活性3′→5′外切酶活性催化DNA缺口平移反应,制备DNA探针(5′→3′外切酶活性)主要用途DNA序列分析应用：二、DNA聚合酶含3种酶活性：1.大肠杆菌DNA聚合酶I5113二、DNA聚合酶I2.Klenow片段随机引物标记法标记探针主要用途双脱氧末端终止法进行DNA测序cDNA第二链的合成DNA3′突出末端进行末端标记用途：(大肠杆菌DNA聚合酶I大片段，缺5′→3′外切酶活性)二、DNA聚合酶I2.Klenow片段随机引物标记法标记探114二、DNA聚合酶IPCR反应主要用途DNA测序用途：3.TaqDNA聚合酶(65kD)耐热，在70～75℃时具有最佳的生物活性，无3′→5′外切酶活性(无校正功能）二、DNA聚合酶IPCR反应主要用途用途：3.Taq1154.反转录酶

(ReverseTranscriptase,RT)功能：以RNA为模板，以带3′-OH末端的DNA片段为引物，沿5′至3′方向合成DNA链。3′AAAAAAUCUGUCCUA……5′dNTPMg2+反转录酶3′AAAAAAUCUGUCCUA……5′5′TTTTTTT—OH3′AGACAGGAT……3′1.RNA指导的DNA聚合酶活性5′TTTTTTT4.反转录酶

(ReverseTranscriptase,1162.DNA指导的DNA聚合酶活性；RNA酶H(3′→5′RNA外切酶)活性.4.反转录酶功能：后者可降解DNA-RNA杂交分子中的RNA反转录酶缺乏3′→5′核酸外切酶活性,故未校正功能,会出现错配.应用最主要是将mRNA逆转录为cDNA2.DNA指导的DNA聚合酶活性；RNA酶H(3′→5′R117三、DNA连接酶(DNAligase)

——基因工程的缝纫针

催化双链DNA相邻碱基5′P和3′-OH间磷酸二酯键形成的酶。T4噬菌体DNA连接酶最常用

①催化两个独立DNA片段(粘性末端和平末端)

5′P和3′-OH之间形成磷酸二酯键。主要功能与用途：催化平末端连接要比粘性末端效率低得多。②修复双链DNA分子中单链缺口。三、DNA连接酶(DNAligase)

118三、DNA连接酶(DNAligase)修复双链DNA分子中单链缺口,并可催化互补粘性末端的连接.主要用于cDNA第二链的合成.主要功能与用途：(二)大肠杆菌DNA连接酶连接粘性末端可代替T4DNA连接酶.三、DNA连接酶(DNAligase)修复双119四、其他修饰酶功能：催化多个脱氧核苷酸依次加到单链或双链DNA分子的3′-OH末端。(一)末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)

用途：1.主要作用是在载体或目的基因3′末端加上同源多聚尾巴，形成人工粘性末端，便于DNA重组。2.DNA3′末端的同位素标记。四、其他修饰酶功能：催化多个脱氧核苷酸依次加到单链或双链DN120催化DNA，RNA以及核糖和脱氧核糖三磷酸上的5′磷酸基团水解。用途：1.在连接反应中去除载体DNA片段5′-P，防止载体自我连接.2.用32P标记5′末端时，用此酶去除5′-P，再用激酶进行5′的32P标记.(二)碱性磷酸酶功能：(三)多聚核苷酸激酶(四)RNase(五)DNase催化DNA，RNA以及核糖和脱氧核糖三磷酸上的5′磷酸基121第三节目的基因的获得和修饰分通过基因组文库分离、筛选基因通过cDNA文库分离、筛选基因应用PCR或RT-PCR获得目的基因人工合成基因第三节122一、采用限制性内切酶酶切法直接分离目的基因从原核基因组中制备从真核基因组中制备二、采用PCR或RT-PCR方法制备目的基因获得已知的基因构建RT-PCR文库法并获得未知基因计算机克隆一、采用限制性内切酶酶切法直接分离目的基因从原核基因组中制备123三、基因组文库或cDNA文库的构建和筛选

基因组文库(genomiclibrary，G文库)用基因克隆的方法保存宿主细胞中的DNA重组分子中的集合,所有重组子所含的插入片段的总和代表某种生物基因组全部核苷酸序列。分离、筛选基因方法：分子杂交及探针技术用目的基因上的一段DNA做成探针与文库中的DNA作核酸杂交，从基因文库中“钓出”有目的基因的克隆。G文库构建方法：鸟枪法三、基因组文库或cDNA文库的构建和筛选基因124

cDNA文库(cDNAlibrary，C文库)用基因克隆的方法保存在宿主细胞中的DNA重组体的群体，每一重组子只含一种mRNA信息，这些重组子的总和包含某种生物的全部mRNA序列。C文库构建方法：反转录法合成的cDNA与合适的载体重组并导入宿主细胞而形成的分离、筛选基因方法：分子杂交及探针技术C文库的优势与局限性cDNA文库(cDNAlibrary，C文125本方法适用于氨基酸残基数目较少的蛋白基因。缺点：2.如目的基因DNA序列需通过氨基酸序列推测，难于保证与天然基因序列一致，往往导致表达效率大大降低。使用DNA合成仪1.只能合成较小片段的DNA四、化学合成法制备基因片段本方法适用于氨基酸残基数目较少的蛋白基因。缺点：126第四节目的基因的载体连接--接，分子克隆的核心第四节目的基因的载体连接127一、PCR产物的克隆策略（一）限制性内切酶酶切位点添加法（二）T/A克隆法一、PCR产物的克隆策略（一）限制性内切酶酶切位点添加法128定向克隆将外源DNA片段定向插入到载体中的方法对于双向插入，如为扩增型载体并无影响；如为表达型载体，反向插入则可导致不表达，故一定要保证正向插入常用方法：双酶切定向克隆将外源DNA片段定向插入到载体中的方法129NdeICATATGGTATACHindⅢAAGCTTTTCGAANdeICATATGGTATACHindⅢAAGCTTTT130TA克隆定义

利用嗜热聚合酶如Taq聚合酶的模板非依赖性末端转移酶活性(在70～75℃活性高)，使PCR产物的3′末端加一个A的粘性端，将其直接克隆至3′粘性末端含一个T的线性克隆载体中.3′5′T载体3′5′载体T3′5′3′5′AAPCR产物TA克隆定义利用嗜热聚合酶如Taq聚合酶的模板非依赖131常规的克隆方法：PCR产物载体酶切酶切后PCR产物酶切后载体重组分子连接不足：①需要酶切②受酶切位点的限制常规的克隆方法：PCR产物载体酶切酶切后PCR产物酶切后载体132TA克隆方法(一步PCR克隆)PCR扩增+3′3′5′PCR产物AA5′T载体TT5′5′3′3′连接转化蓝白筛选校正聚合酶平端PCR产物Taq酶dATPTA克隆方法(一步PCR克隆)PCR扩增+3′3′5′PCR133（一）粘性末端连接法用同一种限制性内切酶酶切DNA连接酶重组质粒质粒目的基因适用于插入片段和载体具有相同的粘性末端高背景(自身环化)多拷贝插入双向(正、反)插入单酶切缺陷二、外源DNA片段和载体的连接（一）粘性末端连接法用同一种DNA连接酶重组质粒质粒目的基因134（二）平头末端连接法质粒产生平末端的内切酶DNA连接酶产生粘性末端的内切酶核酸酶S1目的基因重组质粒产生粘性末端的内切酶核酸酶S1本法适用于在质粒和目的基因上没有相同的酶切位点！（二）平头末端连接法质粒产生平末端的DNA连接酶产生粘性末端135（三）人工接头法用同一种限制性内切酶酶切DNA连接酶重组质粒质粒目的基因++DNA连接酶接头(linker)本法适用于在质粒和目的基因上没有相同的酶切位点（三）人工接头法用同一种DNA连接酶重组质粒质粒目的基因++136（四）同聚物接尾法DNA连接酶重组质粒质粒目的基因内切酶末端转移酶

+dGTP末端转移酶+dCTP本法适用于在质粒和目的基因上没有相同的酶切位点连接反应：16℃，16h如何实现？（四）同聚物接尾法DNA连接酶重组质粒质粒目的基因内切酶末端137第五节重组分子的扩增和鉴定第五节重组分子的扩增和鉴定138宿主细胞：被导入重组分子的细胞宿主细胞原核细胞：大肠杆菌、链霉菌及枯草杆菌真核细胞：酵母、昆虫细胞及哺乳动物细胞一、重组DNA分子导入受体细胞转宿主细胞：被导入重组分子的细胞宿主细胞原核细胞：大肠杆菌、链139大肠杆菌的转化

转化(transformation)转化原意：细菌细胞的生物学特性由于受纳了外源DNA而发生可遗传的改变。质粒DNA或以质粒为载体构建的重组DNA导入细菌的过程转化的关键：感受态细菌的制备大肠杆菌的转化转化(transformation)转化140感受态细胞competentcell用理化方法人工诱导细胞，使之处于易于吸收和容纳外源DNA分子的状态，此时的细菌称～。转化原理及转化、转染程序大肠杆菌膨胀成球形CaCl20～4℃DNA抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物附着细胞表面42℃90s热休克细胞吸收复苏分裂增殖原理化学转化法感受态细胞competentcell141重组质粒的导入方法化学法：需感受态细胞电击法：不需感受态细胞转化程序：对数生长期的细菌CaCl20～4℃感受态细菌(4℃保存24h)重组质粒DNA+细菌4℃30min热休克(42℃,90s)普通培养基温育涂布于含抗生素的培养基平板单菌落倒置培养37℃重组质粒的导入方法化学法：需感受态细胞转化程序：对数生长期的142基因

导入装置

(Bio-Rad)

基因

导入装置

(Bio-Rad)

143λ噬菌体转染受体细胞体外包装在离体条件下，将提取的包装蛋白与带COS位点的DNA混合，产生噬菌体颗粒的过程。通过噬菌体的释放和感染将DNA从一个细胞转移到另一个细胞的过程。转导--transductionλ噬菌体转染受体细胞体外包装在离体条件下，将提取的包装蛋白与144体外包装λ噬菌体的头部蛋白完整的噬菌体颗粒λDNA重组分子大肠杆菌体外包装液已商品化,106噬菌斑/μgDNA103～4噬菌斑/μgDNA体外包装λ噬菌体的头部蛋白完整的噬菌体颗粒λDNA重组分子大145二、重组DNA分子的鉴定非转化子转化子非重组子重组子鉴定二、重组DNA分子的鉴定非转化子转化子非重组子重组子鉴定146（一）抗生素平板筛选实为插入失活法AmprTetrKanrAmpsTetsKans单抗生素筛选非转化子转化子阳性重组子自身环化载体未酶解完全载体非目的基因插入载体仅作为初步筛选（一）抗生素平板筛选实为插入失活法AmprTetrK147AmprTerr插入失活的