细胞工程7胚胎干细胞培养课件

CELLENGINEERING细胞工程CELL细胞工程1第一章绪论4个学时

第二章实验室配置及基本技术2个学时

第三章植物细胞工程的理论基础4个学时

第四章植物组织器官培养技术6个学时

第五章植物细胞培养及次生代谢产物生产3个学时

第六章原生质体培养和体细胞杂交3个学时

第七章人工种子及植物种质资源保存2个学时

第八章胚胎干细胞培养2个学时第九章动物细胞培养4个学时

第十章动物细胞融合与单克隆抗体4个学时

第十一章动物组织与胚胎工程1个学时

第十二章试管动物与克隆动物1个学时

课程初步安排：36学时

第一章绪论2第七章胚胎干细胞培养干细胞是什么ES/EG细胞的培养及建系技术ES/EG细胞的体外诱导分化诱导分化细胞的永生化ES/EG细胞技术学在医学中的应用ES/EG细胞技术学面临的问题和研究趋势第七章胚胎干细胞培养干细胞是什么3一、干细胞（stemcells）是什么•具有无限的或延长的自我更新能力的细胞•能产生至少一种类型的高度分化的细胞一、干细胞（stemcells）是什么•具有无限的或延4

从具有的分化潜能上讲：--专能干细胞--多能干细胞--全能干细胞从具有的分化潜能上讲：5从组织发生即来源上讲：

--胚胎性干细胞--成体干细胞/组织干细胞从组织发生即来源上讲：6胚胎性干细胞是一类来自早期胚胎、原始生殖细胞等源于胚胎的干细胞，基本特征是有稳定地在体外自我更新、稳定地维持正常核型和发育全能或多能性、能够分化为属于三胚层范畴的各种类型分化细胞，甚至参与个体发育。--来自早期胚胎：胚胎干细胞（embryonicstemcells,ES）--来自胚胎生殖嵴中的原始生殖细胞：胚胎生殖细胞（embryonicgermcells,EG）--来自畸胎瘤组织：胚胎性癌细胞（embryonalcarcinomacells,EC）胚胎性干细胞是一类来自早期胚胎、原始生殖细胞等源于胚胎的干细7－－1981年，Evens和Martin分别成功的分离和体外培养了小鼠的胚胎干细胞；－－1995年，Thomson等人分离建立了第一株灵长类动物的胚胎干细胞；－－1998年，Thomson等建立了第一株人类胚胎干细胞；－－1998年，Shamblott等建立了第一株人类生殖干细胞；－－2002年3月，美国麻省理工学院科学家宣布，他们首次利用人体胚胎干细胞培育出毛细血管，证明了胚胎干细胞技术在治疗心血管疾病等领域的应用潜力；－－目前已有报导，ES细胞在离体适当条件下分化为心肌细胞，胰岛细胞及血管内皮细胞，肝细胞等。－－1981年，Evens和Martin分别成功的分离和体外8成体干细胞（adultstemcells,AS），也叫作组织干细胞（tissuestemcells）是指一群分布在成体组织中处于尚未分化的、具有自我更新并负有构建和补充某种组织的各种类型细胞潜能的干细胞。如骨髓的造血干细胞、间充质干细胞；神经系统的神经干细胞；肝干细胞；骨骼肌干细胞等。--造血干细胞可分化为血液系统的各种细胞；小肠和皮肤中的干细胞具有分化、补充和更新小肠和皮肤组织的能力。--骨髓干细胞除了形成各种血细胞和衍生于间质细胞的各类细胞外，还可被诱导分化为神经细胞、肌肉细胞、骨和肝细胞等不同分化细胞。成体干细胞（adultstemcells,AS），也叫9细胞工程7胚胎干细胞培养课件10二、ES/EG细胞的培养建系技术

分离囊胚的内细胞群与成纤维细胞共培养，ES细胞非分化增殖分离胚胎生殖腺细胞胚胎干细胞的鉴定定向诱导分化功能细胞二、ES/EG细胞的培养建系技术11细胞工程7胚胎干细胞培养课件121、ES/EG细胞的来源(1)发育良好的囊胚，从中分离ICM，进一步分离培养ES细胞(2)从胚胎生殖腺中分离出EG细胞从畸胎瘤中分离出EC细胞治疗性克隆即体细胞核转移（SCNT）途径分离培养ES细胞

1、ES/EG细胞的来源(1)发育良好的囊胚，从中分离ICM13细胞工程7胚胎干细胞培养课件14细胞工程7胚胎干细胞培养课件152、ES/EG细胞的分化抑制培养目前常用的细胞分化抑制物主要有三种:--饲养层细胞(feederlayer)--特殊细胞的条件培养液(conditionedmedium),如BRL(Buffaloratliver)细胞条件培养液--分化抑制因子(differentiationinhibitoryfactor,DIF),如白血病抑制因子(leukemiainhitoryfactor,LIF)2、ES/EG细胞的分化抑制培养目前常用的细胞分化抑制物主16饲养层细胞培养法：常用的饲养层细胞有下列两种：（1）MEF细胞(mouseembryonicfibroblast)，取自各种品系小鼠的12dpc胚胎。经剪碎和胰蛋白酶消化，常规分散细胞培养为单层散布的成纤维细胞。（2）STO细胞，来自SIM小鼠(S)胚胎的对硫代鸟嘌呤(T)和乌本苷(O)有抗性的成纤维细胞系，能分泌干细胞生长因子(stemcellfactor,SCF)以及白血病抑制因子(leukemiainhibitoryfactor,LIF)。饲养层细胞培养法：常用的饲养层细胞有下列两种：17无饲养层培养法：饲养层细胞的制备在一定程度上使ES/EG细胞培养显得较繁杂。近来以添加LIF生长因子或某些特定细胞的条件培养液至含FCS的正常培养液，借此替代饲养层细胞：（1）直接在ES细胞基础培养液中加入重组LIF（2）Buffalo大鼠肝细胞条件培养液(BRL-CM)（3）2～3周幼年大鼠心肌细胞条件培养液(RH-CM)无饲养层培养法：饲养层细胞的制备在一定程度上使ES/EG细胞183、ES/EG细胞系的特性和鉴定（1）形态学特征（2）发育全能性和分化潜能鉴定（3）嵌合体动物3、ES/EG细胞系的特性和鉴定（1）形态学特征（2）发育全19（1）形态学特征

体外培养小鼠ES/EG细胞在抑制分化培养中呈现一个或几个核仁、且核质比高的圆形或卵圆形细胞，彼此均呈单层或多层紧密堆积而形成岛状或巢状群体生长形态，组成克隆的细胞彼此界限不清楚，粘连性强。

人ES与EG细胞的形态学特征有所不同，与小鼠ES/EG也有所不同。单层培养时，人体ES细胞呈扁平状群落，且细胞界限清楚。（1）形态学特征体外培养小鼠ES/EG细胞在抑制分化培养中20（2）发育全能性和分化潜能鉴定

小鼠和包括人在内的灵长类动物全能或多能性胚胎性干细胞，具有特有的表达标志以及在体内外的分化特点。（2）发育全能性和分化潜能鉴定小鼠和包括人在21干细胞标记鼠类EC鼠类ES鼠类EG人类EC人类ES人类EGSSEA-1+++--+SSEA-3---+++SSEA-4---+++TRA-1-60---+++TRA-1-80---+++AKP++++++Oct-4++++？+小鼠与人类多能干细胞标记蛋白表达谱干细胞标记鼠类EC鼠类ES鼠类EG人类EC人类ES人类EGS22SSEAs(stage-specificembryonicantigen):时期专一性胚胎抗原TRA-1-60、TRA-1-81:肿瘤排斥抗原AKP：碱性磷酸酶在小鼠及灵长类的ES细胞中活性较高，在已分化细胞中活性明显降低；

Oct-4:是生殖系专一性转录因子。作为和胚胎发育全能/多能性相关的转录因子，Oct-4通过多种调控机制激活或抑制不同靶基因的转录，在细胞的全能/多能性及未分化状态的调控和维持中发挥重要作用。端粒酶(telomerase):一类核糖核蛋白，与维持真核细胞染色体末端的端粒长度和控制细胞寿命有关。人ES细胞的端粒酶活性高，而分化细胞一般难以检测到；胚胎干细胞的特异性表达标志：SSEAs(stage-specificembryoni23ES/EG细胞在体外被刺激分化为各种类型细胞是其最基本的属性;ES/EG细胞接种于同一品系的小鼠或免疫缺陷小鼠腹股沟、眼窝、腹腔等可以形成由内胚层、中胚层和外胚层细胞构成的畸胎瘤。胚胎干细胞的体内、外分化特点：ES/EG细胞在体外被刺激分化为各种类型细胞是其最基本的胚24

组织和器官的细胞由含有两个或两个以上基因型构建而成的完整个体称为嵌合体动物（chimaera）。把ES/EG细胞注入胚泡或与桑椹胚聚集，使其与正常胚胎结合在一起，并参与宿主胚胎发育，可形成嵌合体动物的各种组织和器官，包含生殖系嵌合体动物可通过毛色、皮肤颜色等外观指标进行判定或是取器官组织进行同功酶检测(3)嵌合体动物组织和器官的细胞由含有两个或两个以上基因型构建而成的完整25三、ES/EG细胞的体外诱导分化三、ES/EG细胞的体外诱导分化261、基本原理细胞诱导分化是一个细胞与其微环境相互间复杂而又精密协调的分子细胞学过程，是胚胎正常发育过程中重要而基本的现象；

ES细胞是体外研究诱导分化的较理想模型，在体外被诱导分化的途径可能与在体胚胎细胞的不完全相同；在体胚胎的细胞分化过程中，诱导作用的结果不只是决定于各种诱导物质的性质和专一性，同时也决定于被诱导细胞的反应能力(competence)。后者受遗传、发育潜能等内在因素的限制；1、基本原理细胞诱导分化是一个细胞与其微环境相互间复杂而又27

ES细胞体外诱导分化实验中，所用诱导物质繁多，诱导模式不尽相同，按其作用机理大致分为两类：--使被诱导细胞可逆性轻度损伤，导致神经细胞分化无机物、有机酸、醇、亚甲基盐、硫氢化物等--诱导物通过其与被诱导细胞表面的受体结合而诱导细胞分化类固醇激素、维甲酸衍生物、多肽生长因子等

同一种诱导物可以诱导出不同类型细胞或变化多端的构造，不仅涉及诱导剂的浓度差别、诱导作用模式和微环境的未知因素等，而且可能与被诱导细胞本身的发育潜能和对诱导剂的反应性等差别有关。ES细胞体外诱导分化实验中，所用诱导物质繁多，诱导模式同28

ES细胞体外诱导分化途径可分为：--谱系分化（lineagedifferentiation），有利于认识组织谱系细胞分化机理和全过程。ES细胞谱系祖细胞谱系定型细胞终末分化细胞--定向分化（committeddiffereniation），需设法控制导向产生单一类型的分化细胞。对ES细胞转染细胞专一的转录因子、标志基因、细胞分化因子结合报告基因和诱导条件选择等手段，探索定向诱导分化途径ES细胞体外诱导分化途径可分为：29细胞工程7胚胎干细胞培养课件30细胞工程7胚胎干细胞培养课件312、ES细胞体外诱导分化的基本方法单层ES细胞培养和诱导分化：较难分化为单一类型的细胞ES细胞拟胚体形成和诱导分化：相对诱导分化细胞类型较单一,具体方法有：（1）软琼脂培养（2）悬滴培养

2、ES细胞体外诱导分化的基本方法单层ES细胞培养和诱导分化32制备ES单细胞悬浮液培养皿盖上接种20ul/滴，直径10cm的培养皿盖盖上带有悬浮细胞小滴的盖子培养皿内加PBS培养皿边缘用膜封置37℃，5％CO2培养箱培养3d后，转移拟胚体至含细胞分化诱导剂的培养皿或微孔板进一步培养然后,移放入铺有0.1%白明胶的培养皿或微孔板内在培养液中再培养可被诱导分化为不同类型细胞ES细胞体外悬滴培养制备ES单细胞悬浮液培养皿盖上接种20ul/滴，直径10cm333、ES细胞体外诱导分化举例造血细胞内皮细胞与血管神经细胞脂肪细胞心肌和其他肌肉细胞软骨细胞胰岛细胞3、ES细胞体外诱导分化举例造血细胞34小鼠ES细胞拟胚体在体外可以分化为类似于早期胚胎卵黄囊血岛样的结构并分化产生各种造血系统的细胞：①用胰蛋白酶消化小鼠ES细胞拟胚体成单个细胞，经干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)和条件培养液处理，诱导其定向分化为造血干细胞；②用原代骨髓基质细胞作饲养层和SCF及IL-6细胞因子处理可进一步使ES细胞来源的造血干细胞分化为B淋巴细胞系。造血细胞小鼠ES细胞拟胚体在体外可以分化为类似于早期胚胎卵黄囊血岛样35内皮细胞与血管小鼠ES细胞拟胚体在体外可以分化为类似于早期胚胎卵黄囊血岛样的结构，其中也有内皮细胞出现：①利用经转化生长因子β1(TGF-β1)基因转染的小鼠ES细胞在含RA培养液中经悬滴培养形成拟胚体；②再继续贴壁培养，发现拟胚体周围呈辐射状长出许多血管样结构。将外源重组TGF-β1添加至培养液，同样也能诱导内皮细胞组成的血管样结构。内皮细胞与血管小鼠ES细胞拟胚体在体外可以分化为类似于早期胚36心肌和其它肌肉细胞

悬浮或悬滴培养的小鼠ES细胞拟胚体在RA诱导条件下贴壁生长数天，常出现某些分化细胞集落具有节律性自发收缩的现象，显然是肌细胞：DMSO诱导ES细胞拟胚体可以形成心肌、平滑肌和骨骼肌等多种类型肌细胞，用肌肉专一性的调节因子MyoD基因转染ES细胞并结合DMSO诱导处理，额外表达MyoD基因的ES细胞主要分化为骨骼肌且常融合成肌管。心肌和其它肌肉细胞悬浮或悬滴培养的小鼠ES细胞拟胚体在RA37ES细胞定向诱导分化是至今仍未解决、正在探索中的问题。根据国外少数报道和国内的经验，对ES细胞转染细胞专一的转录因子、标志基因或是有关细胞分化因子等遗传操作，并结合诱导条件选择等手段，是一条可能的探索ES细胞定向诱导分化的途径。ES细胞定向诱导分化是至今仍未解决、正在探索中的问题。根据国38四、ES/EG细胞诱导分化细胞的永生化

寻找建立ES/EG细胞诱导产生的分化细胞永生化途径是目前ES/EG细胞研究领域待解决的问题。四、ES/EG细胞诱导分化细胞的永生化寻39五、ES/EG培养与诱导分化的意义哺乳类发育的体外模型人体的基因和细胞治疗组织工程的种子细胞来源五、ES/EG培养与诱导分化的意义哺乳类发育的体外模型人体40细胞工程7胚胎干细胞培养课件41哺乳动物早期胚胎一般体积很小，又在宫内发育，在体内研究胚胎发育和各类细胞分化及其机理几乎不可能；ES细胞具有完整的发育潜能性，而且对所有调节正常发育的信号具有应答能力。虽然ES细胞体外分化途径和机制与在体胚胎不完全相同，但在分子水平有共同或相似之处，是研究特定类型细胞分化、某些前体细胞起源和细胞谱系演变较理想的实验体系；许多国家在法律上禁止以克隆或复制人为目的的前提下，已允许将人ES细胞类似于小鼠ES细胞体外实验一样，用于研究人类胚胎发育、分化和调节信号等事件。哺乳类发育的体外模型哺乳动物早期胚胎一般体积很小，又在宫内发育，在体内研究胚胎发42人体的基因和细胞治疗

这里的基因治疗是指用遗传改造过的人体细胞直接移植或输入病人体内，达到控制和治愈疾病为目的的治疗手段，又称细胞治疗。人体的基因和细胞治疗这里的基因治疗是指用遗传43目前常说的基因治疗技术虽然能把编码正常序列的基因导入突变细胞而使突变基因的功能得到纠正，但导入基因的整合和表达难以精确控制，特别是基因插入后对其他基因产生的效应尚无法预知。更大问题是，许多被用作基因操作的细胞在体外不易稳定地被转染和增殖传代；ES细胞是基因治疗的较理想的靶细胞，经遗传操作后一般仍能稳定地在体外增殖传代，克服了目前基因治疗中需要大量靶细胞来源的主要问题。目前常说的基因治疗技术虽然能把编码正常序列的基因导入44定向诱导分化，选择治疗因子基因表达

人ES细胞基因操作（克服免疫学障碍）

多种MHC组合的ES细胞库

组织谱系干细胞（如造血干细胞）

功能性分化细胞（如神经细胞）移植移植

不同类型疾病的宿主

基因组被改造的ES细胞异源性基因表达基因修饰

基因敲除、敲入定向诱导分化选择

组织谱系干细胞或功能性分化细胞移植图2-2-1用于基因和细胞治疗的人ES细胞工程示意图基本策略1定向诱导分化，选择治疗因子基因表达人ES细胞基因操作45基本策略2欲接受细胞治疗患者的体细胞核导入去核卵细胞体外发育胚泡期专用ES细胞特化细胞分离培养体外诱导分化回输基本策略2欲接受细胞治疗患者的导入去核卵细胞体外发育46细胞治疗的临床应用前景神经系统疾病骨和软骨疾病血液病肝病细胞治疗的临床应用前景神经系统疾病47神经系统疾病

根据小鼠ES/EG细胞研究资料，由于各种类型神经细胞因某种原因死亡而成熟神经细胞又不能分裂、补充和替代死亡细胞引起的神经系统疾病如Parkinson’s疾病，Alzheimer’s病、多发性硬化症等，有望通过人ES/EG细胞进行细胞治疗。新近，产生多巴胺的神经细胞已能从小鼠ES细胞衍生而来，为细胞治疗Parkinson’s病的ES细胞来源问题提供实验依据。神经系统疾病根据小鼠ES/EG细胞研究资料，由于各种类型神48骨和软骨疾病ES/EG细胞可能在体外被诱导为骨和软骨，这些细胞被导入骨关节炎患者的关节软骨损伤区域，或因骨折、手术而引起的较大骨隙中，这类从ES细胞衍生的骨和软骨细胞在被移植部位自我修复的优点远远超过现行的组织移植。骨和软骨疾病ES/EG细胞可能在体外被诱导为骨和软骨，这些细49血液病ES和造血干细胞研究有助于产生供细胞移植用的、不含有镰刀状血球突变的血细胞。血液病ES和造血干细胞研究有助于产生供细胞移植用的、不含有50肝病利用肝干细胞移植治疗肝病取得了重要进展。肝病利用肝干细胞移植治疗肝病取得了重要进展。51

组织工程的种子细胞来源人体ES细胞技术学的发生和发展，有望解决目前组织或器官修复中的难题。组织工程的种子细胞来源人体ES细胞技术学的发生和发52

设想是选择与人体细胞兼容性较好的生物材料，按缺损组织或器官的要求设计制成模型或支架放在体外培养系统中，使ES细胞或其定向诱导分化细胞沿着模型或支架不断地生长扩增，构建成新的组织或器官。但ES细胞定向分化和构成组织和器官中细胞类型的复杂性等诸多问题尚待解决；

目前工作是着重于从成年或幼年器官和组织的碎片中分离、培养和扩增某一类型的组织干细胞，经过体外培养扩增有可能作为组织工程的种子细胞来源。例如，从骨髓分离和扩增间质干细胞(mesenchymalstemcell,MSC)，用作骨折愈合、肌腱韧带修复、肌肉再生和造血重建等组织工程的种子细胞。设想是选择与人体细胞兼容性较好的生物材料，按缺损组织或器官53六、ES细胞研究面临的问题和研究趋势--如何解决用于人类胚胎干细胞研究的胚胎来源问题？--如何分离、纯化干细胞？--如何保持体外培养胚胎干细胞的全能性，并控制定向诱导分化？--如何使ES细胞诱导分化产生的分化细胞永生化？--分化后的细胞是否有致瘤性？--如何使干细胞在体外发育成完整的器官？--如何克服分化细胞移植后仍有可能发生的免疫排斥？--有关伦理道德和法律以及商业应用等问题六、ES细胞研究面临的问题和研究趋势--如何解决用于人类胚54--改善ES细胞的体外培养条件，建立更有效、更简便的获得ES细胞的方法；--定向诱导分化成特定类型细胞，用于临床疾病治疗并解决免疫排斥和潜在的致肿瘤的问题；--成体干细胞的横向分化的能力以及与胚胎干细胞的比较：成体干细胞能否替代胚胎干细胞？--改善ES细胞的体外培养条件，建立更有效、更简便的获得55嵌合体一词的英文是chimera，源于希腊神话，是指狮子头、山羊身和蛇尾的雌性怪物。有关嵌合体神话在各国文化中都有嵌合体的科学概念则是，任何由两个或两个以上遗传上不同的组织构成的机体。它可以是任何不同物种的混合，但目前较关注的是动物与人的嵌合体。嵌合体与杂合体（hybrid）不同。杂合体是由来自不同物种的两个配子形成一个合子。一个杂合体的所有细胞来源于这一合子。嵌合体一词的英文是chimera，源于希腊神话，是指狮子头、56

最近美国政府封杀了斯坦福大学的一项向小鼠大脑植入人类神经干细胞的研究，引起了国际学界和公众的关注。这项研究是当前干细胞研究前沿的一个重要方面，涉及到一个机体拥有两种不同物种的细胞或组织，这种嵌合体研究引起许多新颖的伦理问题，激发了对这类研究应该采取什么行动的伦理争论。最近美国政府封杀了斯坦福大学的一项向小鼠大脑植57第一是为了建立动物模型。

例如世界上首次克隆牛的华裔美籍科学家杨向中创造了兔子的人类心脏病模型，可以表达人类引致心脏病的基因；而原来用大鼠建立的模型不能表达人的基因，用大鼠模型试验的药物对人体无用为什么要创建嵌合体呢？第一是为了建立动物模型。为什么要创建嵌合体呢？58干细胞移植到病人体内后如何行为？它们如何分化、移动和形成新组织？在人身上试验不道德，应首先在动物身上研究。将人类干细胞注射入动物体内，引起两方面的问题：一是在生殖方面，如果将人胚胎干细胞注射入动物胎儿，尤其在很早期，它们很可能移动到发育机体的生殖系产生人类的精子和卵。如果这两个嵌合体交配，一个人类精子使一个人类卵受精，结果在一个动物子宫生长出一个人类胚胎。如果这种动物（例如嵌合体小鼠）产生的人类精子和卵，用体外受精方法产生一个孩子，他或她的父母是一对小鼠？这对孩子将是非常尴尬的。二是在脑方面。如果Weissman设想的有100%人类神经细胞的小鼠有一天站起来说：“嗨，我是米老鼠！”那时我们对它该怎么办？这种可能似乎不大。理由是意识肯定不发生在细胞层次，鼠脑又不到人脑大小的千分之一。但如果将人类干细胞注射入黑猩猩胚胎内，拥有100%人类神经细胞的黑猩猩是否会发育生长出具有某种人性的功能，就很难说了。第二是为了进行干细胞研究。干细胞移植到病人体内后如何行为？它们如何分化、移动和形成新组59

人体发生过程：受精卵裂受精后72h受精后5-7天精子+卵子

合子卵裂球桑椹胚囊胚滋养层胎盘及胎儿附属结构囊胚内胚层消化道、呼吸道上皮和腺体；肝；胆；胰内细胞群中胚层结缔组织；血液；肌肉；骨骼；泌尿生殖系统外胚层体表结构；神经系统人体发生过程：60CELLENGINEERING细胞工程CELL细胞工程61第一章绪论4个学时

第二章实验室配置及基本技术2个学时

第三章植物细胞工程的理论基础4个学时

第四章植物组织器官培养技术6个学时

第五章植物细胞培养及次生代谢产物生产3个学时

第六章原生质体培养和体细胞杂交3个学时

第七章人工种子及植物种质资源保存2个学时

第八章胚胎干细胞培养2个学时第九章动物细胞培养4个学时

第十章动物细胞融合与单克隆抗体4个学时

第十一章动物组织与胚胎工程1个学时

第十二章试管动物与克隆动物1个学时

课程初步安排：36学时

第一章绪论62第七章胚胎干细胞培养干细胞是什么ES/EG细胞的培养及建系技术ES/EG细胞的体外诱导分化诱导分化细胞的永生化ES/EG细胞技术学在医学中的应用ES/EG细胞技术学面临的问题和研究趋势第七章胚胎干细胞培养干细胞是什么63一、干细胞（stemcells）是什么•具有无限的或延长的自我更新能力的细胞•能产生至少一种类型的高度分化的细胞一、干细胞（stemcells）是什么•具有无限的或延64

从具有的分化潜能上讲：--专能干细胞--多能干细胞--全能干细胞从具有的分化潜能上讲：65从组织发生即来源上讲：

--胚胎性干细胞--成体干细胞/组织干细胞从组织发生即来源上讲：66胚胎性干细胞是一类来自早期胚胎、原始生殖细胞等源于胚胎的干细胞，基本特征是有稳定地在体外自我更新、稳定地维持正常核型和发育全能或多能性、能够分化为属于三胚层范畴的各种类型分化细胞，甚至参与个体发育。--来自早期胚胎：胚胎干细胞（embryonicstemcells,ES）--来自胚胎生殖嵴中的原始生殖细胞：胚胎生殖细胞（embryonicgermcells,EG）--来自畸胎瘤组织：胚胎性癌细胞（embryonalcarcinomacells,EC）胚胎性干细胞是一类来自早期胚胎、原始生殖细胞等源于胚胎的干细67－－1981年，Evens和Martin分别成功的分离和体外培养了小鼠的胚胎干细胞；－－1995年，Thomson等人分离建立了第一株灵长类动物的胚胎干细胞；－－1998年，Thomson等建立了第一株人类胚胎干细胞；－－1998年，Shamblott等建立了第一株人类生殖干细胞；－－2002年3月，美国麻省理工学院科学家宣布，他们首次利用人体胚胎干细胞培育出毛细血管，证明了胚胎干细胞技术在治疗心血管疾病等领域的应用潜力；－－目前已有报导，ES细胞在离体适当条件下分化为心肌细胞，胰岛细胞及血管内皮细胞，肝细胞等。－－1981年，Evens和Martin分别成功的分离和体外68成体干细胞（adultstemcells,AS），也叫作组织干细胞（tissuestemcells）是指一群分布在成体组织中处于尚未分化的、具有自我更新并负有构建和补充某种组织的各种类型细胞潜能的干细胞。如骨髓的造血干细胞、间充质干细胞；神经系统的神经干细胞；肝干细胞；骨骼肌干细胞等。--造血干细胞可分化为血液系统的各种细胞；小肠和皮肤中的干细胞具有分化、补充和更新小肠和皮肤组织的能力。--骨髓干细胞除了形成各种血细胞和衍生于间质细胞的各类细胞外，还可被诱导分化为神经细胞、肌肉细胞、骨和肝细胞等不同分化细胞。成体干细胞（adultstemcells,AS），也叫69细胞工程7胚胎干细胞培养课件70二、ES/EG细胞的培养建系技术

分离囊胚的内细胞群与成纤维细胞共培养，ES细胞非分化增殖分离胚胎生殖腺细胞胚胎干细胞的鉴定定向诱导分化功能细胞二、ES/EG细胞的培养建系技术71细胞工程7胚胎干细胞培养课件721、ES/EG细胞的来源(1)发育良好的囊胚，从中分离ICM，进一步分离培养ES细胞(2)从胚胎生殖腺中分离出EG细胞从畸胎瘤中分离出EC细胞治疗性克隆即体细胞核转移（SCNT）途径分离培养ES细胞

1、ES/EG细胞的来源(1)发育良好的囊胚，从中分离ICM73细胞工程7胚胎干细胞培养课件74细胞工程7胚胎干细胞培养课件752、ES/EG细胞的分化抑制培养目前常用的细胞分化抑制物主要有三种:--饲养层细胞(feederlayer)--特殊细胞的条件培养液(conditionedmedium),如BRL(Buffaloratliver)细胞条件培养液--分化抑制因子(differentiationinhibitoryfactor,DIF),如白血病抑制因子(leukemiainhitoryfactor,LIF)2、ES/EG细胞的分化抑制培养目前常用的细胞分化抑制物主76饲养层细胞培养法：常用的饲养层细胞有下列两种：（1）MEF细胞(mouseembryonicfibroblast)，取自各种品系小鼠的12dpc胚胎。经剪碎和胰蛋白酶消化，常规分散细胞培养为单层散布的成纤维细胞。（2）STO细胞，来自SIM小鼠(S)胚胎的对硫代鸟嘌呤(T)和乌本苷(O)有抗性的成纤维细胞系，能分泌干细胞生长因子(stemcellfactor,SCF)以及白血病抑制因子(leukemiainhibitoryfactor,LIF)。饲养层细胞培养法：常用的饲养层细胞有下列两种：77无饲养层培养法：饲养层细胞的制备在一定程度上使ES/EG细胞培养显得较繁杂。近来以添加LIF生长因子或某些特定细胞的条件培养液至含FCS的正常培养液，借此替代饲养层细胞：（1）直接在ES细胞基础培养液中加入重组LIF（2）Buffalo大鼠肝细胞条件培养液(BRL-CM)（3）2～3周幼年大鼠心肌细胞条件培养液(RH-CM)无饲养层培养法：饲养层细胞的制备在一定程度上使ES/EG细胞783、ES/EG细胞系的特性和鉴定（1）形态学特征（2）发育全能性和分化潜能鉴定（3）嵌合体动物3、ES/EG细胞系的特性和鉴定（1）形态学特征（2）发育全79（1）形态学特征

体外培养小鼠ES/EG细胞在抑制分化培养中呈现一个或几个核仁、且核质比高的圆形或卵圆形细胞，彼此均呈单层或多层紧密堆积而形成岛状或巢状群体生长形态，组成克隆的细胞彼此界限不清楚，粘连性强。

人ES与EG细胞的形态学特征有所不同，与小鼠ES/EG也有所不同。单层培养时，人体ES细胞呈扁平状群落，且细胞界限清楚。（1）形态学特征体外培养小鼠ES/EG细胞在抑制分化培养中80（2）发育全能性和分化潜能鉴定

小鼠和包括人在内的灵长类动物全能或多能性胚胎性干细胞，具有特有的表达标志以及在体内外的分化特点。（2）发育全能性和分化潜能鉴定小鼠和包括人在81干细胞标记鼠类EC鼠类ES鼠类EG人类EC人类ES人类EGSSEA-1+++--+SSEA-3---+++SSEA-4---+++TRA-1-60---+++TRA-1-80---+++AKP++++++Oct-4++++？+小鼠与人类多能干细胞标记蛋白表达谱干细胞标记鼠类EC鼠类ES鼠类EG人类EC人类ES人类EGS82SSEAs(stage-specificembryonicantigen):时期专一性胚胎抗原TRA-1-60、TRA-1-81:肿瘤排斥抗原AKP：碱性磷酸酶在小鼠及灵长类的ES细胞中活性较高，在已分化细胞中活性明显降低；

Oct-4:是生殖系专一性转录因子。作为和胚胎发育全能/多能性相关的转录因子，Oct-4通过多种调控机制激活或抑制不同靶基因的转录，在细胞的全能/多能性及未分化状态的调控和维持中发挥重要作用。端粒酶(telomerase):一类核糖核蛋白，与维持真核细胞染色体末端的端粒长度和控制细胞寿命有关。人ES细胞的端粒酶活性高，而分化细胞一般难以检测到；胚胎干细胞的特异性表达标志：SSEAs(stage-specificembryoni83ES/EG细胞在体外被刺激分化为各种类型细胞是其最基本的属性;ES/EG细胞接种于同一品系的小鼠或免疫缺陷小鼠腹股沟、眼窝、腹腔等可以形成由内胚层、中胚层和外胚层细胞构成的畸胎瘤。胚胎干细胞的体内、外分化特点：ES/EG细胞在体外被刺激分化为各种类型细胞是其最基本的胚84

组织和器官的细胞由含有两个或两个以上基因型构建而成的完整个体称为嵌合体动物（chimaera）。把ES/EG细胞注入胚泡或与桑椹胚聚集，使其与正常胚胎结合在一起，并参与宿主胚胎发育，可形成嵌合体动物的各种组织和器官，包含生殖系嵌合体动物可通过毛色、皮肤颜色等外观指标进行判定或是取器官组织进行同功酶检测(3)嵌合体动物组织和器官的细胞由含有两个或两个以上基因型构建而成的完整85三、ES/EG细胞的体外诱导分化三、ES/EG细胞的体外诱导分化861、基本原理细胞诱导分化是一个细胞与其微环境相互间复杂而又精密协调的分子细胞学过程，是胚胎正常发育过程中重要而基本的现象；

ES细胞是体外研究诱导分化的较理想模型，在体外被诱导分化的途径可能与在体胚胎细胞的不完全相同；在体胚胎的细胞分化过程中，诱导作用的结果不只是决定于各种诱导物质的性质和专一性，同时也决定于被诱导细胞的反应能力(competence)。后者受遗传、发育潜能等内在因素的限制；1、基本原理细胞诱导分化是一个细胞与其微环境相互间复杂而又87

ES细胞体外诱导分化实验中，所用诱导物质繁多，诱导模式不尽相同，按其作用机理大致分为两类：--使被诱导细胞可逆性轻度损伤，导致神经细胞分化无机物、有机酸、醇、亚甲基盐、硫氢化物等--诱导物通过其与被诱导细胞表面的受体结合而诱导细胞分化类固醇激素、维甲酸衍生物、多肽生长因子等

同一种诱导物可以诱导出不同类型细胞或变化多端的构造，不仅涉及诱导剂的浓度差别、诱导作用模式和微环境的未知因素等，而且可能与被诱导细胞本身的发育潜能和对诱导剂的反应性等差别有关。ES细胞体外诱导分化实验中，所用诱导物质繁多，诱导模式同88

ES细胞体外诱导分化途径可分为：--谱系分化（lineagedifferentiation），有利于认识组织谱系细胞分化机理和全过程。ES细胞谱系祖细胞谱系定型细胞终末分化细胞--定向分化（committeddiffereniation），需设法控制导向产生单一类型的分化细胞。对ES细胞转染细胞专一的转录因子、标志基因、细胞分化因子结合报告基因和诱导条件选择等手段，探索定向诱导分化途径ES细胞体外诱导分化途径可分为：89细胞工程7胚胎干细胞培养课件90细胞工程7胚胎干细胞培养课件912、ES细胞体外诱导分化的基本方法单层ES细胞培养和诱导分化：较难分化为单一类型的细胞ES细胞拟胚体形成和诱导分化：相对诱导分化细胞类型较单一,具体方法有：（1）软琼脂培养（2）悬滴培养

2、ES细胞体外诱导分化的基本方法单层ES细胞培养和诱导分化92制备ES单细胞悬浮液培养皿盖上接种20ul/滴，直径10cm的培养皿盖盖上带有悬浮细胞小滴的盖子培养皿内加PBS培养皿边缘用膜封置37℃，5％CO2培养箱培养3d后，转移拟胚体至含细胞分化诱导剂的培养皿或微孔板进一步培养然后,移放入铺有0.1%白明胶的培养皿或微孔板内在培养液中再培养可被诱导分化为不同类型细胞ES细胞体外悬滴培养制备ES单细胞悬浮液培养皿盖上接种20ul/滴，直径10cm933、ES细胞体外诱导分化举例造血细胞内皮细胞与血管神经细胞脂肪细胞心肌和其他肌肉细胞软骨细胞胰岛细胞3、ES细胞体外诱导分化举例造血细胞94小鼠ES细胞拟胚体在体外可以分化为类似于早期胚胎卵黄囊血岛样的结构并分化产生各种造血系统的细胞：①用胰蛋白酶消化小鼠ES细胞拟胚体成单个细胞，经干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)和条件培养液处理，诱导其定向分化为造血干细胞；②用原代骨髓基质细胞作饲养层和SCF及IL-6细胞因子处理可进一步使ES细胞来源的造血干细胞分化为B淋巴细胞系。造血细胞小鼠ES细胞拟胚体在体外可以分化为类似于早期胚胎卵黄囊血岛样95内皮细胞与血管小鼠ES细胞拟胚体在体外可以分化为类似于早期胚胎卵黄囊血岛样的结构，其中也有内皮细胞出现：①利用经转化生长因子β1(TGF-β1)基因转染的小鼠ES细胞在含RA培养液中经悬滴培养形成拟胚体；②再继续贴壁培养，发现拟胚体周围呈辐射状长出许多血管样结构。将外源重组TGF-β1添加至培养液，同样也能诱导内皮细胞组成的血管样结构。内皮细胞与血管小鼠ES细胞拟胚体在体外可以分化为类似于早期胚96心肌和其它肌肉细胞

悬浮或悬滴培养的小鼠ES细胞拟胚体在RA诱导条件下贴壁生长数天，常出现某些分化细胞集落具有节律性自发收缩的现象，显然是肌细胞：DMSO诱导ES细胞拟胚体可以形成心肌、平滑肌和骨骼肌等多种类型肌细胞，用肌肉专一性的调节因子MyoD基因转染ES细胞并结合DMSO诱导处理，额外表达MyoD基因的ES细胞主要分化为骨骼肌且常融合成肌管。心肌和其它肌肉细胞悬浮或悬滴培养的小鼠ES细胞拟胚体在RA97ES细胞定向诱导分化是至今仍未解决、正在探索中的问题。根据国外少数报道和国内的经验，对ES细胞转染细胞专一的转录因子、标志基因或是有关细胞分化因子等遗传操作，并结合诱导条件选择等手段，是一条可能的探索ES细胞定向诱导分化的途径。ES细胞定向诱导分化是至今仍未解决、正在探索中的问题。根据国98四、ES/EG细胞诱导分化细胞的永生化

寻找建立ES/EG细胞诱导产生的分化细胞永生化途径是目前ES/EG细胞研究领域待解决的问题。四、ES/EG细胞诱导分化细胞的永生化寻99五、ES/EG培养与诱导分化的意义哺乳类发育的体外模型人体的基因和细胞治疗组织工程的种子细胞来源五、ES/EG培养与诱导分化的意义哺乳类发育的体外模型人体100细胞工程7胚胎干细胞培养课件101哺乳动物早期胚胎一般体积很小，又在宫内发育，在体内研究胚胎发育和各类细胞分化及其机理几乎不可能；ES细胞具有完整的发育潜能性，而且对所有调节正常发育的信号具有应答能力。虽然ES细胞体外分化途径和机制与在体胚胎不完全相同，但在分子水平有共同或相似之处，是研究特定类型细胞分化、某些前体细胞起源和细胞谱系演变较理想的实验体系；许多国家在法律上禁止以克隆或复制人为目的的前提下，已允许将人ES细胞类似于小鼠ES细胞体外实验一样，用于研究人类胚胎发育、分化和调节信号等事件。哺乳类发育的体外模型哺乳动物早期胚胎一般体积很小，又在宫内发育，在体内研究胚胎发102人体的基因和细胞治疗

这里的基因治疗是指用遗传改造过的人体细胞直接移植或输入病人体内，达到控制和治愈疾病为目的的治疗手段，又称细胞治疗。人体的基因和细胞治疗这里的基因治疗是指用遗传103目前常说的基因治疗技术虽然能把编码正常序列的基因导入突变细胞而使突变基因的功能得到纠正，但导入基因的整合和表达难以精确控制，特别是基因插入后对其他基因产生的效应尚无法预知。更大问题是，许多被用作基因操作的细胞在体外不易稳定地被转染和增殖传代；ES细胞是基因治疗的较理想的靶细胞，经遗传操作后一般仍能稳定地在体外增殖传代，克服了目前基因治疗中需要大量靶细胞来源的主要问题。目前常说的基因治疗技术虽然能把编码正常序列的基因导入104定向诱导分化，选择治疗因子基因表达

人ES细胞基因操作（克服免疫学障碍）

多种MHC组合的ES细胞库

组织谱系干细胞（如造血干细胞）

功能性分化细胞（如神经细胞）移植移植

不同类型疾病的宿主

基因组被改造的ES细胞异源性基因表达基因修饰

基因敲除、敲入定向诱导分化选择

组织谱系干细胞或功能性分化细胞移植图2-2-1用于基因和细胞治疗的人ES细胞工程示意图基本策略1定向诱导分化，选择治疗因子基因表达人ES细胞基因操作105基本策略2欲接受细胞治疗患者的体细胞核导入去核卵细胞体外发育胚泡期专用ES细胞特化细胞分离培养体外诱导分化回输基本策略2欲接受细胞治疗患者的导入去核卵细胞体外发育106细胞治疗的临床应用前景神经系统疾病骨和软骨疾病血液病肝病细胞治疗的临床应用前景神经系统疾病107神经系统疾病

根据小鼠ES/EG细胞研究资料，由于各种类型神经细胞因某种原因死亡而成熟神经细胞又不能分裂、补充和替代死亡细胞引起的神经系统疾病如Parkinson’s疾病，Alzheimer’s病、多发性硬化症等，有望通过人ES/EG细胞进行细胞治疗。新近，产生多巴胺的神经细胞已能从小鼠ES细胞衍生而来，为细胞治疗Parkinson’s病的ES细胞来源问题提供实验依据。神经系统疾病根据小鼠ES/EG细胞研究资料，由于各种类型神108骨和软骨疾病ES/EG细胞可能在体外被诱导为骨和软骨，这些细胞被导入骨关节炎患者的关节软骨损伤区域，或因骨折、手术而引起的较大骨隙中，这类从ES细胞衍生的骨和软骨细胞在被移植部位自我修复的优点远远超过现行的组织移植。骨和软骨疾病ES/EG细胞可能在体外被诱导为骨和软骨，这些细109血液病ES和造血干细胞研究有助于产生供细胞移植用的、不含有镰刀状血球突变的血细胞。血液病ES和造血干细胞研究有助于产生供细胞移植用的、不含有110肝病利用肝干细胞移植治疗肝病取得了重要进展。肝病利用肝干细胞移植治疗肝病取得了重要进展。111

组织工程的种子细胞来源人体ES细胞技术学的发生和发展，有望解决目前组织或器官修复中的难题。组织工程的种子细胞来源人体ES细胞技术学的发生和发112

设想是选择与人体细胞兼容性较好的生物材料，按缺损组织或器官的要求设计制成模型或支架放在体外培养系统中，使