昆医分生蛋白质分子建模与设计课件

昆医分生蛋白质分子建模与设计昆医分生蛋白质分子建模与设计1（优选）昆医分生蛋白质分子建模与设计（优选）昆医分生蛋白质分子建模与设计2ProteinFoldingoccursinthecytosolinvolveslocalizedspatialinteractionamongprimarystructureelements,i.e.theaminoacidsmayormaynotinvolvechaperoneproteinsProteinFoldingoccursinthec3在人体的进化过程中蛋白质执行了在人体及体外的许多重要任务：利用蛋白质结构-功能或结构-稳定性相关知识及理论计算预测新蛋白质可能具有的性质；解决方法：（1）使相互作用的强度所有内部的氢键都是最大满足的（主链和侧链）。12345678单链抗体（scFv）：GGGGSGGGGSGGGGSGGG第一节蛋白质分子设计原理（一）蛋白质分子设计的层次全新设计中必然能够大大地缩短设计或者在结合腔内对一个已知的结构骨架进行化合物的衍生化。ProteinFolding3-12aa一是为有目的的蛋白质工程改造提供设计方案和指导性信息，如以此提高蛋白质的热、酸稳定性，增加活性，降低副作用，提高专一性等；UnrelatedproteinsassumesimilarstructurestofulfillcommonfunctionsProteinstructureoftenprovidescluesaboutproteinfunction在人体的进化过程中蛋白质执行了在人体及体外的许多重要任务：U引言在人体的进化过程中蛋白质执行了在人体及体外的许多重要任务：酶是催化化学反应的蛋白质或者核酸分子；抗体起到防护的作用;……从生态角度，蛋白质也是非常理想的物质:生物合成不需要消耗很多能量专一性很强不产生副作用并且能很快降解引言在人体的进化过程中蛋白质执行了在人体及体外的许多重要任务5蛋白质没有像化学试剂那样被普遍应用，其原因:(1)蛋白质分子量非常大(10000-1000000)，不能通过化学方法生产;(2)蛋白质的功能是在生理条件下挥发的，在其它条件下(如在有机溶剂中)是不稳定的;(3)专一性致使其应用范围受到影响。

蛋白质应用受限的原因蛋白质没有像化学试剂那样被普遍应用，其原因:蛋白质应用受限的6蛋白质设计目前存在的问题1、与天然的蛋白质比较，缺乏结构的独特性及明显的功能优越性2、三级结构的确定性较差蛋白质设计目前存在的问题7计算机模拟突变蛋白质产品功能分析基因构建Pr设计循环第一节蛋白质分子设计原理计算机模拟突变蛋白质产品功能分析基因构建Pr设计循环第一节8蛋白质分子设计的流程天然蛋白质蛋白质结构预测蛋白质晶体学蛋白质三维结构结构与功能的关系蛋白质突变体设计及结构预测几何优化及蛋白质动力学研究结果分析与原先的结构比较蛋白质合成定位突变分离、纯化及表征新蛋白质数据的输入蛋白质分子设计的流程天然蛋白质蛋白质结构预测蛋白质晶体学蛋白9Pr突变体设计的3个步骤利用计算机模拟技术确定突变位点及替换的aa利用能量优化及动力学方法预测修饰后的蛋白质结构预测的结构与原始的Pr结构比较，利用Pr结构-功能或结构稳定相关知识及理论计算机预测新Pr可能具有的性质Pr突变体设计的3个步骤利用计算机模拟技术确定突变位点及替换10在上述的设计工作完成后，要进行合成或突变实验并经分离、纯化及表征后得到所要求的新Pr；Pr设计的成功与否，必须要有理论与实验的紧密相结合

昆医分生蛋白质分子建模与设计课件11在上述的设计工作完成后，要进行合成或突变实验并经分离、纯化及表征后得到所要求的新Pr；Pr设计的成功与否，必须要有理论与实验的紧密相结合

昆医分生蛋白质分子建模与设计课件12

蛋白质分子设计原理内核假设。蛋白质的独特的折叠形式是由蛋白质内核中残基的相互作用决定。（内部十分保守的区域）Pr内部都是密堆积（很少有空穴大到水分子可以结合一个水分子或惰性气体），没有重叠蛋白质分子设计原理内核假设。蛋白质的独特的折叠形式是由蛋白13所有内部的氢键都是最大满足的（主链和侧链）。蛋白质的氢键形成涉及一个交换反应，溶剂键被蛋白质键所取代疏水及亲水基团需要合理的分布在溶剂可及表面及不可及表面。分布代表疏水效应的主要驱动力

蛋白质分子设计原理所有内部的氢键都是最大满足的（主链和侧链）。蛋白质的氢键形成14金属Pr中配位残基的替换要满足金属配位几何。要求围绕金属中心放置合适数目的蛋白质侧链或溶剂分子，并符合正确的键长、键角以及整体的几何。对于金属Pr，围绕金属中心的第二壳层中的相互作用是重要的。氢键的第二壳层通常涉及与蛋白质主链的相互作用。

蛋白质分子设计原理金属Pr中配位残基的替换要满足金属配位几何。要求围绕金属中心15最优的aa侧链几何排列。Pr侧链构象由空间两个立体因素所决定(一是立体势垒，二是aa的位置)结构及功能的专一性。这是Pr设计最困难的问题

蛋白质分子设计原理蛋白质分子设计原理16一、蛋白质分子设计的分类设计的目的主要有两个：

一是为有目的的蛋白质工程改造提供设计方案和指导性信息，如以此提高蛋白质的热、酸稳定性，增加活性，降低副作用，提高专一性等；

一、蛋白质分子设计的分类设计的目的主要有两个：17二是探索蛋白质的折叠机理，如简单蛋白质骨架的从头设计是研究蛋白质内相互作用力的类型及本质的很好途径，也为解决蛋白质折叠问题寻找定性和定量的规律。

二是探索蛋白质的折叠机理，如简单蛋白质骨架的从头设计是研究蛋18二是探索蛋白质的折叠机理，如简单蛋白质骨架的从头设计是研究蛋白质内相互作用力的类型及本质的很好途径，也为解决蛋白质折叠问题寻找定性和定量的规律。基本障碍：线性聚合构象熵；本实验将能够各自产生抗DON毒素和抗ZEN毒素的单链抗体基因，连接融合，表达出能同时与DON和ZEN两种毒素抗原特异性结合的双特异性单链抗体。（一）全新蛋白质设计程序序列；设计全β结构时，应选择Val、Ile等易于形成β折叠片的残基；VH也可以将之做新一轮计算的起点进行进一步的优化。(2)蛋白质的功能是在生理条件下挥发的，在其它条件下(如在有机溶剂中)是不稳定的;或者在结合腔内对一个已知的结构骨架进行化合物的衍生化。例如，有一种和癌症的发病有关的癌胚抗原CEA（Carcinoembryonicantigen），是由七个大小和形状都非常相似的结构域拼接构成的，各结构域之间由柔韧性较大的“铰链”片段相连。5mM)3µL同时利用能量优化及蛋白质动力学方法预测修饰后的蛋白质结构，以修正所选择的氨基酸位点和突变后的氨基酸种类。一、蛋白质分子设计的分类抗DON单链抗体改体研究（一）蛋白质分子设计的层次分为两个层次：一是在蛋白质三维结构已知基础上的分子设计；二是在三维结构未知的情况下，借助一级结构序列信息及生物化学性质进行分子设计工作。二是探索蛋白质的折叠机理，如简单蛋白质骨架的从头设计是研究蛋19（二）蛋白质分子设计的分类1．定点突变或化学修饰法2．拼接组装设计法3．从头设计全新蛋白质（二）蛋白质分子设计的分类1．定点突变或化学修饰法20玉米赤霉烯酮(ZEN)(3)专一性致使其应用范围受到影响。PCR扩增Anti-DON基因疏水及亲水基团需要合理的分布在溶剂可及表面及不可及表面。（二）蛋白质分子设计的分类制备感受态细胞VL第二节基于天然蛋白质结构的分子设计（内部十分保守的区域）ProteinFoldingDON:小麦镰刀菌毒素2．找出对所要求的性质有重要影响的位置以重组质粒为模板，进行Anti-DON基因的PCR分析。GGGGSGGG第一节蛋白质分子设计原理二、蛋白质分子设计的原则1．活性设计2．对专一性的设计3．Scaffold设计(框架)4．疏水基团与亲水基团需合理分布5．最优的氨基酸侧链几何排列玉米赤霉烯酮(ZEN)二、蛋白质分子设计的原则1．活性设计21溶菌酶结构例如:鸡卵清蛋白溶菌酶活性分子的设计过程中，其中EFAEEAASF多肽能水解几丁质和葡聚糖，但糖苷酶活性较低。

Cutte成功设计了一个具有明显的核酸酶活性的34肽，该肽可水解下列底物，但活性依次降低：polyC、polyA、polyU、polyG。其主要活性源于二聚体；而天然核酸酶仅消化polyC、polyU、polyA，特别倾向于水解polyC的3’端。溶菌酶结构例如:鸡卵清蛋白溶菌酶活性分子的设计过程中，其中E22设计步骤蛋白质分子设计步骤图修正设计获得目标蛋白质序列合成检测结构信息分析建立结构模型设计目标蛋白质数据库设计步骤蛋白质分子设计步骤图修正设计获得目标蛋白质序列合成检23序列设计设计α螺旋时，应选择象Leu、Glu等易于形成α螺旋的残基；设计全β结构时，应选择Val、Ile等易于形成β折叠片的残基；而在设计转角时常选择Pro-Asn残基对。序列设计设计α螺旋时，应选择象Leu、Glu等易于形成α螺旋24第二节基于天然蛋白质结构的分子设计基于天然蛋白质结构的分子设计有两类：一是进行蛋白质修饰或基因定位突变，即“小改”；二是进行蛋白质分子裁剪拼接，即“中改”。

第二节基于天然蛋白质结构的分子设计基于天然蛋白质结构的分子25一、定位突变

基于天然蛋白质结构的蛋白质分子“小改”是指对已知结构的蛋白质进行少数几个残基的修饰、替换或删除等，这是目前蛋白质工程中最广泛使用的方法，主要可分为蛋白质修饰和基因定位突变两类。一、定位突变26（一）定位突变的设计目标及解决方法

定位突变常见的设计目标是提高蛋白质的热、酸稳定性、增加活性、降低副作用、提高专一性，以及通过蛋白质工程手段进行结构-功能关系的研究等。（一）定位突变的设计目标及解决方法定位突变常见的27Hartley等于1986年完成了一个我们所要的设计目标及解决的办法：热稳定性对氧化的稳定性对重金属的稳定性pH稳定性提高酶学性质引入二硫桥，增加内氢键数目，改善内疏水堆积把Cys转换为Ala或Ser，把Trp转换为Phe或Tyr替代表面羧基，把Met转换为Gln、Val、Ile或Leu替换表面荷电基团，His、Cys以及Tyr的置换专一性的改变，增加逆转数，改变酸碱度Hartley等于1986年完成了一个我们所要的设计目标及解28（二）定位突变的种类

要进行基因定位突变，改变DNA核苷酸序列，方法有很多种，如基因的化学合成、基因直接修饰法、盒式突变技术等。根据基因突变的方式，分为以下三类：插入一个或多个氨基酸残基；删除一个或多个氨基酸残基；替换或取代一个或多个氨基酸残基。要达到基因定位突变的目的，多采用体外重组DNA技术或PCR方法。（二）定位突变的种类要进行基因定位突29（三）定位突变的程序1．建立所研究蛋白质的结构模型

可以通过X射线晶体学、二维核磁共振等测定结构，也可以根据类似物的结构或其他结构预测方法建立起结构模型。（三）定位突变的程序1．建立所研究蛋白质的结构模型302．找出对所要求的性质有重要影响的位置在改造中如何恰当地选择突变残基是一个关键问题，这不仅需要分析残基的性质，同时还需要借助于已有的三维结构或分子模型。2．找出对所要求的性质有重要影响的位置在改造中如何恰当地选择313．预测突变体的结构

根据所选定的氨基酸残基位点及突变后的氨基酸种类，利用相关软件进行突变体的结构预测，将预测的结构与原始的蛋白质结构比较；利用蛋白质结构-功能或结构-稳定性相关知识及理论计算预测新蛋白质可能具有的性质；同时利用能量优化及蛋白质动力学方法预测修饰后的蛋白质结构，以修正所选择的氨基酸位点和突变后的氨基酸种类。3．预测突变体的结构根据所选定的氨基324．构建突变体，获得突变体蛋白

依据所设计好的突变，利用化学合成或PCR等方法构建突变体。进行基因测序验证突变体后，将突变体进行表达，纯化蛋白质，获得所设计的新蛋白质。4．构建突变体，获得突变体蛋白335．突变体蛋白质的检验测定新蛋白质的序列、三维结构、稳定性、催化活性等，并与对应的天然蛋白质进行比较，检验突变设计的效果，同时进一步修正设计方案。5．突变体蛋白质的检验测定新蛋白质的序列、三维结构、稳定性、34蛋白质中功能残基的鉴定根据结构信息确定残基的突变突变方法鉴定突变功能残基利用蛋白质同源性鉴定功能残基（四）蛋白质中功能残基的鉴定蛋白质中功能根据结构信息利用蛋白质同源性（四）蛋白质中功能残351．根据结构信息确定残基的突变最有效最直接的方法AlanFersht和GregWinter等测定了酪氨酰-tRNA合成酶突变体的三维结构，通过分析该酶的Cys35被结构相似的丝氨酸所取代后的结构，发现Cys35可能与酪氨酰腺苷酸中间体中的3’羟基形成氢键，突变效应降低了酶的活性，证实了Cys35在结合腺苷酸部分的作用。1．根据结构信息确定残基的突变最有效最直接的方法362．突变方法鉴定突变功能残基通过引进另外一种突变来检测随机突变技术删除分析及连接片段扫描突变2．突变方法鉴定突变功能残基通过引进另外一种突变来检测373．利用蛋白质同源性鉴定突变功能残基高度保守的残基与同源蛋白的共同功能以及维持结构有关。非保守残基是分析的靶位点，特别是对于专一性研究。探测突变蛋白质的结构整体性质，以鉴定突变残基。3．利用蛋白质同源性鉴定突变功能残基高度保守的残基与同源蛋白38（五）定位突变的应用RNaseT1的结构改造是分于设计中的一个成功实例T1核糖核酸酶含有104个氨基酸残基，这个天然酶有两对二硫键（Cys2-Cys10，Cys6-Cys100，日本大阪大学的Niskikawa等人在Tyr24和Asn84位引入第三个二硫键，热稳定性增加。（五）定位突变的应用RNaseT1的结构改造是分于设计中的39二、蛋白质分子拼接例如，有一种和癌症的发病有关的癌胚抗原CEA（Carcinoembryonicantigen），是由七个大小和形状都非常相似的结构域拼接构成的，各结构域之间由柔韧性较大的“铰链”片段相连。研究发现，癌胚抗原的这种多结构域特征有利于它的细胞识别和粘合作用。二、蛋白质分子拼接40英国剑桥大学的Winter等人利用分子剪裁技术成功地在抗体分子上作了实验(人源化抗体)英国剑桥大学的Winter等人利用分子剪裁技术成功地在抗体分41单链抗体scFv结构（抗体工程)抗DON单链抗体改体研究DON:小麦镰刀菌毒素单链抗体scFv结构（抗体工程)抗DON单链抗体改体研究DO42

单链抗体的linker改造GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGGGSGGGGGGGSGGG

VHVHVHVHVHVHVLVLVLVLVLVL单链抗体的linker改造43

单链抗体的改体模型VHVHVHVHVHVHLinker﹥12aaVＬVＬVＬVＬVＬVＬLinkerLinker3-12aa<3aaVＬVＬVＬVＬVHVHVHVH单链抗体的改体模型VHVHVHVHVHVHLinker﹥44

Linker

XhoⅠSalISalⅠSalⅠXhoⅠ双酶切EcoRIXhoⅠ双酶切EcoRISalI双酶切differentlength连接ＶＨＶＬ

技术路线EcoRILinkerXhoⅠSalⅠEcoRIEcoRIdi45转化筛选、检测

蛋白质的诱导生成

表达载体构建

感受态细胞的制备纯化亲和力初步测定转化筛选、检测蛋白质的诱导生成表达载体构建感受态细46PCR扩增重链、轻链策略LinkerVHVLP3P4P5P6P7P8P1P2PCR扩增重链、轻链策略47PCR反应体系及反应条件50L反应体系如下：10×TaqPCRBuffer5µLdNTP(2.5mM)3µLForwardPrimer(20mM)1µLReversePrimer(20mM)1µLTemple1µLrTaq0.3µL

AddddH2Otoafinalvolumeof50µLPCR循环条件为：94℃5min，1个循环；94℃45s，58℃30s，72℃45s，31个循环；72℃40s，25个循环；72℃7min，1个循环。取PCR产物5µL，1.0％的琼脂糖电泳检测。PCR反应体系及反应条件50L反应体系如下：

48VH

和VL的PCR扩增结果

１２３４５９６７８7500150001000025001002505007501000200010002505000VH和VL的PCR扩增结果１２３４５９６７８7500149

菌落PCR重组子验证123456712345671234567200010007505002501002000200010001000750750500500250250100菌落PCR重组子验证150

改体抗体在大肠杆菌BL21中的表达及其纯化

1234567897.4KD66.2KD42.7KD31KD改体抗体在大肠杆菌BL21中的表达及其纯化151

改体抗体的ELISA初步测定312456789101112改体抗体的ELISA初步测定3124567891011152单链抗体抗体：是体液免疫应答的主要效应分子。由两条相同的重链（H链）和两条相同的轻链（L链）组成。双特异性单链抗体的构建与表达单链抗体双特异性单链抗体的构建与表达53单链抗体（scFv）：抗体可变区的重链（VH）与轻链（VL）通过一段约15-25个氨基酸残基构成的弹性短肽（Linker）相连，融合表达出来的抗体片断。

单链抗体（scFv）：54双特异性单链抗体能识别两种抗原并能与之结合的单链抗体（或抗体复合物）称为双特异性单链抗体。本实验将能够各自产生抗DON毒素和抗ZEN毒素的单链抗体基因，连接融合，表达出能同时与DON和ZEN两种毒素抗原特异性结合的双特异性单链抗体。玉米赤霉烯酮(ZEN)双特异性单链抗体玉米赤霉烯酮(ZEN)55技术路线

DON和ZEN抗体基因的提取目的基因片段引物的设计

PCR扩增目的片段

制备感受态细胞

酶切目的片段、载体，linker连接

转化连接产物

酶切验证重组子

表达、纯化蛋白技术路线DON和ZEN抗体基因的提取目的基因56载体的构建Anti-ZENgeneAnti-DONgeneXhoΙEcoRΙSalΙNcoΙ连接

Linker载体的构建Anti-ZENgeneAnti-DONgen57PCR扩增Anti-DON基因

12M20001000(bp)800bp750250100500PCR扩增Anti-DON基因158PCR扩增Anti-ZEN基因

M1220001000750500250100(bp)750bpPCR扩增Anti-ZEN基因M59重组验证重组验证60PCR验证以重组质粒为模板，进行Anti-DON基因的PCR分析。PCR验证以重组质粒为模板，进行Anti-DON基因的PCR61双特异性抗体的表达双特异性抗体的表达62

我们知道,蛋白质的空间结构受其氨基酸序列控制,而功能又与结构密切相关。

如果能够找到构造蛋白质结构的方法,我们就能得到具有任意结构和功能的全新蛋白质,这就是蛋白质全新设计问题。第三节全新蛋白质设计我们知道,蛋白质的空间结构受其氨基酸序列控制,63

蛋白质从头设计概念

从头设计能够根据生物分子的活性位点特征产生一系列的结构片段，通过连接这些结构片段可以构成一个全新分子；或者在结合腔内对一个已知的结构骨架进行化合物的衍生化。

从头设计方法可以生成全新的分子结构。蛋白质从头设计概念从头设计能够根据生物分子的活64全新蛋白质设计包括

一、全新蛋白质设计方法二、蛋白质结构的从头设计全新蛋白质设计包括

65

全新蛋白质设计过程设计目标序列生成结构预测合成构建模型检测设计目标序列生成结构预测合成构建模型检测66（一）全新蛋白质设计程序模拟分析设计实验一、全新蛋白质设计方法（一）全新蛋白质设计程序模拟分析设计实验一、全新蛋白67（二）全新蛋白质设计目标的选择依据设计的目的可以分为：从头结构设计从头功能设计（二）全新蛋白质设计目标的选择依据设计的目的可以分为：68从头结构设计

中心问题：稳定及独特的三维结构序列；基本障碍：线性聚合构象熵；解决方法：（1）使相互作用的强度与数目达到最大；（2）共价交叉连接。从头结构设计

中心问题：稳定及独特的三维结构69从头设计方法包含的步骤1、活性位点分析：对结合位点的具体的化学信息进行扫描、分析和归类。这些信息的三维空间相互关系都必须充分考虑。

2、配体分子构建：采用不同的片段选择和分子构建方法，产生相应的分子结构。

3、评价：使用特定的评分系统将构建的分子与活性位点的匹配性进行排序，可以选择其中优良的结果作为合成实验的对象。也可以将之做新一轮计算的起点进行进一步的优化。从头设计方法包含的步骤1、活性位点分析：对结合位点的具体的化70二、蛋白质结构的从头设计（一）蛋白质结构的从头设计原则1．二级结构的设计原则α螺旋β折叠片转角2．超二级结构和三级结构的设计原则二、蛋白质结构的从头设计（一）蛋白质结构的从头设计原则71α螺旋(PHPPH)(Leu、Glu、Met)C端：aa+N端：aa-α螺旋(PHPPH)C端：aa+72β折叠片

(HPHPH或PHPHP，5-10aa)β折叠片(HPHPH或PHPHP，5-10aa)73转角（Pro、Gly中断α螺旋，Glu中断β折叠）

转角（Pro、Gly中断α螺旋，Glu中断β折叠）74蛋白质的几种超二级结构

αα、ββ、β-α-β、β-α-β-α-β蛋白质的几种超二级结构

αα、ββ、β-α-β、β75从头设计的三股式β折叠

从头设计的20个氨基酸残基的三股式β折叠（KortemmeT,etal.1998）（二）蛋白质结构的从头设计实例结构骨架模板、分级迭代算法从头设计的三股式β折叠从头设计的20个氨基酸残基的三股式β76ββα型异源四聚体的设计历程结构域替换寡聚化策略

异源专一性的计算机重新设计23个氨基酸自动折叠成的锌指结构（ββα5）的核磁共振（NMR）结构(Struthersetal.,1996,1998)；ββα5同源四聚体衍生物ββαT2的X-射线结构（Alietal.,2004)；ββαT2异源四聚体衍生物ββαhetT1的X-射线结构(Alietal.,2005).ββα型异源四聚体的设计历程结构域替换异源专77α/β-筒状蛋白质的全新设计(Offredi1,etal.2003)(A)β-sheetbarrel(红色)(B)四周环绕α-helixbarrel(蓝色)(C)二者由简单结构域αβ1、αβ3和βABα（灰色）连接(D)全新α/β-筒状蛋白质。α/β-筒状蛋白质的全新设计(Offredi1,etal7874aaDegrado设计四螺旋束74aaDegrado设计四螺旋束79单链抗体的linker改造在人体的进化过程中蛋白质执行了在人体及体外的许多重要任务：同时利用能量优化及蛋白质动力学方法预测修饰后的蛋白质结构，以修正所选择的氨基酸位点和突变后的氨基酸种类。利用蛋白质结构-功能或结构-稳定性相关知识及理论计算预测新蛋白质可能具有的性质；定位突变常见的设计目标是提高蛋白质的热、酸稳定性、增加活性、降低副作用、提高专一性，以及通过蛋白质工程手段进行结构-功能关系的研究等。一是进行蛋白质修饰或基因定位突变，即“小改”；替代表面羧基，把Met转换为Gln、Val、Ile或LeuVL3．从头设计全新蛋白质3、评价：使用特定的评分系统将构建的分子与活性位点的匹配性进行排序，可以选择其中优良的结果作为合成实验的对象。如组合化学方法应用到蛋白质所有内部的氢键都是最大满足的（主链和侧链）。例如:鸡卵清蛋白溶菌酶活性分子的设计过程中，其中EFAEEAASF多肽能水解几丁质和葡聚糖，但糖苷酶活性较低。二、蛋白质结构的从头设计研究发现，癌胚抗原的这种多结构域特征有利于它的细胞识别和粘合作用。四螺旋束单链抗体的linker改造四螺旋束80举例Hodges设计（周期性重复七肽）23

coiled-coil疏水性aa举例疏水性aa81coiled-coil

from:coiled-coil

from:82二级模块单元的自组装最简单、最直接的策略—合成单一二级结构单元优点无论是从设计或合成看，是简单的；容易合成。缺点涉及蛋白质的稳定性；结构的简单重复。二级模块单元的自组装最简单、最直接的策略—合成单一二级结构单83蛋白质全新设计的现状和前景

现状

蛋白质全新设计不仅使我们有可能得到自然界不存在的具有全新结构和功能的蛋白质,并且已经成为检验蛋白质折叠理论和研究蛋白质质折叠规律的重要手段。由于我们对蛋白质全新设计的理论基础即蛋白质折叠规律的认识还不够,所以蛋白质全新设计还处在探索阶段。蛋白质全新设计的现状和前景

现状84前景

随着新实验技术的发展,蛋白质全新设计的速度和效率必将得到极大的提高。如组合化学方法应用到蛋白质全新设计中必然能够大大地缩短设计的周期,并将彻底改变蛋白质全新设计的面貌。前景随着新实验技术的发展,蛋白质全85昆医分生蛋白质分子建模与设计昆医分生蛋白质分子建模与设计86（优选）昆医分生蛋白质分子建模与设计（优选）昆医分生蛋白质分子建模与设计87ProteinFoldingoccursinthecytosolinvolveslocalizedspatialinteractionamongprimarystructureelements,i.e.theaminoacidsmayormaynotinvolvechaperoneproteinsProteinFoldingoccursinthec88在人体的进化过程中蛋白质执行了在人体及体外的许多重要任务：利用蛋白质结构-功能或结构-稳定性相关知识及理论计算预测新蛋白质可能具有的性质；解决方法：（1）使相互作用的强度所有内部的氢键都是最大满足的（主链和侧链）。12345678单链抗体（scFv）：GGGGSGGGGSGGGGSGGG第一节蛋白质分子设计原理（一）蛋白质分子设计的层次全新设计中必然能够大大地缩短设计或者在结合腔内对一个已知的结构骨架进行化合物的衍生化。ProteinFolding3-12aa一是为有目的的蛋白质工程改造提供设计方案和指导性信息，如以此提高蛋白质的热、酸稳定性，增加活性，降低副作用，提高专一性等；UnrelatedproteinsassumesimilarstructurestofulfillcommonfunctionsProteinstructureoftenprovidescluesaboutproteinfunction在人体的进化过程中蛋白质执行了在人体及体外的许多重要任务：U引言在人体的进化过程中蛋白质执行了在人体及体外的许多重要任务：酶是催化化学反应的蛋白质或者核酸分子；抗体起到防护的作用;……从生态角度，蛋白质也是非常理想的物质:生物合成不需要消耗很多能量专一性很强不产生副作用并且能很快降解引言在人体的进化过程中蛋白质执行了在人体及体外的许多重要任务90蛋白质没有像化学试剂那样被普遍应用，其原因:(1)蛋白质分子量非常大(10000-1000000)，不能通过化学方法生产;(2)蛋白质的功能是在生理条件下挥发的，在其它条件下(如在有机溶剂中)是不稳定的;(3)专一性致使其应用范围受到影响。

蛋白质应用受限的原因蛋白质没有像化学试剂那样被普遍应用，其原因:蛋白质应用受限的91蛋白质设计目前存在的问题1、与天然的蛋白质比较，缺乏结构的独特性及明显的功能优越性2、三级结构的确定性较差蛋白质设计目前存在的问题92计算机模拟突变蛋白质产品功能分析基因构建Pr设计循环第一节蛋白质分子设计原理计算机模拟突变蛋白质产品功能分析基因构建Pr设计循环第一节93蛋白质分子设计的流程天然蛋白质蛋白质结构预测蛋白质晶体学蛋白质三维结构结构与功能的关系蛋白质突变体设计及结构预测几何优化及蛋白质动力学研究结果分析与原先的结构比较蛋白质合成定位突变分离、纯化及表征新蛋白质数据的输入蛋白质分子设计的流程天然蛋白质蛋白质结构预测蛋白质晶体学蛋白94Pr突变体设计的3个步骤利用计算机模拟技术确定突变位点及替换的aa利用能量优化及动力学方法预测修饰后的蛋白质结构预测的结构与原始的Pr结构比较，利用Pr结构-功能或结构稳定相关知识及理论计算机预测新Pr可能具有的性质Pr突变体设计的3个步骤利用计算机模拟技术确定突变位点及替换95在上述的设计工作完成后，要进行合成或突变实验并经分离、纯化及表征后得到所要求的新Pr；Pr设计的成功与否，必须要有理论与实验的紧密相结合

昆医分生蛋白质分子建模与设计课件96在上述的设计工作完成后，要进行合成或突变实验并经分离、纯化及表征后得到所要求的新Pr；Pr设计的成功与否，必须要有理论与实验的紧密相结合

昆医分生蛋白质分子建模与设计课件97

蛋白质分子设计原理内核假设。蛋白质的独特的折叠形式是由蛋白质内核中残基的相互作用决定。（内部十分保守的区域）Pr内部都是密堆积（很少有空穴大到水分子可以结合一个水分子或惰性气体），没有重叠蛋白质分子设计原理内核假设。蛋白质的独特的折叠形式是由蛋白98所有内部的氢键都是最大满足的（主链和侧链）。蛋白质的氢键形成涉及一个交换反应，溶剂键被蛋白质键所取代疏水及亲水基团需要合理的分布在溶剂可及表面及不可及表面。分布代表疏水效应的主要驱动力

蛋白质分子设计原理所有内部的氢键都是最大满足的（主链和侧链）。蛋白质的氢键形成99金属Pr中配位残基的替换要满足金属配位几何。要求围绕金属中心放置合适数目的蛋白质侧链或溶剂分子，并符合正确的键长、键角以及整体的几何。对于金属Pr，围绕金属中心的第二壳层中的相互作用是重要的。氢键的第二壳层通常涉及与蛋白质主链的相互作用。

蛋白质分子设计原理金属Pr中配位残基的替换要满足金属配位几何。要求围绕金属中心100最优的aa侧链几何排列。Pr侧链构象由空间两个立体因素所决定(一是立体势垒，二是aa的位置)结构及功能的专一性。这是Pr设计最困难的问题

蛋白质分子设计原理蛋白质分子设计原理101一、蛋白质分子设计的分类设计的目的主要有两个：

一是为有目的的蛋白质工程改造提供设计方案和指导性信息，如以此提高蛋白质的热、酸稳定性，增加活性，降低副作用，提高专一性等；

一、蛋白质分子设计的分类设计的目的主要有两个：102二是探索蛋白质的折叠机理，如简单蛋白质骨架的从头设计是研究蛋白质内相互作用力的类型及本质的很好途径，也为解决蛋白质折叠问题寻找定性和定量的规律。

二是探索蛋白质的折叠机理，如简单蛋白质骨架的从头设计是研究蛋103二是探索蛋白质的折叠机理，如简单蛋白质骨架的从头设计是研究蛋白质内相互作用力的类型及本质的很好途径，也为解决蛋白质折叠问题寻找定性和定量的规律。基本障碍：线性聚合构象熵；本实验将能够各自产生抗DON毒素和抗ZEN毒素的单链抗体基因，连接融合，表达出能同时与DON和ZEN两种毒素抗原特异性结合的双特异性单链抗体。（一）全新蛋白质设计程序序列；设计全β结构时，应选择Val、Ile等易于形成β折叠片的残基；VH也可以将之做新一轮计算的起点进行进一步的优化。(2)蛋白质的功能是在生理条件下挥发的，在其它条件下(如在有机溶剂中)是不稳定的;或者在结合腔内对一个已知的结构骨架进行化合物的衍生化。例如，有一种和癌症的发病有关的癌胚抗原CEA（Carcinoembryonicantigen），是由七个大小和形状都非常相似的结构域拼接构成的，各结构域之间由柔韧性较大的“铰链”片段相连。5mM)3µL同时利用能量优化及蛋白质动力学方法预测修饰后的蛋白质结构，以修正所选择的氨基酸位点和突变后的氨基酸种类。一、蛋白质分子设计的分类抗DON单链抗体改体研究（一）蛋白质分子设计的层次分为两个层次：一是在蛋白质三维结构已知基础上的分子设计；二是在三维结构未知的情况下，借助一级结构序列信息及生物化学性质进行分子设计工作。二是探索蛋白质的折叠机理，如简单蛋白质骨架的从头设计是研究蛋104（二）蛋白质分子设计的分类1．定点突变或化学修饰法2．拼接组装设计法3．从头设计全新蛋白质（二）蛋白质分子设计的分类1．定点突变或化学修饰法105玉米赤霉烯酮(ZEN)(3)专一性致使其应用范围受到影响。PCR扩增Anti-DON基因疏水及亲水基团需要合理的分布在溶剂可及表面及不可及表面。（二）蛋白质分子设计的分类制备感受态细胞VL第二节基于天然蛋白质结构的分子设计（内部十分保守的区域）ProteinFoldingDON:小麦镰刀菌毒素2．找出对所要求的性质有重要影响的位置以重组质粒为模板，进行Anti-DON基因的PCR分析。GGGGSGGG第一节蛋白质分子设计原理二、蛋白质分子设计的原则1．活性设计2．对专一性的设计3．Scaffold设计(框架)4．疏水基团与亲水基团需合理分布5．最优的氨基酸侧链几何排列玉米赤霉烯酮(ZEN)二、蛋白质分子设计的原则1．活性设计106溶菌酶结构例如:鸡卵清蛋白溶菌酶活性分子的设计过程中，其中EFAEEAASF多肽能水解几丁质和葡聚糖，但糖苷酶活性较低。

Cutte成功设计了一个具有明显的核酸酶活性的34肽，该肽可水解下列底物，但活性依次降低：polyC、polyA、polyU、polyG。其主要活性源于二聚体；而天然核酸酶仅消化polyC、polyU、polyA，特别倾向于水解polyC的3’端。溶菌酶结构例如:鸡卵清蛋白溶菌酶活性分子的设计过程中，其中E107设计步骤蛋白质分子设计步骤图修正设计获得目标蛋白质序列合成检测结构信息分析建立结构模型设计目标蛋白质数据库设计步骤蛋白质分子设计步骤图修正设计获得目标蛋白质序列合成检108序列设计设计α螺旋时，应选择象Leu、Glu等易于形成α螺旋的残基；设计全β结构时，应选择Val、Ile等易于形成β折叠片的残基；而在设计转角时常选择Pro-Asn残基对。序列设计设计α螺旋时，应选择象Leu、Glu等易于形成α螺旋109第二节基于天然蛋白质结构的分子设计基于天然蛋白质结构的分子设计有两类：一是进行蛋白质修饰或基因定位突变，即“小改”；二是进行蛋白质分子裁剪拼接，即“中改”。

第二节基于天然蛋白质结构的分子设计基于天然蛋白质结构的分子110一、定位突变

基于天然蛋白质结构的蛋白质分子“小改”是指对已知结构的蛋白质进行少数几个残基的修饰、替换或删除等，这是目前蛋白质工程中最广泛使用的方法，主要可分为蛋白质修饰和基因定位突变两类。一、定位突变111（一）定位突变的设计目标及解决方法

定位突变常见的设计目标是提高蛋白质的热、酸稳定性、增加活性、降低副作用、提高专一性，以及通过蛋白质工程手段进行结构-功能关系的研究等。（一）定位突变的设计目标及解决方法定位突变常见的112Hartley等于1986年完成了一个我们所要的设计目标及解决的办法：热稳定性对氧化的稳定性对重金属的稳定性pH稳定性提高酶学性质引入二硫桥，增加内氢键数目，改善内疏水堆积把Cys转换为Ala或Ser，把Trp转换为Phe或Tyr替代表面羧基，把Met转换为Gln、Val、Ile或Leu替换表面荷电基团，His、Cys以及Tyr的置换专一性的改变，增加逆转数，改变酸碱度Hartley等于1986年完成了一个我们所要的设计目标及解113（二）定位突变的种类

要进行基因定位突变，改变DNA核苷酸序列，方法有很多种，如基因的化学合成、基因直接修饰法、盒式突变技术等。根据基因突变的方式，分为以下三类：插入一个或多个氨基酸残基；删除一个或多个氨基酸残基；替换或取代一个或多个氨基酸残基。要达到基因定位突变的目的，多采用体外重组DNA技术或PCR方法。（二）定位突变的种类要进行基因定位突114（三）定位突变的程序1．建立所研究蛋白质的结构模型

可以通过X射线晶体学、二维核磁共振等测定结构，也可以根据类似物的结构或其他结构预测方法建立起结构模型。（三）定位突变的程序1．建立所研究蛋白质的结构模型1152．找出对所要求的性质有重要影响的位置在改造中如何恰当地选择突变残基是一个关键问题，这不仅需要分析残基的性质，同时还需要借助于已有的三维结构或分子模型。2．找出对所要求的性质有重要影响的位置在改造中如何恰当地选择1163．预测突变体的结构

根据所选定的氨基酸残基位点及突变后的氨基酸种类，利用相关软件进行突变体的结构预测，将预测的结构与原始的蛋白质结构比较；利用蛋白质结构-功能或结构-稳定性相关知识及理论计算预测新蛋白质可能具有的性质；同时利用能量优化及蛋白质动力学方法预测修饰后的蛋白质结构，以修正所选择的氨基酸位点和突变后的氨基酸种类。3．预测突变体的结构根据所选定的氨基1174．构建突变体，获得突变体蛋白

依据所设计好的突变，利用化学合成或PCR等方法构建突变体。进行基因测序验证突变体后，将突变体进行表达，纯化蛋白质，获得所设计的新蛋白质。4．构建突变体，获得突变体蛋白1185．突变体蛋白质的检验测定新蛋白质的序列、三维结构、稳定性、催化活性等，并与对应的天然蛋白质进行比较，检验突变设计的效果，同时进一步修正设计方案。5．突变体蛋白质的检验测定新蛋白质的序列、三维结构、稳定性、119蛋白质中功能残基的鉴定根据结构信息确定残基的突变突变方法鉴定突变功能残基利用蛋白质同源性鉴定功能残基（四）蛋白质中功能残基的鉴定蛋白质中功能根据结构信息利用蛋白质同源性（四）蛋白质中功能残1201．根据结构信息确定残基的突变最有效最直接的方法AlanFersht和GregWinter等测定了酪氨酰-tRNA合成酶突变体的三维结构，通过分析该酶的Cys35被结构相似的丝氨酸所取代后的结构，发现Cys35可能与酪氨酰腺苷酸中间体中的3’羟基形成氢键，突变效应降低了酶的活性，证实了Cys35在结合腺苷酸部分的作用。1．根据结构信息确定残基的突变最有效最直接的方法1212．突变方法鉴定突变功能残基通过引进另外一种突变来检测随机突变技术删除分析及连接片段扫描突变2．突变方法鉴定突变功能残基通过引进另外一种突变来检测1223．利用蛋白质同源性鉴定突变功能残基高度保守的残基与同源蛋白的共同功能以及维持结构有关。非保守残基是分析的靶位点，特别是对于专一性研究。探测突变蛋白质的结构整体性质，以鉴定突变残基。3．利用蛋白质同源性鉴定突变功能残基高度保守的残基与同源蛋白123（五）定位突变的应用RNaseT1的结构改造是分于设计中的一个成功实例T1核糖核酸酶含有104个氨基酸残基，这个天然酶有两对二硫键（Cys2-Cys10，Cys6-Cys100，日本大阪大学的Niskikawa等人在Tyr24和Asn84位引入第三个二硫键，热稳定性增加。（五）定位突变的应用RNaseT1的结构改造是分于设计中的124二、蛋白质分子拼接例如，有一种和癌症的发病有关的癌胚抗原CEA（Carcinoembryonicantigen），是由七个大小和形状都非常相似的结构域拼接构成的，各结构域之间由柔韧性较大的“铰链”片段相连。研究发现，癌胚抗原的这种多结构域特征有利于它的细胞识别和粘合作用。二、蛋白质分子拼接125英国剑桥大学的Winter等人利用分子剪裁技术成功地在抗体分子上作了实验(人源化抗体)英国剑桥大学的Winter等人利用分子剪裁技术成功地在抗体分126单链抗体scFv结构（抗体工程)抗DON单链抗体改体研究DON:小麦镰刀菌毒素单链抗体scFv结构（抗体工程)抗DON单链抗体改体研究DO127

单链抗体的linker改造GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGGGSGGGGGGGSGGG

VHVHVHVHVHVHVLVLVLVLVLVL单链抗体的linker改造128

单链抗体的改体模型VHVHVHVHVHVHLinker﹥12aaVＬVＬVＬVＬVＬVＬLinkerLinker3-12aa<3aaVＬVＬVＬVＬVHVHVHVH单链抗体的改体模型VHVHVHVHVHVHLinker﹥129

Linker

XhoⅠSalISalⅠSalⅠXhoⅠ双酶切EcoRIXhoⅠ双酶切EcoRISalI双酶切differentlength连接ＶＨＶＬ

技术路线EcoRILinkerXhoⅠSalⅠEcoRIEcoRIdi130转化筛选、检测

蛋白质的诱导生成

表达载体构建

感受态细胞的制备纯化亲和力初步测定转化筛选、检测蛋白质的诱导生成表达载体构建感受态细131PCR扩增重链、轻链策略LinkerVHVLP3P4P5P6P7P8P1P2PCR扩增重链、轻链策略132PCR反应体系及反应条件50L反应体系如下：10×TaqPCRBuffer5µLdNTP(2.5mM)3µLForwardPrimer(20mM)1µLReversePrimer(20mM)1µLTemple1µLrTaq0.3µL

AddddH2Otoafinalvolumeof50µLPCR循环条件为：94℃5min，1个循环；94℃45s，58℃30s，72℃45s，31个循环；72℃40s，25个循环；72℃7min，1个循环。取PCR产物5µL，1.0％的琼脂糖电泳检测。PCR反应体系及反应条件50L反应体系如下：

133VH

和VL的PCR扩增结果

１２３４５９６７８7500150001000025001002505007501000200010002505000VH和VL的PCR扩增结果１２３４５９６７８75001134

菌落PCR重组子验证123456712345671234567200010007505002501002000200010001000750750500500250250100菌落PCR重组子验证1135

改体抗体在大肠杆菌BL21中的表达及其纯化

1234567897.4KD66.2KD42.7KD31KD改体抗体在大肠杆菌BL21中的表达及其纯化1136

改体抗体的ELISA初步测定312456789101112改体抗体的ELISA初步测定31245678910111137单链抗体抗体：是体液免疫应答的主要效应分子。由两条相同的重链（H链）和两条相同的轻链（L链）组成。双特异性单链抗体的构建与表达单链抗体双特异性单链抗体的构建与表达138单链抗体（scFv）：抗体可变区的重链（VH）与轻链（VL）通过一段约15-25个氨基酸残基构成的弹性短肽（Linker）相连，融合表达出来的抗体片断。

单链抗体（scFv）：139双特异性单链抗体能识别两种抗原并能与之结合的单链抗体（或抗体复合物）称为双特异性单链抗体。本实验将能够各自产生抗DON毒素和抗ZEN毒素的单链抗体基因，连接融合，表达出能同时与DON和ZEN两种毒素抗原特异性结合的双特异性单链抗体。玉米赤霉烯酮(ZEN)双特异性单链抗体玉米赤霉烯酮(ZEN)140技术路线

DON和ZEN抗体基因的提取目的基因片段引物的设计

PCR扩增目的片段

制备感受态细胞

酶切目的片段、载体，linker连接

转化连接产物

酶切验证重组子

表达、纯化蛋白技术路线DON和ZEN抗体基因的提取目的基因141载体的构建Anti-ZENgeneAnti-DONgeneXhoΙEcoRΙSalΙNcoΙ连接

Linker载体的构建Anti-ZENgeneAnti-DONgen142PCR扩增Anti-DON基因

12M20001000(bp)800bp750250100500PCR扩增Anti-DON基因1143PCR扩增Anti-ZEN基因

M1220001000750500250100(bp)750bpPCR扩增Anti-ZEN基因M144重组验证重组验证145PCR验证以重组质粒为模板，进行Anti-DON基因的PCR分析。PCR验证以重组质粒为模板，进行Anti-DON基因的PCR146双特异性抗体的表达双特异性抗体的表达147

我们知道,蛋白质的空间结构受其氨基酸序列控制,而功能又与结构密切相关。

如果能够找到构造蛋白质结构的方法,我们就能得到具有任意结构和功能的全新蛋白质,这就是蛋白质全新设计问题。第三节全新蛋白质设计我们知道,蛋白质的空间结构受其氨基酸序列控制,148

蛋白质从头设计概念

从头设计能够根据生物分子的活性位点特征产生一系列的结构片段，通过连接这些结构片段可以构成一个全新分子；或者在结合腔内对一个已知的结构骨架进行化合物的衍生化。

从头设计方法可以生成全新的分子结构。蛋白质从头设计概念从头设计能够根据生物分子的活14