亲和分离技术

关于亲和分离技术第一页，共一百零二页，2022年，8月28日第六章亲和分离技术6.1亲和萃取6.2亲和沉淀6.3亲和膜技术6.4分子印迹分离技术6.5亲和反胶团萃取技术第二页，共一百零二页，2022年，8月28日6.1亲和萃取亲和萃取简介

亲和配基高聚物的合成亲和分配的影响因素和亲和模型亲和分配的应用第三页，共一百零二页，2022年，8月28日6.1.1

亲和萃取简介萃取是一种常见的生化分离技术，生化分离技术的萃取技术包括双水相萃取、反胶团萃取等。亲和萃取就是将亲和层析的亲和配基用于萃取分离中，包括亲和双水相和亲和反胶团等。第四页，共一百零二页，2022年，8月28日分离蛋白亲和配基体系白蛋白脂肪酸PEG/dextran碱性磷酸化酶ProcionredHE-3GPEG/dextran,PEG/盐共脂肪酶（Colipase）卵磷脂LecithinPEG/dextran脱氢酶，激酶活性染料PEG/dextran,PEG/盐α-2-巨球细胞Cu2+PEG/dextranS-23骨髓瘤蛋白二硝基酚PEG/dextran3-氧代类固醇异构酶雌甾二醇lPEG/dextran胰蛋白酶对氨基苯咪PEG/dextran亲和萃取简介常用的亲和配基、双水相体系和它们所对应分离的物质第五页，共一百零二页，2022年，8月28日6.1.2

亲和配基高聚物的合成亲和双水相中亲和配基可固定在上相高聚物或下相高聚物上，甚至亲和配既可以以游离状态分配在体系中。一般配基固定在上相高聚物上，即将亲和配基通过化学方法结合在PEG上。主要包括以下两种:

PEG的活化亲和配基直接反应第六页，共一百零二页，2022年，8月28日6.1.3

亲和分配的影响因素和亲和模型影响亲和分配的影响因素包括普通双水相的影响因素如PEG浓度，还有:

配基浓度配基载体

染料配基pH:增加，效率降低

温度:升高，效率降低

盐浓度第七页，共一百零二页，2022年，8月28日盐的种类添加盐时的△logK占不添加盐时的百分数（％）25mM63mM250mM磷酸钠（添加）100103——甲酸钠，pH7————88醋酸钠，pH71059781丙酸钠，pH7————89Na2SO4988533KCl1048021Li2SO4——77——Tris，pH7——76——KI97691NaSCN——67——临苯二甲酸钾——48——NaClO4——42——亲和分配的影响因素和亲和模型盐对分配系数的影响第八页，共一百零二页，2022年，8月28日亲和分配的影响因素和亲和模型体系中的目标蛋白质被配基分子饱和时第九页，共一百零二页，2022年，8月28日亲和分配的影响因素和亲和模型整个过程的自由能变可以列成如下算式ΔG5＝ΔG1＋ΔG2＋ΔG3＋ΔG1第十页，共一百零二页，2022年，8月28日有N个结合位点的蛋白质而言亲和分配的影响因素和亲和模型推导得目标蛋白质的结合位点不被配基－聚合物饱和时第十一页，共一百零二页，2022年，8月28日6.1.4

亲和分配的应用乳酸脱氢酶（LHD）的亲和分配第十二页，共一百零二页，2022年，8月28日6.1.4

亲和分配的应用葡萄糖-6-磷酸化脱氢酶（G6PDH）的纯化第十三页，共一百零二页，2022年，8月28日6.1.4

亲和分配的应用葡萄糖-6-磷酸化脱氢酶（G6PDH）的纯化第十四页，共一百零二页，2022年，8月28日6.2亲和沉淀分离技术

亲和沉淀的原理亲和沉淀聚合物和亲和配基

亲和沉淀可逆性聚合物亲和沉淀亲和配基

亲和沉淀的展望第十五页，共一百零二页，2022年，8月28日6.2.1

亲和沉淀的原理亲和沉淀的机理：加到含有目标分子得溶液中配体的连接特异性结合目标分子形成亲和沉淀目标分子解离亲和沉淀原理图亲和沉淀(Affinityprecipitation)是将生物专一性识别与沉淀分离相结合的纯化技术。第十六页，共一百零二页，2022年，8月28日亲和沉淀的优点溶液中进行，无扩散传质阻力和结合时的空间位阻，亲和结合速度快，结合充分；亲和配基裸露在溶液中，配基利用率高；利用成熟的离心或过滤技术回收沉淀，易于规模放大

亲和沉淀法可用于高粘度或含微粒的料液中目标产物的纯化，可在分离操作的初期进行，这对目标分子是极其有利的：因为粗料液中通常含有对目标产物有害的杂质（如蛋白酶）。快速、有效地将目标产物分离出来，有利于提高产品的质量和收率第十七页，共一百零二页，2022年，8月28日亲和沉淀机理一次作用亲和沉淀

(primary-effectprecipitation)

二次作用亲和沉淀

(secondary-effectprecipitation)

亲和沉淀的机理分为两种第十八页，共一百零二页，2022年，8月28日一次作用亲和沉淀水溶性化合物分子偶联有两个或两个以上的亲和配基，即双配基(bis-ligand)和多配基(polyligand)通过与多价蛋白质(multivalentprotein)支联，在适当的条件下，形成较大的支联网络而沉淀。一次作用亲和沉淀作用机理与抗原－抗体的沉淀作用相似。存在着配基与蛋白质的结合部位的最优化使沉淀率最高。第十九页，共一百零二页，2022年，8月28日一次作用亲和沉淀虽然简单，但仅适用于多价、特别是4价以上的蛋白质要求配基与目标分子的亲和结合常数较高沉淀条件难于掌握，并且沉淀的目标分子与配基的分离需要凝胶过滤等难于大规模应用的附加工具，实用上存在较大难度。另外，在一次作用亲和沉淀这常用的多配基染料有配基自交联(ligandself-assoliation)的现象，成为交联网络形成的竞争机制，从而阻碍了沉淀的生成。所以人们更多是采用二次作用亲和沉淀。一次作用亲和沉淀第二十页，共一百零二页，2022年，8月28日二次作用亲和沉淀制备亲和沉淀介质:利用在物理场如pH、离子强度、温度等改变时溶解度下降、发生可逆性沉淀的水溶性聚合物为载体固定亲和配基。亲和介质结合目标分子后，通过改变物理场使介质与目标分子共同沉淀的方法称为二次作用亲和沉淀。

离心或过滤回收沉淀，即可除去未沉淀的杂蛋白。沉淀清洗后加入洗脱剂即可纯化目标产物。第二十一页，共一百零二页，2022年，8月28日二次亲和沉淀分离蛋白质示意图第二十二页，共一百零二页，2022年，8月28日6.2.2亲和沉淀聚合物和亲和配基典型的亲和沉淀有以下步骤：①亲和沉淀介质的制备②将亲和沉淀介质加入含有目标蛋白质或酶的粗液中③聚合物－亲和配基－目标蛋白的沉淀:通过降低聚合物的溶解度来实现聚合物发生可逆性沉淀的方法：

pH、温度、离子强度的改变金属离子的添加水溶性有机溶剂的添加等选用何种方法取决于使用的配基载体，有时几种方法联合使用第二十三页，共一百零二页，2022年，8月28日典型的亲和沉淀有以下步骤（续）：④离心或过滤使沉淀分离，使目标蛋白就从杂蛋白中分离出来⑤目标分子的解离：目前所采用的洗脱方式于亲和层析所使用的方法大致相同，如改变pH值或离子强度来降低目标成为与配基的亲和作用力。⑥配基的回收：如果目标蛋白的洗脱是在介质与目标蛋白复合物不溶的状态下进行，配基可重新使用；否则，需要采取凝胶过滤等方法分离第二十四页，共一百零二页，2022年，8月28日亲和沉淀的有机聚合物，主要是可逆性沉淀聚合物即亲和载体(affinitycarrier)或可逆性溶解聚合物可逆性溶解聚合物SIS（SolubleandInsolublePolymers）溶解和非溶解状态可随环境参数如pH、温度等的变化发生可逆变化，因此可用于酶或蛋白质的亲和沉淀。可逆性溶解聚合物可以直接和蛋白质结合发生亲和沉淀，但有时需要将亲和配基结在可逆性溶解聚合物上。亲和沉淀可逆性聚合物第二十五页，共一百零二页，2022年，8月28日二次亲和沉淀选择可逆性聚合物的原则：

包含活性基团，以便亲和配基能够结合；不能和亲和配基强烈结合，以免配基不能和目标分子作用；

在一定条件下可以发生明显的可逆性的沉淀和溶解；

分子量分布窄；

可形成紧密的沉淀；易回收，有一定循环操作次数；廉价易得亲和沉淀可逆性聚合物第二十六页，共一百零二页，2022年，8月28日

(1)

天然的可逆性溶解聚合物目前所使用的天然亲和配基载体主要是脱乙酰壳聚糖(chitosan)和藻酸盐(alginate):Chitosan在pH低于6时是可溶性的，升高pH值则会发生沉淀藻酸盐是D－甘露糖醛酸和L－葡萄糖醛酸的线性多聚物，在二价阳离子如Cu2+的存在下或pH低于2的条件下形成沉淀

第二十七页，共一百零二页，2022年，8月28日Senstad和Mattiasson将大豆胰蛋白酶抑制剂(soybeantrypsininhibitor,STI)共价偶联到亲和配基载体Chitosan上，制成亲和沉淀介质结合胰蛋白酶(trypsin)用0.1M的NaOH调节溶液PH值至8.5，介质与胰蛋白酶一起沉淀，离心用0.1M的glycine-盐酸缓冲液清洗，胰蛋白酶与配基STI解离（此时PH约2.5），胰蛋白酶收率为86％。研究表明，为了使沉淀更完全，应适当延长时间，因为亲和作用进行很快，但沉淀步骤相对来说要缓慢得多。

(1)

天然的可逆性溶解聚合物(应用pH敏感性)第二十八页，共一百零二页，2022年，8月28日孙彦等人研制了含有共轭二炔结构单元的磷脂酰乙醇胺型聚合脂质体(PolymerizedLiposome,PLS)。磷脂酰乙醇胺的水悬浮液在超声波处理下形成0.1-0.2mm的球形液泡状磷脂双分子膜，即脂质体(liposome)，表面为亲水性乙醇胺基团。该脂质体溶液在紫外线照射下可发生聚合反应，形成聚合脂质体，即PLS。向PLS溶液加入NaCl，当NaCl浓度超过0.17mol/L时，在渗透压作用下PLS发生快速完全的沉淀。离心回收沉淀后向其中加入水或低浓度盐溶液，沉淀重新溶解。(2)

合成可逆性溶解聚合物(应用离子强度敏感性)第二十九页，共一百零二页，2022年，8月28日可逆沉淀性聚合物——

聚合脂质体（polymerizedliposome,PLS）

第三十页，共一百零二页，2022年，8月28日PLS具有在盐的作用下发生可逆性沉淀的性质。将大豆胰蛋白酶抑制剂（STI〕共价偶联PLS的表面，制成亲和沉淀介质STI－PLS。加入猪胰提取液中，用0.1M的NaCl沉淀，离心，并用0.01M的NaOH洗脱胰蛋白酶。结果表明，此法亲和沉淀的胰蛋白酶收率在80％以上，纯化倍数达到8，比活达到13000U/mg，接近纯酶的水平。PLS的优点是，在很宽的PH值范围内和有机溶解中均表现出良好的稳定性，经配基修饰后具有很好的蛋白质亲和沉淀特性：蛋白质吸附容量大，无非特异性吸附。(2)

合成可逆性溶解聚合物(应用离子强度敏感性)第三十一页，共一百零二页，2022年，8月28日可逆沉淀性聚合物

—聚丙烯酰胺第三十二页，共一百零二页，2022年，8月28日亲和配基载体EudragitS-100，它是甲基丙烯酸(methacrylicacid)和甲基丙烯酸甲酯(methylmethacrylate)的聚合物。EudragitS-100在PH低于5时发生可逆性沉淀；在(NH4)2SO4或PEG8000存在的情况下，沉淀发生的PH值相对高一些。Eudragit与亲和配基染料CibucronBlue的复合物Eudragit-CibacronBlue在Ca2+存在的条件下，温度达到40℃，在任何PH值范围内都会发生可逆性沉淀。这就扩大了Eudragit的应用范围，尤其是对那些在酸性条件容易变性的酶类。(2)

合成可逆性溶解聚合物第三十三页，共一百零二页，2022年，8月28日亲和沉淀的亲和配基在很多情况下，亲和沉淀时将亲和配基固定在可逆性溶解聚合物上，亲和沉淀的亲和配基和亲和层析的配基没有太大差异，包括生物专一性配基如辅酶、蛋白质A及非专一性亲和配基如染料、金属离子等。采用双金属离子螯和的双功能试剂，将金属离子固定在一些可以固定金属离子的二聚物如poly-VI-VCL和poly-VI-PIPAM。这些聚合物上有多个咪唑基，可以结合金属离子Cu2+。Cu2+-poly-VI-NIPAM已成功地用来沉淀分离大豆蛋白酶抑制剂；Cu2+-poly-VI-VCL可用于分离纯化乙酸脱氢酶。第三十四页，共一百零二页，2022年，8月28日poly-VI-NIPAMpoly–VI-VCL亲和沉淀的亲和配基第三十五页，共一百零二页，2022年，8月28日6.2.3

亲和沉淀的展望亲和沉淀是一种简单、高效的分离纯化技术，已在多种蛋白的分离纯化中应用。pH敏感性亲和沉淀

热诱导亲和沉淀离子强度敏感性的亲和沉淀亲和沉淀和其他技术的集成制备规模的亲和沉淀第三十六页，共一百零二页，2022年，8月28日

(1)

pH敏感性亲和沉淀pH敏感性聚合物本身带有电荷，当它的净电荷减少时，溶解度降低而发生沉淀，通过改变pH值改变其溶解状态，以此类聚合物作为载体结合亲和配基用于亲和沉淀。pH敏感性聚合物包括：天然可逆性聚合物：脱乙酰壳聚糖(chitosan)、藻酸盐(alginate)、纤维素衍生物（cellulose）；合成可逆性聚合物：丙烯酰胺、N-丙烯酰-p-氨基苯酸、N-丙烯酰-m-氨基苯酰胺的共聚物，甲基丙烯酸(methacrylicacid)和甲基丙烯酸甲酯(methylmethacrylate)的聚合物，异丁烯酸-异丁烯酸甲酯共聚物等第三十七页，共一百零二页，2022年，8月28日

对某些可逆溶解性聚合物，通过改变温度可改变溶解度。在亲和沉淀中使用的热聚合物用于蛋白质的分离纯化时，能够进行特异性沉淀，称为热诱导亲和沉淀。其原理是利用双官能团试剂，其中一部分功能基团与被分离的生物分子特异性结合，另一部分功能基团在介质性质尤其是温度变化后能形成沉淀。(2)

热诱导亲和沉淀第三十八页，共一百零二页，2022年，8月28日对氨基苯甲眯结合到异丙基酰胺的共聚物上就得到已蛋白酶的热亲和沉淀聚合物，将这种沉淀剂加入胰蛋白酶提取液中形成以蛋白酶-聚合物复合体。滤液中剩余的酶活仅为原酶活的7%。过滤得到沉淀复合物，加入缓冲液中加热，使胰蛋白酶和聚合物脱离，得到分离纯化的酶。热诱导亲和沉淀可以和亲和配基如金属离子结合起来，如Cu-IDA-PVCL是一种人诱导聚合物，可用于乙酸脱氢酶的分离纯化。(2)

热诱导亲和沉淀（应用）第三十九页，共一百零二页，2022年，8月28日(3)离子强度敏感性的亲和沉淀此类聚合物在很宽的pH范围内对有机溶剂表现出良好的稳定性，当添加或除去盐是发生可逆性沉淀。孙彦等人研制了含有共轭二炔结构单元的磷脂酰乙醇胺型聚合脂质体(PolymerizedLiposome,PLS)具有这种性质，这在前面已经叙述过。第四十页，共一百零二页，2022年，8月28日

(4)

亲和沉淀和其他技术的集成双水相萃取技术易于直接处理含细胞碎片的体系，可以和亲和沉淀技术结合起来，提高分离效率。Kamihira等人将亲和沉淀和双水相技术结合分离纯化蛋白质A亲和沉淀的可逆溶解聚合物EudragitS-100，以免疫球蛋白IgG为配基Eudragit主要分配在上相，因此和蛋白A结合的Eudragit分配在上相，分出上相后，调节pH使Eudragit沉淀，再将沉淀复合物解离便可得到蛋白A，同时上相的聚合物可以重复使用。具体过程如图所示。第四十一页，共一百零二页，2022年，8月28日第四十二页，共一百零二页，2022年，8月28日制备规模的亲和沉淀(1)T1中加入料液(2)调节温度至4℃(3)加入AML和助滤剂(4)调节温度至30℃进行沉淀(5)30℃下，在F1中进行混合物的过滤，在T2中收集滤液(6)30℃下，用硫酸铵溶液洗涤滤饼，在T2中收集滤液(7)30℃下，用洗脱液洗涤滤饼，在T3中收集含有目标分子的洗脱液(8)洗涤并回收AML和过滤助剂，重复利用第四十三页，共一百零二页，2022年，8月28日6.3亲和膜分离技术

亲和膜的原理及特点亲和膜的制备

膜材料和（基质）配基的选择亲和膜的制备亲和膜分离的理论模型

吸附模型亲和膜过程传质模型

亲和膜分离技术的影响因素亲和膜分离技术的应用第四十四页，共一百零二页，2022年，8月28日6.3.1亲和膜的原理和特点

亲和膜分离是将亲和分离技术和膜分离技术结合，它将亲和配基结合在分离膜上，利用膜作为基质，对膜进行改性，再按照吸附、清洗、洗脱和再生的过程，对生物产品进行分离纯化。

第四十五页，共一百零二页，2022年，8月28日

亲和膜分离亲和色谱原理利用膜固定亲和配基利用层析介质固定亲和配基过程一般为低压，可连续操作低、中、高都有，一般为间歇式操作设备板式、卷式、中空纤维式超滤或微滤膜填料一般在柱中进行速度快，扩散阻力小较慢，扩散阻力较大产物纯度相对较低纯度很高亲和膜和普通的亲和层析的比较第四十六页，共一百零二页，2022年，8月28日具有相同传质效率的亲和膜

与亲和色谱装置参数

中空纤维亲和膜装填100μm凝胶粒子的亲和色谱装置流体停留时间0.014min34.7min装置体积0.773dm31070dm3平均流速1.4dm3/min1.4dm3/min配基装填量1.9g1950g第四十七页，共一百零二页，2022年，8月28日膜多孔床上的配基和液流之间的扩散路径极短，传质速率很高，可更有效的利用配基，所以大大加快了分离时间，提高了分离效率。膜床的厚度一般较小，液流通过膜时的阻力也较小，因此压降也较小，便于实现大规模的分离和连续、自动操作。第四十八页，共一百零二页，2022年，8月28日亲和膜的操作模式死端过滤模式Dead-endmode错流过滤模式Cross-flowmode微孔亲和过滤膜亲和超滤膜第四十九页，共一百零二页，2022年，8月28日亲和膜的形状板式圆盘式中空纤维式

前两种较为简单，成本低，容量小，中空纤维式便于实现连续、自动、规模化操作第五十页，共一百零二页，2022年，8月28日膜材料（基质）和配基的选择亲和膜对基质材料的要求

(1)惰性；(2)具有亲水性；(3)物理、化学性质稳定，同时机械稳定性也好；(4)多孔性，内外表面积大；(5)具有足够多的可利用的化学基团；(6)非特异性吸附低；(7)适于成膜6.3.2

亲和膜的制备第五十一页，共一百零二页，2022年，8月28日

亲和膜的制备常用亲和膜基质材料脂族烃类（聚乙烯，聚丙烯，聚丙烯氢）芳香族共聚物（聚碳酸酯，聚砜，聚醚砜）脂族聚酰胺（尼龙6，尼龙66）一些特殊的聚合物，如聚乙烯醇，纤维素和纤维素的衍生物等第五十二页，共一百零二页，2022年，8月28日膜材料制造商膜特性应用NalgeneMemtekCorp.圆形,Φ2.5cm,4.7cm,孔径0.2µ,0.5µ,交联、结合酶及血清白蛋白的纯化ActidickFMCCorp.圆形,孔径1µ,交联、包埋肽、蛋白质及酶的固载化MemSep1010Millipore圆形,床体积1.4ml,孔径1.2µ，结合蛋白A6mg单抗和多抗的分离MemSep1010Millipore床体积4.9ml,蛋白A28mg单抗和多抗的分离NugelSeparationCorp.平板式10cm×20cm,包埋、涂层、结合抗原、抗体、重组蛋白及酶的纯化聚合物、硅胶BiotechnologyInst.ofCanada板式亲和超滤，结合型胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的纯化PolymerBiochemic板式15cm×cm,结合孔径0.2～2µ细胞生长剂，IgG、干扰素纯化（氨基苯甲醚）Fiuka卷式（0.3cm×3cm），结合孔径0.2µRNA、DNA转录，中性蛋白纯化Protrans大连化物所板式10cm×10cm,结合孔径0.2～0.5cm胰蛋白酶抑制剂的分离第五十三页，共一百零二页，2022年，8月28日亲和膜的制备亲和配基特异性配基：只与其对应的分子特异性结合，如抗原、抗体、激素、激素受体等

常见的特异性配基：

肝素、伴刀豆蛋白A、单克隆抗体、胰蛋白酶等通用型配基：与某一类物质结合

常见的通用型配基：

①NAD+、NADP+等辅酶；②

CibacronBlueF3G-A、ProcionRedH-3B、Procion

③

BlueMX-3G等活性染料④金属离子（Cu2+、Ni2+、Fe2+、Zn2+）亲和膜的亲和配基一般可分为两类：

特异性配基和通用型配基第五十四页，共一百零二页，2022年，8月28日配基应用的膜生物特异性配基ProteinA中空纤维膜，平板膜白细胞间介素2受体中空纤维膜肝素聚合物/共聚物膜sartobind单克隆抗体中空纤维胰蛋白酶改性聚砜膜通用性配基CibraonBlue聚合物/共聚物膜sartobind，尼龙膜，壳聚糖膜IDA-Cu2+改性PE膜，聚合物/共聚物膜sartobind，改性聚砜膜苯丙氨酸改性PE膜组氨酸或糖多菌素尼龙66平板膜常见亲和膜配基第五十五页，共一百零二页，2022年，8月28日间隔臂在分离生物大分子时，若将亲和配基直接结合到基质上，由于欲分离生物大分子的立体构型使它很难接近介质上的配基产生亲和相互作用，此即色谱分离中的“空间位阻”效应。这种情况在配基是小分子时表现尤为明显，为了克服这种障碍，往往在介质和配基之间插入一个具有一定几何长度的有机基团，即间隔臂，以使欲分离的物质方便的接近亲和配基上的作用位点。第五十六页，共一百零二页，2022年，8月28日

对于一个理想的间隔臂，不仅要具有一定的长度（至少要含3个以上原子），而且要求其自身不带任何电荷，疏水性也不能太强，不带任何附加的活性中心，以避免对分离物产生非特异性相互作用。由于间隔臂既要与亲和介质相连，又要与配基相接，因此要求其分子上含有双官能团反应基。间隔臂长度一般以5-50nm较为适宜。常用的间隔臂是含2个活泼氨基的二胺类化合物，如乙二胺、丙二胺、己二胺、对苯二胺等。此外许多氨基酸和肽类化合物，由于其分子含有氨基、羧基、羟基、巯基等可反应的基团，也可用作间隔臂。间隔臂第五十七页，共一百零二页，2022年，8月28日亲和膜的制备

很多膜材料不能直接应用于亲和膜的分离，必须改性后才可以使用。改性的目的侧重于增加膜的亲水性、生物相容性，降低非特异性吸附，同时膜应具有良好的机械强度、孔结构、渗透性和均匀的孔分布。改性的膜再接上亲和配基制备成亲和膜。亲和膜的制备主要分为三步:成膜、功能化、活化第五十八页，共一百零二页，2022年，8月28日按机械先后顺序不同可分为以下两种途径：膜材料→功能化的膜材料→功能化的膜→活化的膜膜材料→包埋或结合亲和配基→功能化的膜

亲和膜的制备功能化，通过引用适当的基团，使膜改性；活化，引入基团使膜的活性增强、能与配基作用具体采用哪一种途径更好，因材料而异，一般认为活化在成膜后机械更好一些，成膜方法有溶胶－凝胶转化法，静电纺丝法第五十九页，共一百零二页，2022年，8月28日纤维素亲和膜的制备由于纤维素膜分子上有许多羟基，因此可以用碳二胺法，氧化物法等羟基活化方法进行活化,然后结合上亲和配基。商振华等用3-氯-1,2-环氧丙烷活化纤维素以对苯二胺作为间隔臂，然后偶合牛血清白蛋白活性染料作配基，制得一系列亲和膜，并用于-干扰素、白蛋白、碱性磷酸酯酶等的分离纯化，效果良好。第六十页，共一百零二页，2022年，8月28日纤维素膜的交联和活性染料配基的固载化第六十一页，共一百零二页，2022年，8月28日聚酰胺膜可以先用酸水解改性，然后结合上羟乙基纤维素以增强反应基团的活性，而且降低蛋白质的非特异性吸附。在亲和分离中，以尼龙膜居多。水解后的尼龙66微孔膜用二溴丙烷活化，接上己二胺做间隔臂，再用戊二醛法固载上组氨酸，制得的亲和膜可成功地去除氨基酸注射液、牛血清蛋白、溶菌酶等医药制剂中的内毒素，去除率在90%以上。聚酰胺亲和膜的制备第六十二页，共一百零二页，2022年，8月28日膜亲和介质MAC-His-NL66的制备过程第六十三页，共一百零二页，2022年，8月28日聚丙烯亲和膜的制备聚丙烯膜多用辐射诱导接枝甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）的方法进行活化，接枝的GMA环氧基可用以键合配基，剩余环氧基要转变为二醇基，或采用其他试剂封闭，降低非特异性吸附。同时GMA还起到了间隔臂的作用。

Kim等人在聚丙烯中空膜上辐射诱导接枝上GMA，用苯丙氨酸、色氨酸做配基，吸附-球蛋白。第六十四页，共一百零二页，2022年，8月28日聚砜亲和膜的制备聚砜（PS）虽是一种良好的成膜材料，但其具有的憎水性使它不能直接用作亲和分离介质，必须进行化学改性，变成具有一定亲水性的膜才能使用。聚砜膜的改性方法通常有以下几种：1）在膜表面键合一层亲水物质如纤维素、壳聚糖。可以利用聚砜膜的末端酚羟基与1,2-亚乙基二醇缩水甘油醚（EGDGE）反应产生末端环氧基，然后键和羟乙基纤维素形成一层亲水层，然后键和配基。键和亲水性基团后，膜的非特异性吸附很小，但孔径缩小，膜的渗透率下降2）引入亲水性基团，商振华等采用酰化-胺化和氯甲基化等途径对聚砜膜进行改性，在芳环上引入末端氨基。改性后膜孔隙率大，孔径分布均匀，有良好的通透性3）采用金属化试剂，如(butycithim)将聚砜膜改性成聚砜锂，用环氧化合物进行改性，可衍生出许多亲和膜，如金属亲和膜第六十五页，共一百零二页，2022年，8月28日亲和膜合成中活化试剂的选择：

基质与所键合物质上可反应基团的种类、耐受pH范围及形成键的稳定性，这直接决定了亲和介质的使用寿命所用试剂的毒性及价格，各种活化试剂各有利弊，有的活化时间短，有的毒性低，有的形成的键稳定，因此须根据实验室实际情况及实验目的进行选择

亲和膜的活化常用的活化方法：（a）环氧氯丙烷（b）1,1-羰基双咪唑（CDI）（c）过碘酸钠（d）三氯三嗪（e）戊二醛（f）双环氧试剂第六十六页，共一百零二页，2022年，8月28日吸附模型

一般情况下，配基与底物的结合可近似用langmuir吸附方程表示，由于亲和膜分离过程的复杂性，这种处理是很粗略的：

式中：qm－最大吸附量Kd－吸附平衡常数

C－进料浓度q－膜吸附量6.3.3亲和膜分离的理论模型第六十七页，共一百零二页，2022年，8月28日

对多克隆抗体，langmuir吸附方程式明显不能解释配基与目标产物之间的规律，因此有人提出三参数模型：式中：0≤a≤1，其余字母意义同上参数a值越接近1，说明物系的亲和力均匀性越好，这一模型的适用性为亲和吸附动力学及分离过程的研究提供了依据。亲和膜分离的理论模型第六十八页，共一百零二页，2022年，8月28日关于配基－底物结合的一般关系式目前还没有发现，langmuir模型目前只适用于少数物系，如亲和力均匀的单克隆抗体相同三参数模型只能一定程度上拟合多克隆抗体物系，原因在于多克隆抗体物系结合亲和力不均匀，其主要原因是由于抗体对某一特定抗原决定簇的异质性所致。亲和膜分离的理论模型第六十九页，共一百零二页，2022年，8月28日亲和膜过程传质模型由于亲和膜分离过程非常复杂，目前对亲和分离的处理部分仍是经验式的，真正基于物理－化学－生物特异性相互作用的理论和关系式还没有。最初提出的亲和模型是基于配基－蛋白间相互作用的吸附－解离平衡过程。最近Suen提出用对流、扩散和langmuir吸附理论对亲和膜分离过程作了数学分析，推导出了蛋白质和配基之间形成的络合物浓度与蛋白浓度及配基浓度之间的关系式，并指出通过亲和膜的流速不仅受压降的限制，而且受固载化配基和蛋白质之间解离动力学的限制，对于较厚的膜包，可使用较高的流速，并有较大的样品流量。第七十页，共一百零二页，2022年，8月28日此时流出峰的形状也较尖锐，Suen假设样品溶液是以层流方式沿轴向通过已固载化是配基的多孔膜层，蛋白质在膜是的吸附是等温吸附过程，料液浓度为Co，膜上配基浓度为Cl，蛋白与配基之间形成的络合物浓度为Cz(z,t)，假设：(1)溶质在径向的浓度梯度忽略不计(2)边界层上质量传递时间(BLMT)dp/kc远小于轴向对流时间L/V，BLMT系数kc由Athalye等的关系式确定：式中：Dp－膜孔径ε－膜孔隙度

kc－边界层质量传递系数亲和膜过程传质模型ReSc为Reyndds-Smidt数ReSc=Dpευ/D由上述方程：dp/kc<(dp)2/4D

对亲和膜：(dp)2/4D<<L/V第七十一页，共一百零二页，2022年，8月28日式中：ps表示蛋白－配基所形成的络合物，假设为单价吸附(3)蛋白与配基之间的结合式如下式所示亲和膜过程传质模型第七十二页，共一百零二页，2022年，8月28日(2)式表示是langmuir等温吸附中的可逆速率表达式，Suen和Etgd对膜截面是的质量平衡采用如下的连续方程表示：根据方程(2)，其二次速率表达式可写为亲和膜过程传质模型第七十三页，共一百零二页，2022年，8月28日

Suen根据边界条件和初始条件分别推导了包括轴向扩散在内的蛋白质吸附等温线方程和忽略轴向扩散的可逆吸附等温线方程，并对分离结果作了解释，指出对于亲和分离过程较合适的kc值范围为1.0*105－2.6*105/(MS)之间，典型的kd值范围在1.6*10-7－3.9*10-7M，这些数据反映出在可溶性蛋白和固载化配基之间固有的解离速率，它们不受质量传递的限制，膜越薄，轴向扩散的影响越显著，允许使用的流速越低，用薄膜堆积成厚膜可降低轴向扩散的影响，有利于提高操作流速，增加样品负荷，缩短分析时间。亲和膜过程传质模型第七十四页，共一百零二页，2022年，8月28日

6.3.4

亲和膜分离技术的影响因素亲和分离过程受制约的因素很多，操作条件的选择对分离结果有直接的影响：

1)吸附容量：主要取决于亲和介质上所结合的配位体浓度实际有效容量低于理论值

2)样品蛋白浓度：对有亲和力的系统，样品浓度的影响不明显，一般为了防止样品流失，都在很低的流速下上样

3)温度的影响：一般来说亲和作用随温度升高而降低，因此都在低温（4℃）下上样，再适当升高温度，在温和条件下洗脱，以便获得高的活力回收第七十五页，共一百零二页，2022年，8月28日4)洗脱液的选择：洗脱液的组成、pH值、离子强度等对分离结果和活力回收有大的影响，一般都选择对样品的构型与活力没有影响的缓冲液系统，必要时可加入适量有机改性剂，如乙二醇、甘氨酸、甲酰胺等，尽量避免使用强酸、强碱和蛋白变性剂如：盐酸胍、脲等。5)进料缓冲液离子强度：实验以氯化钠盐浓度调节离子强度，加入氯化钠有利于γ－免疫球蛋白的吸附，γ－免疫球蛋白是生物活性大分子，其同A蛋白的结合依赖于溶液环境，离子强度是进料缓冲液物理性质的重要因素，改变离子强度则影响免疫球蛋白分子周围对水化层及其电荷分布，从而影响γ－免疫球蛋白和A蛋白配基的结合。

亲和膜分离技术的影响因素第七十六页，共一百零二页，2022年，8月28日6)进料缓冲液溶液pH值：进料缓冲液溶液pH值直接影响免疫球蛋白分子的电荷状态，因此影响免疫球蛋白分子与A蛋白配基的结合。7)进料速率：进料速率增加，γ－免疫球蛋白回收率降低。但变化不大，γ－免疫球蛋白与A蛋白分子间特异性结合的速度较快。

8)操作压降：指膜入口与出口处两点间压强差，进料速率增大，膜操作压降升高，但与膜的最大耐压相比变化幅度不大亲和膜分离技术的影响因素第七十七页，共一百零二页，2022年，8月28日基质膜材料功能化试剂（方法）活化试剂配基分离物质聚砜表面覆盖亲水性纤维素层FMPA蛋白人血清中的γ－免疫球蛋白聚砜正叔丁基锂缩水甘油基氧代己醚亚氨基－乙酸Cu2+组氨酸溶液聚乙烯辐射接枝缩水甘油基异丁烯酸盐L－苯丙氨酸牛γ－球蛋白BGG聚砜氯甲基化－氨化重氮盐胰蛋白酶胰蛋白酶抑制剂尼龙膜亲水性表面环氧氯丙烷CibacronBlueF3-GA牛血清蛋白大孔纤维素膜环氧氯丙烷ActiveRedK2BP碱性磷酸酯酶聚醚氨基甲酸脂

1，6－己二异氰酸酯FMP或CDIA蛋白γ-免疫球蛋白

6.3.5

亲和膜分离技术的应用第七十八页，共一百零二页，2022年，8月28日1.血流，2.分离膜，3.聚氯乙烯膜，4.血液流出，5.血液入口，6.排气孔，7.壳体，8.密封，9.进样盖，

10.孔，11血液通道，12出样盖，13血液出口

切流膜结构示意图第七十九页，共一百零二页，2022年，8月28日贾凌云等人制备了proteinA切流膜色谱柱，并把该装置用于免疫吸附治疗，亲和膜做成径向形式，结构如图。当流速为130ml/min，人血浆通过TFAMC蛋白A的亲和膜，它对IgG的吸附容量可达400mg。Millipore公司已研制成功含A蛋白的纤维素膜分离器，可用作单克隆抗体等的纯化。结果表明，在一个膜体积为0.5ml的分离器上，将细胞培养上清液在低流速下负荷，15分钟可获得80mg提纯的单克隆抗体。以此推算，用一个14ml的亲和膜包，一天大约就可生产出8g纯的单抗，比同样体积的琼脂糖亲和色谱柱生产能力要高100倍以上。Amerace公司研制了一种以聚乙烯（PVA）和硅胶为基质的共混亲和膜，在直径为47mm的碟式膜上可结合20mg牛血清白蛋白（BSA）。把它制成25mm厚的膜分离器则可结合上670mgBSA。亲和膜分离技术的应用第八十页，共一百零二页，2022年，8月28日6.4分子印迹分离技术分子印迹的原理和方法分子印迹技术是将要分离的目标分子与交联剂在聚合物单体溶液中进行共聚制备得到颗粒介质，然后洗脱出去包埋在介质中的目标分子，便得到分子印迹聚合物（MIP）介质，此时的介质可以将目标分子的空间结构保持“印迹imprinting”或留下“记忆memory”。分子印迹聚合物的制备过程第八十一页，共一百零二页，2022年，8月28日早在19世纪40年代，诺贝尔奖获得者Pauling提出：抗体在形成时其三维结构会尽可能的同抗原形成多重作用点，抗原作为一种模板就会“铸造”在抗体的结合部位。1972年Wulff等人利用酶和抗体具有分子形状、空间结构选择性的特点，发展了用于色谱手性拆分的分子印迹聚合物（molecularlyimprintingpolymer,MIP）,又称模板聚合物或特制聚合物。1983年Mosbach进一步发展了这一技术，分子印迹技术通过模板分子（目标分子或印迹分子）的应用，使目标分子在聚合物中的特异识别位点或催化位点得以形成，但主要用于小分子物质如多肽或辅酶（如NAD）的分离纯化。1995年MariaKempe又将该技术用于蛋白质的分离纯化。分子识别第八十二页，共一百零二页，2022年，8月28日分子印迹技术的制备方法

共价印迹（covalentmolecularimprinting）非共价印迹（non-covalentmolecularimprinting）优点空间位置固定准确，因而能够移走大量的模板分子，这一点对于金属配基结合也一样分子印迹系统多种多样；印迹分子可以用很简单的方法除去，且作用温和缺点携带适当结合基团的化合物选择性低；经历共价键的形成和断裂，所需能量较高，并且，在水解过程中需要加入催化剂操作条件苛刻，因此可逆共价结合法的应用受到限制专一性不如共价结合作用强第八十三页，共一百零二页，2022年，8月28日常用单体和交联剂种类(Type)化合物(compound)共价型单体Covalentmonomer含乙烯基官能团的硼酸合二醇(Vinyl-functionalboronicacidanddiols)、键合有含硼酸官能团的硅烷混合物的硅胶颗粒(silanemixturesincludingboronatesilaneonsilicaparticale)、键合有氨基的硅烷凝胶颗粒(amino-functionalsilianesonsilicaparticles)非共价型单体Non-covalentmonomer丙烯酸(acrylicacid)、甲基丙烯酸(methacrylicacid)、甲基丙烯酸甲酯(Methylmethacrylate)、对乙烯苯甲酸(ρ-vinylbenzoicacid)、对乙基苯乙烯(ethylstyrene)、亚甲基丁二酸(ltaconicacid)、二丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸(2-acrylamido-2-methyl-1-propane-sulphonicacid)、1-乙烯基咪唑(1-vinylimidazole)、4-乙烯基吡啶(4-vinylpydine)、2-乙烯基吡啶(2-vinylpydine).

交联剂crosslinkerN,N’-亚甲基二丙烯酰胺(N,N’-methylenediacrylamide)、N,N’-1,4-亚苯基二丙烯酰胺(N,N’-phenylenediacrylamide)，3，5-二（丙烯酰胺）苯甲酸(3,5—bis(acryolamide)benzoicacid)、二甲基丙烯酸乙二醇酯(ethyleneglycoldimethacrylate)，二乙烯基苯(divinylbenzene)、N,O-二丙烯酰-L-苯丙氨醇(N,O-Bisacryoyl-L_phenylalaninol)、三丙烯酸季戊四醇酯(pentacrythritoltriacrylate)，三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯(Trimethylolpropanetrimethacrylate)，季戊四醇四甲基丙烯酸酯(pentacrythritoltetraacrylate)第八十四页，共一百零二页，2022年，8月28日分子印迹技术的应用用作特制的色谱分离介质

手性分离介质，亲和分离技术固相萃取用作抗体或受体摸拟物

人工抗体，免疫分析用作生物传感器的传感元件在合成和催化中的应用

产物分离和反应耦合，人工酶临床药物分析组合化学高通量筛选活性化合物第八十五页，共一百零二页，2022年，8月28日分离纯化中的应用被分离物Analytes1Ac-DL-Phe8Boc-DL-Phe-OH153-(3,4-dihydroxylphenyl)alanine22H-DL-Phe-NHEt2Ac-DL-The-L-Trp-Ome9Boc-DL-Pro-Osu16DL-Ala,DL-Ile,DL-Leu,DL-Phe23H-DL-Phe-NHPhe3Ac-DL-Trp10Boc-Phe,Boc-Trp,Boc-Tyr17DL-PheNHPh24H-DL-Pro-NHPhe4Ac-DL-Trp-Oet11Boc-Tyr-Ome18DL-Trp,DL-Tyr,DL-Val25H-DL-Trp-Pet5Ac-DL-Tyr12Cbz-DL-Ala-Ala-Ome19H-DL-Me2Phe-NHPhe26(±)α-methylhydrocinnamicacid6Boc-DL-Tyr-Ome13Dansyl-DL-Phe-OH20H-DL-ρ-NH2Phe-Oet27(±)α-methyphenylethylamine7Boc-DL-Phe-Gly-Oet14D-glycosidesofgalactose21H-DL-Phe-Gly-NHPhe28N-Ac_DL-The-L-Trp-Ome第八十六页，共一百零二页，2022年，8月28日分子印迹酶催化脂肪酶催化对映体拆分脂肪酶底物或产物类似物分子印迹初速度对映选择性E天然酶715.5天然酶分子印迹93022先分子印迹再包衣110077第八十七页，共一百零二页，2022年，8月28日MIPs应用于临床药物分析

分析对象

Analytes分析对象

Analytes扑热息痛Acetaminophen肾上腺素类药物Adrenergicdrug 雄-5-烯-3β,17β二醇Androst-5-ene-3β,17β-diol雄烯酮类Androstenone2-氨基吡啶2-aminopyridine巴比妥类化合物BarbituratesN,S-二(2,4-二硝基苯基)谷胱苷肽N,S-bis-(2,4-dintrophenyl)glutathione胆固醇Cholesterol氯霉素Chloromycetin