同型半胱氨酸和蛋氨酸合成酶a66g基因多态性与alzheimer病的关系课件

同型半胱氨酸和蛋氨酸合成酶还原酶A66G基因多态性与Alzheimer病的关系实习生：陈晶砺指导老师：陈盛强主任实习医院：广州医学院第二附属医院同型半胱氨酸和蛋氨酸合成酶还原酶A66G基因多态性与Alzh1目的探讨同型半胱氨酸(Ｈｃｙ)和蛋氨酸合成酶还原酶(MSR)A66G基因多态性与Alzheimer病的关系。目的探讨同型半胱氨酸(Ｈｃｙ)和蛋氨酸合成酶还原酶(MSR2研究背景Alzheimer病是老年性痴呆中较常见的一种,其病因未明确,是一种神经系统变性疾病,临床表现为进行性加重的智力障碍,病理特征为老年斑和神经纤维缠结。

研究背景Alzheimer病是老年性痴呆中较常见的一种,其病3蛋氨酸循环蛋氨酸循环4ＨＣＹ转硫作用再甲基化作用维生素Ｂ６Ｎ-５甲基四氢叶酸维生素Ｂ１２研究背景

ＨＣＹ转硫作用再甲基化作用维生素Ｂ６Ｎ-５甲基四氢叶酸维生素5研究背景血中同型半胱氨酸(Ｈｃｙ)浓度升高的原因有遗传和环境营养两种因素研究背景血中同型半胱氨酸(Ｈｃｙ)浓度升高的原因有遗传和环境6研究背景遗传因素：胱硫醚β-合成酶（ＣＢＣ）缺陷、５，１０-亚甲基四氢叶酸还原酶（ＭＴＨＦＲ）、蛋氨酸（甲硫氨酸）合成酶（ＭＳ）缺陷等；环境因素：维生素Ｂ６、Ｂ１２和叶酸摄入不足等。此外血浆ＨＣＹ还与血胆固醇水平、血压正相关，慢性肾衰、甲减也可导致ＨＣＹ升高。研究背景遗传因素：胱硫醚β-合成酶（ＣＢＣ）缺陷、５，１０-7研究对象ＡＤ组：ＡＤ病例共66例,其中男29例,女37例,诊断标准为ＤＳＭⅢＲ(美国精神病协会的精神障碍诊断和统计手册),年龄为60～93岁;对照组：143例对照者(既往无心脑血管病、糖尿病、慢性肝病、慢性阻塞性肺气肿、支气管哮喘等病史),其中男65例,女78例,年龄与患者相近。研究对象ＡＤ组：ＡＤ病例共66例,其中男29例,女37例,诊8研究对象以上研究对象全部来自广州市老人院,均为随机选择,无血缘关系。以上各组研究对象均排除高血压、心脏病、脑血管病、周围血管病、高血脂、糖尿病、吸烟、肾功能不全、药物因素等对血浆中总Ｈｃｙ水平的影响。两组间性别和年龄差异无显著意义。研究对象以上研究对象全部来自广州市老人院,均为随机选择,无血9研究方法运用多聚酶链反应限制性内切酶片段长度多态性技术(ＰＣＲ-ＲＦＬＰ)和荧光偏振法(ＦＰＩＡ)检测66例阿尔茨海默病及143例正常人ＭＳＡ2756Ｇ基因多态性和血浆总Ｈｃｙ水平。

研究方法运用多聚酶链反应限制性内切酶片段长度多态性技术(ＰＣ10研究方法病人标本血浆ＤＮＡ提取测ＨＣＹ测定血浆叶酸、VitB12浓度ＰＣＲ扩增数据分析统计研究方法病人标本血浆ＤＮＡ提取测ＨＣＹ测定血浆叶酸、VitB11试验结果经ＰＣＲ扩增后ＭＳＲ基因目的片段大小为１５１bp重复性实验：10份标本,每份重复5次PCR扩增,均产生同样结果试验结果经ＰＣＲ扩增后ＭＳＲ基因目的片段大小为１５１bp12试验结果MSR等位基因的指定：ＭＳR基因片段ＰＣＲ扩增产物长度分别为151ｂｐ。ＭＳRA66G突变的G等位基因ＰＣＲ扩增产物经NdeI消化后裂解成124和27ｂｐ两个片段.聚丙烯酰胺凝胶电泳显示MSR基因酶切产物存在两种等位基因(A,G)和三种基因型(AA:纯合野生型;AG:突变杂合型;GG:纯合突变型，各表型的酶切片断的大小为:AA151bp;AG151bp、124bp、27bp;GG124bp、27bp)试验结果MSR等位基因的指定：ＭＳR基因片段ＰＣＲ扩增产物13试验结果试验结果14试验结果由上电泳图可得：MSRA66G基因多态性泳道M为分子量标记,泳道1,2,5,6,7,8,9为MSRA66G突变杂合型;泳道3,4为MSRA66A纯合野生型;泳道10为MSRG66G纯合突变型。试验结果由上电泳图可得：MSRA66G基因多态性泳道M为分15试验结果⑴ＡＤ组与对照组MSRA66G基因型频率与等位基因频率的分布:

例数MSRA66G基因型频率(%)等位基因频率(%)

Ａ/ＡＡ/ＧＧ/ＧＡＧAD组6698.48(65)1.52(1)0.00(0)0.99240.0076对照组14398.60(141)1.40(2)0.00(0)0.99300.0070

由表可知,MSRA66G各种基因型频率在患者组与正常对照组之间的差异无显著性(Ｐ>005)。试验结果⑴ＡＤ组与对照组MSRA66G基因型频率与等位基因16

⑵ＡＤ组与对照组血浆总Ｈｃｙ,叶酸,VitB12水平比较：NHcy(µmol/L)叶酸(nmol/L)VitB12(pmol/L)ＡＤ组6614.72±6.215.56±5.51475.09±175.18对照组14310.9±2.4417.75±6.82433.53±157.47由表可知,ＡＤ患者血浆总Hcy水平显著高于正常组,两者差异有显著差异(Ｐ<0.05),

叶酸、VitB12水平两者差异无显著差异。⑵ＡＤ组与对照组血浆总Ｈｃｙ,叶酸,VitB12水平比较17

⑶ＡＤ组与对照组MSRA66G三种基因型携带者之间血浆同型半胱氨酸水平比较：

血浆同型半胱氨酸水平(µmol/L)A/AA/GG/G对照组(7.82±2.31)(7.99±2.41)(7.94±2.39)ＡＤ组(15.48±5.71)(14.40±6.11)(12.30±6.04)

由表可知,ＡＤ组与对照组三种基因型携带者组间血浆同型半胱氨酸水平比较无显著性差异(Ｐ>0.05)。⑶ＡＤ组与对照组MSRA66G三种基因型携带者之间血浆同18结论

ＭＳ多态性与ＡＤ无明显相关，高同型半胱氨酸血症与Alzheimer病发生有一定关系。

结论ＭＳ多态性与ＡＤ无明显相关，高同型半胱氨酸血症与19讨论蛋氨酸(甲硫氨酸)合成酶的主要生化功能是催化同型半胱氨酸复甲基为甲硫氨酸。在对MS活性的研究中发现，叶酸/钴胺素代谢失调的病人表现为MS还原系统活性的缺失，MS催化HCY复甲基为甲硫氨酸，其间存在一种具有还原甲基功能的酶，即蛋氨酸合成酶还原酶(MSR)，MSR为MS的还原活性状态酶，由于该酶为MS、钴胺素依赖酶以及叶酸依赖HCY的甲基化，所以认为MSR可能会影响NTDs的发生。讨论蛋氨酸(甲硫氨酸)合成酶的主要生化功能是催化同型半胱氨酸20讨论有研究发现高水平的同型半胱氨酸可使培养的海马神经元对β淀粉样蛋白的损害的敏感性提高[6]。国内外关于MSR基因A66G多态性与血栓性疾病的关系的报道较少。BrownCA等认为MSR基因A66G多态性与早发性冠心病有关[4]。RayJG等[6]研究了MSRA66G与女性静脉血栓栓塞的关系，发现病例组（32.6％）中GG型频率高于对照组（27.1％），但是无统计学意义。讨论有研究发现高水平的同型半胱氨酸可使培养的海马神经元对β淀21讨论NejatAkar等[7]研究了MSR基因A66G多态性与儿童卒中的关系，发现病例与对照之间G等位基因的分布无差别。我们探讨了MSR基因A66G多态性与AD的关系，发现AD组和对照组的MSR各基因型的分布及G等位基因的频率均无显著性差异。这提示本组病例中，MSR基因A66G多态性与AD的发病无相关性。讨论NejatAkar等[7]研究了MSR基因A66G多22讨论本文得到的ＡＤ组总Ｈｃｙ水平比正常组有明显升高的结果可能与同型半胱氨酸代谢中其他酶的突变有关.造成不同人群ＡＤ与ＭＳ有不同的关联的可能原因有很多讨论本文得到的ＡＤ组总Ｈｃｙ水平比正常组有明显升高的结果可能23例如:(1)ＡＤ是一种多基因遗传的疾病,除了ＭＳR基因以外,其它基因也可能与ＡＤ易感性有关,其他ＡＤ危险因子如ＡｐｏＥ基因等亦可能会影响ＭＳR基因多态性与ＡＤ的相关性;(2)ＡＤ病人选择上的差别;(3)由于各地饮食习惯、地理环境、人的生长状态等环境因子改变ＭＳR的作用效果而使不同地区的人群ＭＳ基因多态性与ＡＤ相关性存在着差异,这些都有待进一步研究。例如:24致谢本实验在陈盛强主任悉心指导下完成。非常感谢我的导师陈盛强主任在整个课题设计、实验以及论文撰写过程中对我的帮助。导师的严谨、求实、细致的工作作风、积极乐观的人生态度、谦虚、宽容的处世原则，将指引着我走向未来。在学习期间得到了神经研究所和检验科有关人员的大力协助,谨在此致以衷心的感谢！致谢本实验在陈盛强主任悉心指导下完成。非常感谢我的导师陈盛强25同型半胱氨酸和蛋氨酸合成酶还原酶A66G基因多态性与Alzheimer病的关系实习生：陈晶砺指导老师：陈盛强主任实习医院：广州医学院第二附属医院同型半胱氨酸和蛋氨酸合成酶还原酶A66G基因多态性与Alzh26目的探讨同型半胱氨酸(Ｈｃｙ)和蛋氨酸合成酶还原酶(MSR)A66G基因多态性与Alzheimer病的关系。目的探讨同型半胱氨酸(Ｈｃｙ)和蛋氨酸合成酶还原酶(MSR27研究背景Alzheimer病是老年性痴呆中较常见的一种,其病因未明确,是一种神经系统变性疾病,临床表现为进行性加重的智力障碍,病理特征为老年斑和神经纤维缠结。

研究背景Alzheimer病是老年性痴呆中较常见的一种,其病28蛋氨酸循环蛋氨酸循环29ＨＣＹ转硫作用再甲基化作用维生素Ｂ６Ｎ-５甲基四氢叶酸维生素Ｂ１２研究背景

ＨＣＹ转硫作用再甲基化作用维生素Ｂ６Ｎ-５甲基四氢叶酸维生素30研究背景血中同型半胱氨酸(Ｈｃｙ)浓度升高的原因有遗传和环境营养两种因素研究背景血中同型半胱氨酸(Ｈｃｙ)浓度升高的原因有遗传和环境31研究背景遗传因素：胱硫醚β-合成酶（ＣＢＣ）缺陷、５，１０-亚甲基四氢叶酸还原酶（ＭＴＨＦＲ）、蛋氨酸（甲硫氨酸）合成酶（ＭＳ）缺陷等；环境因素：维生素Ｂ６、Ｂ１２和叶酸摄入不足等。此外血浆ＨＣＹ还与血胆固醇水平、血压正相关，慢性肾衰、甲减也可导致ＨＣＹ升高。研究背景遗传因素：胱硫醚β-合成酶（ＣＢＣ）缺陷、５，１０-32研究对象ＡＤ组：ＡＤ病例共66例,其中男29例,女37例,诊断标准为ＤＳＭⅢＲ(美国精神病协会的精神障碍诊断和统计手册),年龄为60～93岁;对照组：143例对照者(既往无心脑血管病、糖尿病、慢性肝病、慢性阻塞性肺气肿、支气管哮喘等病史),其中男65例,女78例,年龄与患者相近。研究对象ＡＤ组：ＡＤ病例共66例,其中男29例,女37例,诊33研究对象以上研究对象全部来自广州市老人院,均为随机选择,无血缘关系。以上各组研究对象均排除高血压、心脏病、脑血管病、周围血管病、高血脂、糖尿病、吸烟、肾功能不全、药物因素等对血浆中总Ｈｃｙ水平的影响。两组间性别和年龄差异无显著意义。研究对象以上研究对象全部来自广州市老人院,均为随机选择,无血34研究方法运用多聚酶链反应限制性内切酶片段长度多态性技术(ＰＣＲ-ＲＦＬＰ)和荧光偏振法(ＦＰＩＡ)检测66例阿尔茨海默病及143例正常人ＭＳＡ2756Ｇ基因多态性和血浆总Ｈｃｙ水平。

研究方法运用多聚酶链反应限制性内切酶片段长度多态性技术(ＰＣ35研究方法病人标本血浆ＤＮＡ提取测ＨＣＹ测定血浆叶酸、VitB12浓度ＰＣＲ扩增数据分析统计研究方法病人标本血浆ＤＮＡ提取测ＨＣＹ测定血浆叶酸、VitB36试验结果经ＰＣＲ扩增后ＭＳＲ基因目的片段大小为１５１bp重复性实验：10份标本,每份重复5次PCR扩增,均产生同样结果试验结果经ＰＣＲ扩增后ＭＳＲ基因目的片段大小为１５１bp37试验结果MSR等位基因的指定：ＭＳR基因片段ＰＣＲ扩增产物长度分别为151ｂｐ。ＭＳRA66G突变的G等位基因ＰＣＲ扩增产物经NdeI消化后裂解成124和27ｂｐ两个片段.聚丙烯酰胺凝胶电泳显示MSR基因酶切产物存在两种等位基因(A,G)和三种基因型(AA:纯合野生型;AG:突变杂合型;GG:纯合突变型，各表型的酶切片断的大小为:AA151bp;AG151bp、124bp、27bp;GG124bp、27bp)试验结果MSR等位基因的指定：ＭＳR基因片段ＰＣＲ扩增产物38试验结果试验结果39试验结果由上电泳图可得：MSRA66G基因多态性泳道M为分子量标记,泳道1,2,5,6,7,8,9为MSRA66G突变杂合型;泳道3,4为MSRA66A纯合野生型;泳道10为MSRG66G纯合突变型。试验结果由上电泳图可得：MSRA66G基因多态性泳道M为分40试验结果⑴ＡＤ组与对照组MSRA66G基因型频率与等位基因频率的分布:

例数MSRA66G基因型频率(%)等位基因频率(%)

Ａ/ＡＡ/ＧＧ/ＧＡＧAD组6698.48(65)1.52(1)0.00(0)0.99240.0076对照组14398.60(141)1.40(2)0.00(0)0.99300.0070

由表可知,MSRA66G各种基因型频率在患者组与正常对照组之间的差异无显著性(Ｐ>005)。试验结果⑴ＡＤ组与对照组MSRA66G基因型频率与等位基因41

⑵ＡＤ组与对照组血浆总Ｈｃｙ,叶酸,VitB12水平比较：NHcy(µmol/L)叶酸(nmol/L)VitB12(pmol/L)ＡＤ组6614.72±6.215.56±5.51475.09±175.18对照组14310.9±2.4417.75±6.82433.53±157.47由表可知,ＡＤ患者血浆总Hcy水平显著高于正常组,两者差异有显著差异(Ｐ<0.05),

叶酸、VitB12水平两者差异无显著差异。⑵ＡＤ组与对照组血浆总Ｈｃｙ,叶酸,VitB12水平比较42

⑶ＡＤ组与对照组MSRA66G三种基因型携带者之间血浆同型半胱氨酸水平比较：

血浆同型半胱氨酸水平(µmol/L)A/AA/GG/G对照组(7.82±2.31)(7.99±2.41)(7.94±2.39)ＡＤ组(15.48±5.71)(14.40±6.11)(12.30±6.04)

由表可知,ＡＤ组与对照组三种基因型携带者组间血浆同型半胱氨酸水平比较无显著性差异(Ｐ>0.05)。⑶ＡＤ组与对照组MSRA66G三种基因型携带者之间血浆同43结论

ＭＳ多态性与ＡＤ无明显相关，高同型半胱氨酸血症与Alzheimer病发生有一定关系。

结论ＭＳ多态性与ＡＤ无明显相关，高同型半胱氨酸血症与44讨论蛋氨酸(甲硫氨酸)合成酶的主要生化功能是催化同型半胱氨酸复甲基为甲硫氨酸。在对MS活性的研究中发现，叶酸/钴胺素代谢失调的病人表现为MS还原系统活性的缺失，MS催化HCY复甲基为甲硫氨酸，其间存在一种具有还原甲基功能的酶，即蛋氨酸合成酶还原酶(MSR)，MSR为MS的还原活性状态酶，由于该酶为MS、钴胺素依赖酶以及叶酸依赖HCY的甲基化，所以认为MSR可能会影响NTDs的发生。讨论蛋氨酸(甲硫氨酸)合成酶的主要生化功能是催化同型半胱氨酸45讨论有研究发现高水平的同型半胱氨酸可使培养的海马神经元对β淀粉样蛋白的损害的敏感性提高[6]。国内外关于MSR基因A66G多态性与血栓性疾病的关系的报道较少。BrownCA等认为MS