DNA重组技术的基本工具一教学课件

§1-1DNA重组技术的基本工具南昌市第二中学付晓华

§1-1DNA重组技术的基本工具南昌市第二中学付晓华w1基因工程专题1基因工程专题12烟草

据WTO调查：2004年全世界因狂犬病致死人数约5.5万人中国卫生部通报：2004年７月，狂犬病列法定报告传染病死亡数之首。发病死亡率近100%

能产生狂犬病抗体蛋白的转基因

烟草据WTO调查：2004年全世界因狂犬病致死人数约5.53每100kg猪或牛的胰腺中仅可提取4~5g。

1979年，美国将人的胰岛素基因重组到大肠杆菌内，实现了细菌生产胰岛素，大大降低了生产成本。治疗糖尿病特效药——据WTO调查：

2005年全世界约有糖尿病患者1.8亿人，我国约6000万。胰岛素思考：转基因技术实现了一种生物的某些性状在另一种生物中表达。这些性状的表达与我们学过的基因的什么过程有关？密码子在生物界是的！DNA(基因)

mRNA蛋白质(性状)转录翻译通用

每100kg猪或牛的胰腺中仅可提取4~5g。1979年4定向基因改造设想

设想一能否让禾本科的植物也能够固定空气中的氮？能否让细菌“吐出”蚕丝？设想二能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰素等珍贵的药物？设想三

定向基因改造设想设想一能否让禾本科的植物也能够固定空气中的5基因工程的产物

基因工程的产物www.jx6什么叫基因工程？基因工程，又叫DNA重组技术。是指按照人们的愿望，在DNA分子水平上进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程的概念

什么叫基因工程？基因工程，又叫DNA重组技术7基因工程的概念基因工程的别名操作环境操作对象操作水平基本过程结果DNA重组技术生物体外基因DNA分子水平人类需要的新生物类型和产品剪切→拼接→导入→表达

基因工程的概念基因工程的别名操作环境操作对象操作水平基本过程8基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路早期基础理论达尔文提出生物进化论

基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路早期基础理论达尔9基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路早期基础理论孟德尔提出基因的分离定律和自由组合定律

基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路早期基础理论孟德10基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路早期基础理论

摩尔根证明基因在染色体上，并提出基因的连锁互换定律。

基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路早期基础理论11基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路后期基础理论

艾弗里证明DNA是遗传物质，DNA可从一种生物个体转移到另一种生物个体。

基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路后期基础理论12基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路后期基础理论

沃森、克里克提出DNA的双螺旋结构模型。

基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路后期基础理论13基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路后期基础理论梅塞尔松、斯塔尔证明DNA的半保留复制

基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路后期基础理论梅塞14基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路后期基础理论克里克等提出中心法则DNARNA蛋白质转录翻译逆转录复制

基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路后期基础理论克里15基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路后期基础理论

1963年尼伦伯格和马太破译编码氨基酸的遗传密码，1966年霍拉纳用实验加以证明。

基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路后期基础理论16基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路1)基因转移载体的发现2)工具酶的发现3)DNA合成和测序技术的发明4)DNA体外重组的实现5)重组DNA表达实验的成功6)第一例转基因动物问世7)PCR技术的发明

基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路1)基因转移载体17问题探讨：苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。

想一想需要做哪些关键工作？苏云金芽孢杆菌毒蛋白普通棉花抗虫棉

问题探讨：苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。18基因工程培育抗虫棉的简要过程：在以上过程中关键步骤或难点是什么？普通棉花(无抗虫特性)苏云金芽孢杆菌提取抗虫基因通过运载体导入转基因棉花含抗虫基因转基因棉花产生伴胞晶体转基因棉花有抗虫特性

基因工程培育抗虫棉的简要过程：在以上过程中关键步骤或难点是什19基因工程培育抗虫棉的关键步骤：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来关键步骤二：抗虫基因与棉花DNA“缝合”关键步骤三：抗虫基因进入棉花细胞

基因工程培育抗虫棉的关键步骤：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽20解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？“分子手术刀”——限制性核酸内切酶关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来关键步骤二：抗虫基因与棉花DNA“缝合”关键步骤三：抗虫基因进入棉花细胞“分子缝合针”——DNA连接酶“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体

解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？“分子手术刀”——限21第1节DNA重组技术的基本工具第1节DNA重组技术的基本工具22一、“分子手术刀”二、“分子缝合针”三、“分子运输车”Goon转基因

一、“分子手术刀”Goon转基因www.jxjyzy.c23思考：⒈自然界是否存在一种生物的DNA进入另一生物的情况？⒉动物容易让外来DNA侵入自身而得以遗传吗？为什么？植物呢？⒊单细胞生物，容易遭到入侵吗？⒋单细胞生物并没有在进化中灭绝，而是产生了一些特殊的酶来防范。这些酶应该有什么特点？可能酶能识别外来侵入的DNA并将其分解，而对自身的DNA不能起作用。“分子手术刀”——限制性核酸内切酶

思考：⒈自然界是否存在一种生物的DNA进入另一生物的情况？24一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”⒈主要来源：⒉种类与命名：⒊作用特点：⒋作用结果：原核生物阅读“分子的手术刀”1min

一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”⒈主要来源：原核生物阅25一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”⒈主要来源：⒉种类与命名：⒊作用特点：4.限制酶识别序列5.作用结果：识别特定核苷酸序列原核生物产生黏性末端或平末端Goon,切断磷酸二酯键具有特异性。一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组成

一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”⒈主要来源：识别特定核26⒉种类与命名：现在已经从约300种微生物中分离出了约4000种限制性内切酶(限制酶)。EcoRⅠSmaⅠ粘质沙雷氏杆菌（Serratiamarcesens）大肠杆菌（EscherichiacoliR）Goback练习：流感嗜血杆菌的d菌株(Haemophilusinfluenzaed)中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ

⒉种类与命名：现在已经从约300种微生物中分27

T磷酸二酯键1234512345

A

T磷酸二酯键1234512345Awww.jxjyz28Goback

Gowww.j29限制酶的识别序列：Goback

限制酶的识别序列：Go30SmaⅠ平末端平末端

SmaⅠ平末端平末端31

EcoRⅠ黏性末端黏性末端Goback

EcoRⅠ黏性末端黏性末端Gobackwww.32

EcoRⅠ黏性末端黏性末端Goback重复演示

EcoRⅠ黏性末端黏性末端Goback重复演示33限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线（如图），中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向、对称、重复排列的。想一想限制酶所识别的序列有什么特点？

限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱34寻根问底你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗？

原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。

寻根问底你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗？35要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？会产生相同的黏性(平)末端，然后让两者的黏性(平)末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。思考?

要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几36Goback……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……EcoRⅠ……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……不同来源的DNA片段混合将不同种来源的DNA片段连接起来生物A基因片段生物B基因片段……G

AATTC…………CTTAA

G…………G

AATTC…………CTTAA

G……酶切

Goback……GAATTC…………GAATTC……Ec37例1：科学家们经过多年的努力，创立了一种新兴生物技术——基因工程，实施该工程的最终目的是A.定向提取生物体的DNA分子B.定向地对DNA分子进行人工“剪切”C.在生物体外对DNA分子进行改造D.定向地改造生物的遗传性状D随堂反馈

例1：科学家们经过多年的努力，创立了D随堂反馈www.jxj38例2.下列有关基因工程中限制酶的描述，错误的是A.一种限制酶只能识别一种特定的脱氧苷酸序列B.限制酶的活性受温度的影响C.限制酶能识别和切割RNAD.限制酶可从原核生物中提取C

例2.下列有关基因工程中限制酶的描述，错误的是A.一种限制39例3：同一种限制酶切割成的黏性末端是A.①②B.①③C.①④D.②③A

例3：同一种限制酶切割成的黏性末端是A.①②40基因工程还需要哪些工具？一、“分子手术刀”二、“分子缝合针”三、“分子运输车”

基因工程还需要哪些工具？一、“分子手术刀”www.jxjyz41谢谢大家！

谢谢大家！42§1-1DNA重组技术的基本工具南昌市第二中学付晓华

§1-1DNA重组技术的基本工具南昌市第二中学付晓华w43第1节DNA重组技术的基本工具第1节DNA重组技术的基本工具44一、“分子手术刀”二、“分子缝合针”三、“分子运输车”Goon转基因

一、“分子手术刀”Goon转基因www.jxjyzy.c45一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”⒈主要来源：⒉种类与命名：⒊作用特点：⒋作用结果：复习

一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”⒈主要来源：复习www46二、“分子缝合针”——DNA连接酶①作用:把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来.②作用原理：催化磷酸二酯键形成

二、“分子缝合针”——DNA连接酶①作用:47可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，E·coliDNA连接酶或T4DNA连接酶即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键

可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，E·co48

T4DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低T4DNA连接酶

T4DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效49③类型：类型E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源功能大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)相同点差别（二）“分子缝合针”——DNA连接酶

③类型：类型E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源功能50DNA聚合酶DNA连接酶区别1区别2相同点寻根问底DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?1)只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键1)在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键2)以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成一条互补的DNA链2)将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板Goon

DNA聚合酶DNA连接酶相同点寻根问底DNA连接酶与DNA51模拟制作：用剪刀在特定部位对棉花DNA进行模拟切割，并将模拟毒蛋白基因取出，再用胶纸模拟基因种间连接。棉花的

一段DNA

含毒蛋白基因的细菌DNA片段Goback

模拟制作：用剪刀在特定部位对棉花DNA进行模拟切割，并52三、“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体⒈载体需要的条件：⑴有1~多个限制酶切点⑵对受体细胞无害⑶导入基因能在受体细胞中复制、表达⑷有某些标记基因，便于筛选⒉常用运载体：⑴细菌的质粒⑵噬菌体或某些动植物病毒⑶假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转录，转基因生物能有预想的效果吗？⑴作为分子运输车——载体，如果没有切割位点将会怎样？⑵霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分子运输车吗？

⑷目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？

三、“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体⒈载体需要的条53常用的载体：质粒能复制并带着插入的目的基因一起复制有切割位点有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别

常用的载体：质粒能复制并带着插入的目的基因一起复制有切割位点54Goon

Gowww.jxd5527483615Goback

27483615Go56思考与探究P71、为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。

思考与探究P71、为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？572、天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？提示：基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒（plasmid），即独立于细菌拟核染色体DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？不是，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：思考与探究P7

2、天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？提示581）载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。2）载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。3）载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。4）载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。5）载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。

1）载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基593、DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？

迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。思考与探究P7

3、DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？迄今为60已知标记基因有抗四环素基因和抗氨苄青霉素的基因，现探讨某细菌的质粒中有无标记基因或标记基因是什么？请设计实验、预期实验结果，并得出相应的实验结论。对照组：不添加抗生素实验组1：添加一定浓度的四环素实验组2：添加一定浓度的氨苄青霉素实验组3：添加一定浓度的四环素和氨苄青霉素随堂练习

已知标记基因有抗四环素基因和抗氨苄青霉素的基因，61对照组实验组1实验组2实验组3结论预期一＋＋＋＋预期二＋＋－－预期三＋－＋－预期四＋－－－对照组：不添加抗生素实验组1：添加一定浓度的四环素实验组2：添加一定浓度的氨苄青霉素实验组3：添加一定浓度的四环素和氨苄青霉素既含有抗四环素基因也含有抗氨苄青霉素基因只含有抗四环素基因只含有抗氨苄青霉素基因既不含有抗四环素基因也不含有抗氨苄青霉素基因

对照组实验组1实验组2实验组3结论预期一＋＋＋＋预期二＋＋62使用下列工具，如何进行操作？一、“分子手术刀”二、“分子缝合针”三、“分子运输车”

使用下列工具，如何进行操作？一、“分子手术刀”www.jxj63谢谢大家！

谢谢大家！64§1-1DNA重组技术的基本工具南昌市第二中学付晓华

§1-1DNA重组技术的基本工具南昌市第二中学付晓华w65基因工程专题1基因工程专题166烟草

据WTO调查：2004年全世界因狂犬病致死人数约5.5万人中国卫生部通报：2004年７月，狂犬病列法定报告传染病死亡数之首。发病死亡率近100%

能产生狂犬病抗体蛋白的转基因

烟草据WTO调查：2004年全世界因狂犬病致死人数约5.567每100kg猪或牛的胰腺中仅可提取4~5g。

1979年，美国将人的胰岛素基因重组到大肠杆菌内，实现了细菌生产胰岛素，大大降低了生产成本。治疗糖尿病特效药——据WTO调查：

2005年全世界约有糖尿病患者1.8亿人，我国约6000万。胰岛素思考：转基因技术实现了一种生物的某些性状在另一种生物中表达。这些性状的表达与我们学过的基因的什么过程有关？密码子在生物界是的！DNA(基因)

mRNA蛋白质(性状)转录翻译通用

每100kg猪或牛的胰腺中仅可提取4~5g。1979年68定向基因改造设想

设想一能否让禾本科的植物也能够固定空气中的氮？能否让细菌“吐出”蚕丝？设想二能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰素等珍贵的药物？设想三

定向基因改造设想设想一能否让禾本科的植物也能够固定空气中的69基因工程的产物

基因工程的产物www.jx70什么叫基因工程？基因工程，又叫DNA重组技术。是指按照人们的愿望，在DNA分子水平上进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程的概念

什么叫基因工程？基因工程，又叫DNA重组技术71基因工程的概念基因工程的别名操作环境操作对象操作水平基本过程结果DNA重组技术生物体外基因DNA分子水平人类需要的新生物类型和产品剪切→拼接→导入→表达

基因工程的概念基因工程的别名操作环境操作对象操作水平基本过程72基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路早期基础理论达尔文提出生物进化论

基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路早期基础理论达尔73基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路早期基础理论孟德尔提出基因的分离定律和自由组合定律

基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路早期基础理论孟德74基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路早期基础理论

摩尔根证明基因在染色体上，并提出基因的连锁互换定律。

基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路早期基础理论75基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路后期基础理论

艾弗里证明DNA是遗传物质，DNA可从一种生物个体转移到另一种生物个体。

基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路后期基础理论76基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路后期基础理论

沃森、克里克提出DNA的双螺旋结构模型。

基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路后期基础理论77基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路后期基础理论梅塞尔松、斯塔尔证明DNA的半保留复制

基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路后期基础理论梅塞78基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路后期基础理论克里克等提出中心法则DNARNA蛋白质转录翻译逆转录复制

基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路后期基础理论克里79基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路后期基础理论

1963年尼伦伯格和马太破译编码氨基酸的遗传密码，1966年霍拉纳用实验加以证明。

基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路后期基础理论80基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路1)基因转移载体的发现2)工具酶的发现3)DNA合成和测序技术的发明4)DNA体外重组的实现5)重组DNA表达实验的成功6)第一例转基因动物问世7)PCR技术的发明

基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路1)基因转移载体81问题探讨：苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。

想一想需要做哪些关键工作？苏云金芽孢杆菌毒蛋白普通棉花抗虫棉

问题探讨：苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。82基因工程培育抗虫棉的简要过程：在以上过程中关键步骤或难点是什么？普通棉花(无抗虫特性)苏云金芽孢杆菌提取抗虫基因通过运载体导入转基因棉花含抗虫基因转基因棉花产生伴胞晶体转基因棉花有抗虫特性

基因工程培育抗虫棉的简要过程：在以上过程中关键步骤或难点是什83基因工程培育抗虫棉的关键步骤：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来关键步骤二：抗虫基因与棉花DNA“缝合”关键步骤三：抗虫基因进入棉花细胞

基因工程培育抗虫棉的关键步骤：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽84解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？“分子手术刀”——限制性核酸内切酶关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来关键步骤二：抗虫基因与棉花DNA“缝合”关键步骤三：抗虫基因进入棉花细胞“分子缝合针”——DNA连接酶“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体

解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？“分子手术刀”——限85第1节DNA重组技术的基本工具第1节DNA重组技术的基本工具86一、“分子手术刀”二、“分子缝合针”三、“分子运输车”Goon转基因

一、“分子手术刀”Goon转基因www.jxjyzy.c87思考：⒈自然界是否存在一种生物的DNA进入另一生物的情况？⒉动物容易让外来DNA侵入自身而得以遗传吗？为什么？植物呢？⒊单细胞生物，容易遭到入侵吗？⒋单细胞生物并没有在进化中灭绝，而是产生了一些特殊的酶来防范。这些酶应该有什么特点？可能酶能识别外来侵入的DNA并将其分解，而对自身的DNA不能起作用。“分子手术刀”——限制性核酸内切酶

思考：⒈自然界是否存在一种生物的DNA进入另一生物的情况？88一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”⒈主要来源：⒉种类与命名：⒊作用特点：⒋作用结果：原核生物阅读“分子的手术刀”1min

一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”⒈主要来源：原核生物阅89一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”⒈主要来源：⒉种类与命名：⒊作用特点：4.限制酶识别序列5.作用结果：识别特定核苷酸序列原核生物产生黏性末端或平末端Goon,切断磷酸二酯键具有特异性。一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组成

一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”⒈主要来源：识别特定核90⒉种类与命名：现在已经从约300种微生物中分离出了约4000种限制性内切酶(限制酶)。EcoRⅠSmaⅠ粘质沙雷氏杆菌（Serratiamarcesens）大肠杆菌（EscherichiacoliR）Goback练习：流感嗜血杆菌的d菌株(Haemophilusinfluenzaed)中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ

⒉种类与命名：现在已经从约300种微生物中分91

T磷酸二酯键1234512345

A

T磷酸二酯键1234512345Awww.jxjyz92Goback

Gowww.j93限制酶的识别序列：Goback

限制酶的识别序列：Go94SmaⅠ平末端平末端

SmaⅠ平末端平末端95

EcoRⅠ黏性末端黏性末端Goback

EcoRⅠ黏性末端黏性末端Gobackwww.96

EcoRⅠ黏性末端黏性末端Goback重复演示

EcoRⅠ黏性末端黏性末端Goback重复演示97限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线（如图），中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向、对称、重复排列的。想一想限制酶所识别的序列有什么特点？

限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱98寻根问底你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗？

原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。

寻根问底你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗？99要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？会产生相同的黏性(平)末端，然后让两者的黏性(平)末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。思考?

要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几100Goback……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……EcoRⅠ……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……不同来源的DNA片段混合将不同种来源的DNA片段连接起来生物A基因片段生物B基因片段……G

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G…………G

AATTC…………CTTAA

G……酶切

Goback……GAATTC…………GAATTC……Ec101例1：科学家们经过多年的努力，创立了一种新兴生物技术——基因工程，实施该工程的最终目的是A.定向提取生物体的DNA分子B.定向地对DNA分子进行人工“剪切”C.在生物体外对DNA分子进行改造D.定向地改造生物的遗传性状D随堂反馈

例1：科学家们经过多年的努力，创立了D随堂反馈www.jxj102例2.下列有关基因工程中限制酶的描述，错误的是A.一种限制酶只能识别一种特定的脱氧苷酸序列B.限制酶的活性受温度的影响C.限制酶能识别和切割RNAD.限制酶可从原核生物中提取C

例2.下列有关基因工程中限制酶的描述，错误的是A.一种限制103例3：同一种限制酶切割成的黏性末端是A.①②B.①③C.①④D.②③A

例3：同一种限制酶切割成的黏性末端是A.①②104基因工程还需要哪些工具？一、“分子手术刀”二、“分子缝合针”三、“分子运输车”

基因工程还需要哪些工具？一、“分子手术刀”www.jxjyz105谢谢大家！

谢谢大家！106§1-1DNA重组技术的基本工具南昌市第二中学付晓华

§1-1DNA重组技术的基本工具南昌市第二中学付晓华w107第1节DNA重组技术的基本工具第1节DNA重组技术的基本工具108一、“分子手术刀”二、“分子缝合针”三、“分子运输车”Goon转基因

一、“分子手术刀”Goon转基因www.jxjyzy.c109一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”⒈主要来源：⒉种类与命名：⒊作用特点：⒋作用结果：复习

一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”⒈主要来源：复习www110二、“分子缝合针”——DNA连接酶①作用:把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来.②作用原理：催化磷酸二酯键形成

二、“分子缝合针”——DNA连接酶①作用:111可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，E·coliDNA连接酶或T4DNA连接酶即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键

可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，E·co112

T4DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低T4DNA连接酶

T4DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效113③类型：类型E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源功能大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)相同点差别（二）“分子缝合针”——DNA连接酶

③类型：类型E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源功能114DNA聚合酶DNA连接酶区别1区别2相同点寻根问底DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?1)只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键1)在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键2)以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成一条互补的DNA链2)将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板Goon

DNA聚合酶DNA连接酶相同点寻根问底DNA连接酶与DNA115模拟制作：用剪刀在特定部位对棉花DNA进行模拟切割，并将模拟毒蛋白基因取出，再用胶纸模拟基因种间连接。棉花的

一段DNA

含毒蛋白基因的细菌DNA片段Goback

模拟制作：用剪刀在特定部位对棉花DNA进行模拟切割，并116三、“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体⒈载体需要的条件：⑴有1~多个限制酶切点⑵对受体细胞无害⑶导入基因能在受体细胞中复制、表达⑷有某些标记基因，便于筛选⒉常用运载体：⑴细菌的质粒⑵噬菌体或某些动植物病毒⑶假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转录，转基因生物能有预想的效果吗？⑴作为分子运输车——载体，如果没有切割位点将会怎样？⑵霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分子运输车吗？

⑷目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？

三、“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体⒈载体需要的条117常用的载体：质粒能复制并带着插入