典型发酵过程动力学课件

第六章典型发酵过程动力学发酵反应动力学主要是研究各种环境因素与微生物代谢活动的之间的相互作用随时间而变化的规律。其主要研究方法是用数学的模型定量地描述生物反应过程中影响细胞生长、基质利用和产物生成的各种因素。有关的研究可为生物反应过程的控制、小型试验数据的放大和提高反应过程的产物得率等提供理论依据。

1发酵过程分类按照培养的方式分三种类型：分批培养补料分批培养连续培养2第一节分批培养 分批培养又称分批发酵，是指在一个密闭系统内投入有限数量的营养物质后，接入少量的微生物菌种进行培养，使微生物生长繁殖，在特定的条件下只完成一个生长周期的微生物培养方式。分批培养是一种非稳态的培养方法。3一、微生物生长动力学微生物生长动力学就是要定量描述细胞反应过程中细胞生长或产物形成与基质消耗随时间的变化关系。建立细胞生长和产物形成的数学模型。但由于细胞生长过程极其复杂，难以精确描述，所以需要合理简化，在简化的基础上建立物理模型，据此推出数学模型。5简化模型的内容细胞反应动力学研究细胞群体的动力学规律，而不是细胞个体确定论模型：不考虑个体差异，取其性质的平均值；概率论模型：考虑每个细胞间的差异非结构模型：忽略细胞的组成成分变化；结构模型：考虑细胞的组成成分变化均衡生长：各种成分成比例增长；非均衡生长：由于各种成分合成速率不同，各成分增加比例也不同均一化模型：细胞与周围液相视为一相（不考虑物质传递的影响）；分离化模型：细胞与周围的液相不能视为一相，而是从培养液分离出来的部分（考虑细胞与周围液相的物质传递）6细胞反应的得率系数对底物的细胞得率：对氧的细胞得率：7对底物的产物得率：对碳的细胞得率：8比反应速率：单位质量的细胞在单位时间生成或消耗某一成分的量细胞的比生长速率：产物的比生成速率：基质的比消耗速率：比耗氧速率：102）对数生长期

处于对数生长期的微生物细胞的生长速度大大加快，单位时间内一定量细胞的数目或重量的增加维持恒定，并达到最大。此阶段生长比速为常数。为缩短适应期，常采用对数期的培养物做接种物。

123）减速期

由于微生物的大量生长，培养基中基质的浓度下降、有害物质积累而导致比生长速率下降。在减速期内，微生物生长符合一级方程，只是μ是变化的

4）静止期

当细胞停止分裂，或细胞生长与死亡的速率达到平衡时便出现稳定期。在微生物生长的稳定期，细胞的重量基本维持稳定，但活细胞的数量下降。

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5）死亡期

培养基中营养耗尽，代谢产物大量积累，细胞繁殖趋于停止，而死亡细胞越来越多，即活细胞数量显著下降。Kd为比死亡速率常数154.无抑制、单一限制性底物的细胞生长动力学

Monod提出了在特定温度、pH值、营养物类型、营养浓度等条件下，微生物细胞的比生长速度与限制性营养物质的浓度之间存在如下的关系式：

μm-----------最大的比生长速度

ρS------------限制性营养物的浓度

Ks-----------饱和常数，数值上等于μ=μm/2时的限制性营养物质浓度，它的大小表示了微生物对营养物质的吸收的亲和力。Ks越大，表示微生物对营养物质的亲和力越小，反之越大，对于许多微生物来说，一般为0.1~120mg/L或0.01~3.0mmol/L，这表示微生物对营养物质有较高的吸收亲和力。

16当限制性营养物质的浓度ρS很低的时候（ρS<<Ks)，μ和ρS是线性关系，μ=(μm/Ks)ρS随着营养物质的浓度增加，比生长速度也相应的增加，μ与ρS不成直线关系，当ρS>>Ks时μ≈μmMonod方程与酶催化反应的米氏方程形式上是一样的，因为微生物的生长可看作酶反应的粗略代表。但所不同的是，米氏方程是应用酶反应理论推导得到的，而Monod方程却是完全经验得到的。将Monod方程两边取倒数可改写成下列形式1/μ=1/μm+Ks/μm(1/ρS)以1/μ为纵坐标，1/ρS为横坐标，作图可得一直线。斜率为Ks/μm，截距1/μm

17例：采用合成培养基，在1m3生物反应器中进行大肠杆菌分批培养，菌体的生长变化可利用Monod方程描述，已知μm=0.935h-1，Ks=0.71kg/m3，基质初始浓度为50kg/m3，菌体初始浓度ρX0=0.1kg/m3，YX/S=0.6kg/kg(以细胞/基质计)，求当80%的基质已反应时所需的时间。182021一般来说，多种限制性基质的情况不适合用非结构模型来解释，只有当参数数目足够多时才能用非结构模型描述。（1）多种必要基质限制：相关模型：非相关模型：（2）生长促进剂：某些物质并非细胞生长所必要但能加大细胞生长速度，这类物质称为生长促进剂。236.有抑制剂的细胞生长动力学(1)基质抑制p116与酶的抑制动力学类似，也分为竞争、非竞争、反竞争抑制。(2)产物抑制在微生物代谢过程中，一些代谢产物对微生物的生长具有抑制作用，一般分为竞争抑制和非竞争性抑制，动力学规律也类同与酶抑制动力学在酵母进行酒精发酵时，产物酒精对酵母的生长就是非竞争性抑制。24产物形成动力学模式产物的形成与微生物细胞生长关系的动力学模式有三种。1）偶联型也叫产物形成与细胞生长关联模式(相关模型），产物的形成和菌体生长是平行的。在该模式中，产物形成速度与生长速度的关系可表示为：dρP/dt=α(dρX/dt)=αμρXρP---------产物浓度（g/L）α-------产物相对于细胞的生成速度（g产物/g细胞），即：YP/X在上式表示，在微生物的分批培养过程中，产物的形成速度与细胞的比生成速度成正比。因此，对于符合该模式的培养过程来说，要提高产物的形成速度就应当争取获得高的细胞的比生长速度。如葡萄糖厌氧发酵生成乙醇，发酵生产葡萄糖酸、乳酸等。262）非偶联型产物形成与细胞生长无关模式。在该模式中，产物形成速度与生长速度无关联，而只与细胞浓度有关，此时，细胞具有控制产物形成速度的组成酶系统，这时产物形成与细胞浓度的关系可表示为：dρP/dt=βρXβ----------非生长关联的产物形成常数(g产物/g细胞.h)在生长和产物无关联的模式中，产物合成发生在生长停止之后（即产生次级代谢产物）。大多数抗生素和微生物毒素都是非生长偶联产物。对于这类非生长偶联型产物的生物反应来说，应充分注意菌体在生长期和产物形成期营养的差别。可适当调配快速利用和缓慢利用的营养物的比例，分别满足不同时期菌体的不同需要。273）混合型产物形成与细胞生长有关联和无关联的复合模式，也叫产物形成与细胞生长部分关联模式。这时产物的形成与细胞生长的关系可表达为：dρP/dt=αμρX+βρX这种动力学模式存在生长和非生长关联项，如柠檬酸、氨基酸的发酵生产过程。实际上，此模式对任意的动力学都是通用的，偶联和非偶联动力学模式只是两种极端形式。28细胞反应动力学模型的建立方法：

一、数字拟合法

根据小型试验、中型试验或生产装置上实测的数据，利用现代辨识技术，找出个参量之间的函数关系而建立数学模型的方法。

二、机制分析法

机制模型也称为理论模型，它是从工艺过程中的某些物理、化学和生物的本质出发，运用现代工程学的基本理论，建立描述过程的数学表达式。

建立机制模型首先要对过程的内在机制有比较深刻的了解，另外要有全满可靠的基础数据30第三节补料分批发酵过程动力学补料分批发酵也称为流加发酵，是在微生物分批培养过程中，向生物反应器中间歇或连续补加供给一种或多种特定的限制性底物，直到反应结束后才一次性排出全部培养液的一种操作方式。在培养的不同时间不断补加一定的养料，可以延长微生物的指数生长期和静止期的持续时间，增加生物量的积累和静止期细胞代谢产物的积累。31一、补料分批发酵的特点及其适用条件（1）相对于分批发酵：补料分批发酵解除底物、产物的抑制和葡萄糖的阻遏效应；避免好氧发酵时微生物大量繁殖而好样过多，致使通风设备不能匹配；某些情况下适当控制微生物生成量，有利于提高产物的转化率（2）与连续培养相比：补料分批发酵不需严格的无菌条件，不会产生菌体老化、变异、污染等问题；最终产物浓度高，易于分离；应用广泛缺点：反馈控制附属设备昂贵；如没有反馈控制则不能保证微生物生长与预期一致；对操作技能要求高32补料分批培养过程主要适用于代谢产物得率或生成速率受底物的影响、细胞的生长状态或培养环境需要调节的过程，一般在一下情况适宜补料分批发酵：①细胞的高密度培养②所用底物在高浓度下对菌体生长有抑制作用：乙醇、甲醇、乙酸、芳香族化合物③存在crabtree效应的培养系统：糖浓度过高时，在氧充足的条件下发生糖的无氧氧化④营养缺陷菌株的培养⑤受异化代谢阻遏的系统⑥高黏度的培养系统33二、补料分批发酵的动力学模型1.底物消耗动力学模型根据物料衡算：在∆t时间内，发酵罐中底物增加量＝流入的底物量－反应的底物量式中为发酵罐中初始底物浓度，VR为发酵液初始体积为发酵罐中反应∆t时间后底物浓度为流加液中底物浓度，F流加速度rS为底物反应消耗的速度34当∆t→0时，ρ́→ρ且若底物仅用于维持代谢和细胞生长，则若底物用于维持代谢和细胞生长，同时也用于产物生成，则D为稀释率，即D＝F/VR35式中为发酵罐中初始菌体浓度，VR为发酵液初始体积为发酵罐中反应∆t时间后菌体浓度rX为细胞生长的速度2.细胞生长动力学模型根据细胞衡算：在∆t时间内，发酵罐中细胞增加量＝反应生成的细胞量36当∆t→0时，ρ́→ρ且同理，对于产物生成速率为：37恒速流加操作上述两式μ和D都是随时间变化的变量，消除μ，则条件：底物仅用于菌体生长F恒定要求：计算菌体、基质浓度随时间的变化关系38积分得、分别为发酵液初始的菌体浓度、底物浓度为补料中的底物浓度在拟稳态条件下，恒速流加特点：操作简单、能用于调控细胞的生长速率和状态39第四节连续培养及其动力学连续培养的概念连续培养又称连续发酵，是指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养液，同时以相同的流速流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定，使培养物在近似恒定下生长的培养方法。与密闭系统的分批培养相反，连续培养是在开放系统中进行的。它的最大特点是，微生物细胞的生长速度和代谢活性处于恒定状态，达到稳定高速培养微生物或产生大量代谢产物的目的。40连续培养优缺点优点：1）提供了一个微生物在恒定状态下高速生长的环境，便于进行微生物的代谢、生理、生化和遗传特性的研究；2）在工业上可减少分批培养中每次清洗、装料、灭菌、接种、放罐等的操作时间，提高生产效率。3）产物质量比较稳定；4）所需设备和投资较少，便于实现自动化。缺点：1）在长时间的培养过程中，微生物菌种容易发生变异，发酵过程易染菌；2）新加入的培养基与原有的培养基不易完全混合，影响培养和营养物质的利用。41连续培养的类型1.均匀混合的生物反应器（全混式，CSTR）即连续搅拌反应器，又分为恒化器（chemostat）和恒浊器（turtitostat）两种，前者是使培养液中限制性营养物质保持恒定，后者是使培养液中的细胞浓度维持恒定。恒化器主要由能维持恒定的发酵液体积的培养容器、新鲜培养基供给装置（一般采用定量泵控制培养基的供给速度）和无菌的培养基储槽等部分组成。新鲜的培养基由泵输送到具有匀化装置的培养容器中，同时又从培养容器中抽出同量的培养液，以使培养液的体积在容器内维持恒定。恒浊器中发酵液的细胞浓度靠监测培养物的光密度装置维持恒定。这种设备很少被使用，原因是测定罐内细胞浓度很困难。2.活塞流反应器42单罐连续发酵的动力学单罐连续发酵的前提和假定1）在稳定状态下单罐连续发酵的物料平衡，各参数变化等于零。2）假定培养基中每一点浓度都没有差别，称为完全均匀混合或匀态。匀态是连续发酵动态的一个重要假定，即指连续发酵过程中菌体、基质、氧等在培养基中均是混合均匀。3）假定微生物完全没有死亡（死亡比速为0）43单罐恒流速连续发酵反应动力学1.稀释速率D与菌体比生长速率μ的关系（稳态的条件）对微生物细胞作物料平衡积累=流入-流出+生长-死亡44ρX0,ρX---------分别为流入和流出发酵罐的细胞浓度（g/L）F-------------培养基流速（L/h）V-------------罐内液体体积（L）对于普通单级恒化器（恒流器）而言，料液为新鲜培养基，ρX0=0;α=0则：dρX/dt=(μ-F/V)ρX令dρX/dt=0则有：μ=F/V在连续培养技术中，F/V被称为稀释率（dilutionrate）用符号“D”表示。μ=D45均匀混合连续发酵稳定状态的前提是D=μ，即稀释率D等于比生长速率μ。稀释率D的单位同生长比速的单位一样，即为h-1，其含义为单位时间内新进入的培养基体积（F）占罐内培养液总体积（V）的分数。D的倒数（1/D）用t表示，则是培养基在罐内的平均停留时间。讨论：1）若D<μ，则dρX/dt>0，培养液中微生物细胞的浓度随时间而增加。2）若D>μ，则dρX/dt<0，即细胞浓度因培养物被“洗出”（washout）发酵罐外而减少。3）若D=μ，dρX/dt=0，细胞浓度不随时间而变化。462.稀释率D对菌体浓度X和基质浓度S的影响基质的物料平衡：积累=流入-流出-生长消耗-维持消耗-产物消耗47同生长相比，细胞对限制性基质的维持需求往往是很低的，而且产物形成的需求也可忽略。故在稳定状态时（dρS/dt=0），上式可简化为：

将D=μ代入得：即：48临界稀释速率，代表恒化器所能运行的最大稀释速率。通常，故：D=μ代入到Monod方程中得：493.菌体的生产强度：单位体积的发酵液在单位时间内的产生的菌体量由得：50整理得：当时，PX最大即：5152部分菌体再循环的单级恒化器53R为循环浓缩因子为循环比，为浓缩因子（浓缩比）菌体衡算：积累的细胞＝（进入－流出）的细胞＋生长细胞＋循环流回细胞x0＝0，稳态操作且反应液体积不变则有：得54底物衡算：积累的底物＝（进入－流出）的底物－消耗的底物＋循环流回底物得55由Monod方程：当时，取得边界值，即56主要结论由于0<R<1，所以可以允许菌体也不会被洗出2.部分菌体再循环单级恒化器可以维持较高的细胞浓度从而提高生产效率3.稳定性高4.由可知，要达到一定的值，浓缩比越高，循环比越小；当时，与