实验4叶绿素的提取、理化性质和含量测定

实验中的注意事项：1、实验的取材2、操作及观察3、实验数据的处理4、实验结果的分析：分清错误和误差5、思考题6、实验报告实验4叶绿素的提取、理化性质和含量测定共28页，您现在浏览的是第1页!实验四叶绿素的提取、理化性质和含量测定（p130－136）一、叶绿素的提取二、叶绿素的理化性质三、叶绿素含量的测定实验4叶绿素的提取、理化性质和含量测定共28页，您现在浏览的是第2页!1.实验目的1）掌握叶绿素的提取及其含量测定的方法2）了解叶绿素的理化性质实验4叶绿素的提取、理化性质和含量测定共28页，您现在浏览的是第3页!2.1用含水的有机溶剂提取叶绿素亲水的卟啉环的“头部”:镁原子居于卟啉环的中央，带正电性，与其相联的氮原子则偏向于带负电性，因而卟啉具有极性，是亲水的，可以与蛋白质结合。亲脂的叶绿醇的“尾巴”:叶醇是由四个异戊二烯单位组成的双萜，是一个亲脂的脂肪链，它决定了叶绿素的脂溶性。实验4叶绿素的提取、理化性质和含量测定共28页，您现在浏览的是第4页!2.2.1叶绿素的吸收光谱实验4叶绿素的提取、理化性质和含量测定共28页，您现在浏览的是第5页!分子吸收的光能有一部分消耗于分子内部的振动上，发射的荧光的波长总是比被吸收光的波长要长叶绿素吸收红光后处于单线态，叶绿素分子要从单线态返回基态所发射的光称为荧光。实验4叶绿素的提取、理化性质和含量测定共28页，您现在浏览的是第6页!2.3叶绿素的化学性质2.3.1叶绿素的结构2.3.2取代反应2.3.3皂化反应实验4叶绿素的提取、理化性质和含量测定共28页，您现在浏览的是第7页!2.3.2取代反应2.3.2.1稀酸去镁铜代2.3.2.2浓酸去镁水解卟啉环中的Mg处于不稳定的状态，可被H+、Cu2+、Zn2+等离子取代。实验4叶绿素的提取、理化性质和含量测定共28页，您现在浏览的是第8页!叶绿素→去镁叶绿素→铜代叶绿素（稳定而不易降解，常用醋酸铜处理来保存绿色植物标本）实验4叶绿素的提取、理化性质和含量测定共28页，您现在浏览的是第9页!皂化分层叶绿素的盐形成以后，因分子极性增大，易溶于稀酒精溶液中，不能进入苯层；而类胡萝卜素在苯中的溶解度大于在醇溶液中一部分苯分散在水中形成乳胶体，出现一层乳白色的溶液低温下发生皂化反应的叶绿体色素溶液，易乳化而出现白色絮状物，溶液浑浊，且不分层。实验4叶绿素的提取、理化性质和含量测定共28页，您现在浏览的是第10页!4实验步骤4.1叶绿素的提取4.2叶绿素的物理性质透射光颜色反射光颜色4.3叶绿素含量的测定4.4叶绿素的化学性质取代反应皂化反应实验4叶绿素的提取、理化性质和含量测定共28页，您现在浏览的是第11页!4.2叶绿素的荧光取3ml叶绿素提取原液，观察其透射光、反射光下的颜色；实验4叶绿素的提取、理化性质和含量测定共28页，您现在浏览的是第12页!4.4叶绿素的化学性质4.4.1取代反应4.4.1.1稀酸：取3ml叶绿素原液，一滴滴加入醋酸(先快后慢)，观察并记录颜色变化；向上述加醋酸后发生颜色变化的溶液中加少量CuAc颗粒，65℃水浴加热，观察并记录其颜色变化。4.4.1.2浓酸取3ml叶绿素溶液，一滴滴缓慢加入浓盐酸，观察并记录颜色变化。4.4.2皂化反应取3ml叶绿素提取原液，加1ml20%NaOH-甲醇溶液，摇匀，65℃水浴5min；取出冷却后，先加3ml苯，后加3ml水（沿壁慢慢加入），轻轻摇匀，静置观察其分层现象。实验4叶绿素的提取、理化性质和含量测定共28页，您现在浏览的是第13页!5.2叶绿素含量计算与分析叶绿素浓度:C＝OD652/34.5(mg/ml)叶绿素的含量（mg/g）=[叶绿素的浓度×提取液体积×稀释倍数]/样品鲜重以样品重为3g为例:=C×（25×50/5）/3=OD652/（34.5×3）×（25×50/5）实验4叶绿素的提取、理化性质和含量测定共28页，您现在浏览的是第14页!7思考题1提取叶绿素时为何要加入MgCO3？2为何选用652nm测叶绿素的含量？3解释皂化反应的分层现象实验4叶绿素的提取、理化性质和含量测定共28页，您现在浏览的是第15页!2.实验原理2.1用含水的有机溶剂提取叶绿素2.2叶绿素的物理性质吸收光谱荧光现象2.3叶绿素的化学性质取代反应皂化反应实验4叶绿素的提取、理化性质和含量测定共28页，您现在浏览的是第16页!2.2叶绿素的物理性质2.2.1吸收光谱2.2.2荧光现象2.2.3含量测定实验4叶绿素的提取、理化性质和含量测定共28页，您现在浏览的是第17页!2.2.2荧光现象透射光下反射光下叶绿体吸收光后，激发了捕光色素蛋白复合体（LHC），LHC将其能量传递到PSII或PSI。其间所吸收的光能有所损失，大约3%-9%的所吸收的光能被重新发射出来，其波长较长,也即叶绿素荧光。叶绿素溶液在透射光下呈绿色，在反射光下呈红色的现象。实验4叶绿素的提取、理化性质和含量测定共28页，您现在浏览的是第18页!2.2.3含量测定叶绿素a、b在红光区的最大吸收峰分别位于663nm和645nm；叶绿素a、b在652nm处有相同的比吸收系数（34.5），测OD652求出叶绿素a、b总量。故叶绿素浓度C＝OD652/34.5(mg/ml)叶绿素的含量（mg/g）=[叶绿素的浓度×提取液体积×稀释倍数]/样品鲜重实验4叶绿素的提取、理化性质和含量测定共28页，您现在浏览的是第19页!2.3.1叶绿素的结构叶绿素a与b很相似，不同之处仅在于Chla第二个吡咯环上的一个甲基(-CH3)被醛基(-CHO)所取代即Chlb。

实验4叶绿素的提取、理化性质和含量测定共28页，您现在浏览的是第20页!2.3.2.1稀酸叶绿素溶液与稀酸(如:草酸)作用，H+取代Mg后的产物为褐色的去镁叶绿素；去镁叶绿素与Cu2+或Zn2+作用，

Cu2+等离子取代后的产物为深绿色的铜代叶绿素等；2.3.2.2浓酸叶绿素溶液与浓酸(如:盐酸)作用，除了代换Mg外，可使去镁叶绿素迅速分解出叶绿醇，并形成褐绿色的去镁叶绿酸。实验4叶绿素的提取、理化性质和含量测定共28页，您现在浏览的是第21页!2.3.3皂化反应叶绿酸是二羧酸，其中一个羧基被甲醇酯化，另一个被叶绿醇酯化。叶绿素是叶绿酸的酯，能发生皂化反应。叶绿素与碱皂化形成的叶绿素盐能溶于水，极性增大。实验4叶绿素的提取、理化性质和含量测定共28页，您现在浏览的是第22页!3材料、试剂与配备1材料

菠菜叶片2仪器设备

研钵，漏斗，剪刀，试管，试管夹，容量瓶(25ml,50ml)，分光光度计，水浴锅等3试剂

95%乙醇，苯，浓盐酸，36%乙酸，CuSO4，MgCO3，石英砂实验4叶绿素的提取、理化性质和含量测定共28页，您现在浏览的是第23页!4.1叶绿素的提取1.新鲜菠菜叶片，去掉中脉后的样品称重(约2-3g,记录样品重量)；2.剪碎入研钵中，加少量石英砂和碳酸镁粉及2-3ml的95%乙醇，研磨匀浆，再加乙醇混匀；3.过滤到25ml容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣，最后连同残渣一起过滤（直至滤纸和残渣中无绿色为止）最后用乙醇定容至25ml(后称原液)，摇匀。实验4叶绿素的提取、理化性质和含量测定共28页，您现在浏览的是第24页!4.3叶绿素含量的测定取5ml叶绿素提取原液移入至50ml容量瓶，95%乙醇定容(稀释液)以95%乙醇作为空白对照，测OD652叶绿素浓度:C＝OD652/34.5(mg/ml)叶绿素的含量（mg/g）=[叶绿素的浓度×提取液体积×稀释倍数]/样品鲜重实验4叶绿素的提取、理化性质和含量测定共28页，您现在浏览的是第25页!5结果记录与数据处理

颜色变化/分层原理荧光现象取代反应—醋酸—CuAc—浓HCl皂化反应—上层—中层—下层表1叶绿素的理化性质5.1实验现象记录与分析实验4叶绿素的提取、理化性质和含量测定共28页，您现在浏览的是第26页!6注意事项操作应在弱光下进行？研磨时间尽可能短，以不超过2分钟为宜分光光度计的正确使用(更换波长后要调0