上海地区遗传性耳聋基因检测室间质量评价

上海地区遗传性耳聋基因检测室间质量评价鲍芸;肖艳群;蒋玲丽;王雪亮;杨依绡;王华梁【摘要】ObjectiveToevaluatetheperformanceofhereditarydeafnessgenetictestinginexternalqualityassessment(EQA)programofShanghai.MethodsIn2017EQAprogram,9locion4differentgeneswereinvestigated.Thesamplepanelconsistedof5differentdrybloodspots.Participatinglaboratorieswereaskedtoreporttheresultsbeforedeadlines.Thescoresoflaboratorieswerecalculated,andtheoverallconsistencyratesofdifferentlociaswellasdifferentmethodsandreagentswerecalculated,anderrorsortingwasevaluated.ResultsTotally,18validlaboratoryresultswerereceived,and77.78％laboratoriessubmittedcorrectresultsforallsamples,5.56％laboratoriesreportedwitherrorsbutwereoverallqualified,and16.67％laboratoriesreportedwitherrorsandwereoverallunqualified.Theconsistencyratewas100％fornegativesamples(wildtypesamples)and93.59％forpositivesamples(mutantsamples).Therewere10errorresults,allofwhichwerefalsenegative.ConclusionsTheoverallaccuracyrateofclinicallaboratoriesenrolledintheprogramofShanghaiishigh.Qualitycontrolsinclinicallaboratoriesisessentialtoassuretheaccuracyofresults.2017EQA49位点,样本盘包含5个样本,样本类型为干血斑.要求参评实验室收到样本后在规定时间内检测并上报检测结果.计算各实验室成绩、不同样本的总体符合率及不同检测方法的符合率,统计检测错误类型.结果共收到18份有效回报结果.77.78％的实验室回报结果完全正确,5.56,16.67％的实验10093.5910【期刊名称】《检验医学》【年(卷),期】2019(034)003【总页数】4页(P267-270)【关键词】遗传性耳聋;基因检测;室间质量评价【作者】鲍芸;肖艳群;蒋玲丽;王雪亮;杨依绡;王华梁【作者单位】上海市临床检验中心,上海200126;上海市临床检验中心,上海200126;上海市临床检验中心,上海200126;上海市临床检验中心,上海200126;上海市临床检验中心,上海200126;上海市临床检验中心,上海200126【正文语种】中文【中图分类】R446.1先天性耳聋是人类最常见的出生缺陷之一，发病率约为1‰～3‰，其中50%以上由遗传因素导致[1-2]。与耳聋相关的基因很多，但大部分耳聋是由少数几个基因的突变导致的。目前，我国临床上已经明确的先天性耳聋基因包括GJB2、GJB3、SLC26A4等，而线粒体DNA突变是中国人群药物性耳聋的主要诱因[2-5]。2007年，王秋菊等[6]首次在我国提出了新生儿耳聋基因筛查的实施方案，随后耳聋基因检测逐步在临床上开展。耳聋基因检测能够从分子水平明确耳聋的致病原因，为早期临床干预、指导安全用药及遗传咨询等提供依据，逐渐成为新生儿筛查常规项目。目前，临床上用于耳聋基因突变检测的方法有荧光聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）、基因芯片杂交法、Sanger测序法、二代测序法等[5-7]。PCR，突变阻滞扩增系统-PCR、PCR+导流杂交法及PCR+芯片杂交法。这几种方法在检测过程中均涉及体外特异性PCR扩增，容易导致结果出现假阳性或假阴性。不同检测试剂所涉及的基因位点不尽相同，但主要为4个耳聋相关基因的9个突变位点，包括GJB2[35delG（rs80338939）、76del16（rs750188782）、235delC（rs80338943）、299delAT（rs111033204）]、GJB3[538C＞T（rs74315319）]、线粒体12SrRNA[1494C＞T（rs267606619）、1555A＞G（rs267606617）]、SLC26A4[IVS7-2A＞G（rs111033313）、2168A＞G（rs121908362）]。本研究针对以上位点开展了2017年室间质量评价（externalqualityassessment，EQA），通过分析实验室上报结果，发现临床实验室在耳聋基因检测中存在的问题，以提高耳聋基因检测质量。材料和方法EQA将以正常人全血为基质、加入一定比例的相关耳聋基因突变细胞系样本制备成的全血滴在滤纸片上，制成直径为1.6cm的滤纸干血斑。EQA采用飞行时间质谱、二代测序法和Sanger测序法对样本进行检测以确定靶值。飞行时间质谱使用20项遗传性耳聋基因突变检测试剂盒（广州达瑞生物公司），采用激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry，MALDI-TOF-MS）系统进行突变检测。二HBA2/HBB/SLC26A4/GJB2/GJB3/ATP7B/PAHDA8600DNADNA，以PfuDNAPolymerase高温聚合酶[生工生物工程（上海）股份有限公司]进行PCR3730xlDNA测序仪（ABI）进行突变检测。EQAEQA1EQA5许选择实验室开展的检测位点回报结果。要求参评实验室采用日常检测系统（仪器、试剂、方法）进行检测，并在规定时间内（自样本接收后3周之内）将检测结果上报至上海市临床检验中心数据库，超过规定时间系统拒收数据。回报结果评价标准与分析依据回报结果计算各参评实验室的得分情况。具体评价标准:（1）突变型样本报告为“突变型”为可接受结果，报告为“野生型”成绩为“0”分；（2）野生型样本报告为“野生型”为可接受结果，报告为“突变型”为不可接受结果，在总成绩中扣除相应分数；（3）单个位点检测成绩=（测定可接受结果数/所有上报结果数）×100；（4）/检测位点个数，得分≥8080检测结果进行统计，计算不同突变位点及不同检测方法的符合率。结果EQA2017年遗传性耳聋基因检测EQA样本盘构成及各位点检测符合率见表1。遗传性耳聋基因检测实验室总体回报情况2017年遗传性耳聋基因检测EQA参评实验室为24家，收到的有效回报结果181593GJB235delG（rs80338939）GJB3538C＞T（rs74315319）724SangerPCR+导流杂交法是最常用的检测方法，使33.33%（6/18）27.78%（5/18），PCR+芯片杂交法和实PCR16.67%（3/18），15.56%（1/18）。12017EQA（%）靶（%）GJB235delG（rs80338939）17211722172317241725（%）（%）（%）93.33100.00100.00100.00100.00GJB2176del16（rs750188782）杂合突变型88.89野生型100.00野生型100.00野生型100.00野生型100.00GJB2235delC（rs80338943）杂合突变型83.33野生型100.00野生型100.00野生型100.00野生型100.00GJB2299delAT（rs111033204）杂合突变型88.89野生型100.00野生型100.00野生型100.00野生型100.00GJB3538C＞T（rs74315319）野生型100.00野生型100.00野生型100.00野生型100.00杂合突变型100.00线粒体12SrRNA1494C＞T（rs267606619）野生型100.00野生型100.00野生型100.00异质突变型94.44野生型100.00线粒体12SrRNA1555A＞G（rs267606617）野生型100.00野生型100.00野生型100.00异质突变型94.44野生型100.00SLC26A42168A＞G（rs121908362）野生型100.00野生型100.00野生型100.00野生型100.00野生型100.00SLC26A4IVS7-2A＞G（rs111033313）野生型100.00野生型100.00野生型/杂合突变型100.00野生型100.00野生型100.00各实验室检测能力评价2017EQA77.78%（14/18）的实验室回报结果完全的实验室出现错误结果，但总成绩合格，16.67%（3/18）的实验室检测成绩不合格。在使用不同检测方法的实验室中，采用实时荧光 PCRPCR+导流杂交法和PCR+芯片杂交法进行检测的参评实验室得分全部为100分；采用Sanger测序法的实验室50%（3/6）总成绩为100分，50%（3/6）总成绩＜80分；1家实验室采用飞行时间质谱，得分为89分，总成绩合格。阴性样本（野生型样本）的检测符合率为100%（624/624），阳性样本（突变型样本）的检测符合率为93.59%（146/156）。共出现检测错误10例，错误类型集中表现为假阴性，9例错误结果出现在使用Sanger测序法检测的实验室中，1例出现在使用飞行时间质谱法检测的实验室中。3讨论区临床实验室耳聋基因检测能力进行评价。83.33%（15/18）EQAEQAEQA结果一致[8]。本EQADNADNA理。再次，已有的研究表明从保存1d到1年的干血斑中提取DNA经PCR扩增，其产物基本等量[9]，证实干血斑中的DNA具有良好的稳定性。2017EQA109SangerSangerEQA[11-12]。建议实验室采用自配试剂进行检测之前应对其检测性能进行评估。EQA（突变型样本报告为“野生型”）则该位点检测成绩为“0”分，出现假阳性结果（野生型样本报告为“突变型”）计为不可接受结果，在总成绩中扣除相应分数，体现了不同错误结果对后续临床影响及风险的差异。除先天性听力障碍外，遗传性耳聋还可表现为迟发性听力障碍。由于迟发性听力障碍具有隐蔽性，传统的听力检查方法会漏诊。对于这类患者，耳聋基因检测有可能明确其真正的病因，及时采取有针对性的保护措施以保护残留听力，避免听力损伤加重。GJB2、GJB3和SLC26A4作为遗传性耳聋致病基因，如果出现假阴性检测结果，临床不会采取相应的随访和干预措施，会产生不可逆的严重后果。全国聋病分子流行病学调查结果显示，中国聋人群体中4.4%的个体携带线粒体基因突变，在使用以链霉素为代表的氨基糖苷类药物后会引发听力下降[13]。线粒体DNA相应位点突变检测出现假阴性结果，则无法避免后续临床上氨基糖苷类耳毒性药物的使用，有可能“一针致聋”。耳聋基因检测结果对后续临床医疗决策具有决定性的意义。随着临床治疗方案的选择对实验室分子检测结果的依赖性越来越高，临床上对基因检测结果准确性的要求也越来越高。EQA可以帮助实验室进一步提高检测质量，更好地服务于患者。参考文献【相关文献】MAHBOUBIH，DWABES，FRADKINM，eta1．Geneticsofhearingloss:wherearewestandingnow?[J].EurArchOtorhinolaryngol，2012，269（7）:1733-1745．[J]杂志，2016，14（5）:639-643.[J].北京医学，2011，33（5）:419-421.5