医疗药品无菌检查法验证

无菌检查法验证

张荣玉一、概述：1.1

定义：系用于检查药典要求的无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其它品种是否无菌的一种方法。2.1验证的必要性和意义：确认所采用的方法检查供试品无菌的适合性。保证检查结果的准确性、可靠性、准确性和重现性；检查方法的完整性。与同药品无菌检查接轨。通过对不同品种、批号的无菌检查比较；对产品生产全过程进行质量监控。二、存在问题:2.1专业人才少,缺乏相应的培训和管理。2.2工作量大,导致操作不规范。2.3检验方法缺陷，如直接种法可操作性差，引入污染的风险较大。2.4试验条件的影响环境影响培养基、稀释剂、冲洗液。所用品、器具清洁灭菌。三、无菌检查的试验要求:3.1环境：10000级局部以下100级，布局符合无菌操作要求；或隔离系统（生物安全柜）。3.2人员：必须具备微生物专业知识，并经培训。3.3设备、器件、材料：经处理必须符合无菌要求，培养箱的温度指示装置要校验。3.4培养基：3.4.1按药典规定处方配制，采用经验证合格的灭菌程序灭菌。3.4.2保存：2-25℃避光保存；期限：非密闭容器3周，密闭容器1年。3.4.3培养基适用性、无菌性、灵敏度检查。3.4.4灵敏度检查：3.4.4.1检查用菌株传代不得超过5代。3.4.4.2常用菌株：金黄色葡萄球菌（CMCC(B)26003)铜像假单胞菌[CMCC（B）10104]枯草芽胞杆菌[CMCC（B）63501]生孢梭菌[CMCC（B）64941]白色念珠菌[CMCC（F）98001]黑曲霉[CMCC（F）98003]3.4.4.3菌液配制、保存、接种培养按药典要求。3.4.4.4结果判断：空白对照应无细菌增长，加菌液的培养基管均生长良好，培养基灵敏度符合要求。3.5稀释液、冲洗液：3.5.1按药典规定配制后采用经验证的灭菌程序灭菌。3.5.2常用稀释液、冲洗液：0.1%蛋白胨水液PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液无菌0.1%氯化钠液中性磷酸盐缓冲液含0.1%聚山梨酯（吐温-80℃）的0.1%蛋白胨水溶液3.5.3依据供试品的特性选择稀释液、冲洗液。四、无菌检查法验证:4.1原理:验证的所有环境、培养基、菌株、稀释液、冲洗液均与日常检查方法相一致、并符合相关规定。4.2验证分类：前验证：建立无菌检查方法时。再验证：修订检查方法时。定期验证：供试品组合或原检查条件改变。4.3验证方案制定原则：供试品的抑菌性，敏感菌种选择;适当的方法消除或降低抑菌性。样品的预处理方式能有效抵消（或中和）产品的抑菌性。样品的预处理方式、检验过程、培养条件均不影响样品中微生物的生长。验证记录真实完整地记录所做试验。4.4验证重点环节分布：样品需前处理不需前处理验证前处理方法对污染菌生长，检出影响有抑菌作用去除抑菌作用通过验证实验判无抑菌作用验证抑菌活性去除方法的有效性及对污染菌检出物影响检验4.5验证方法：4.5.1制备验证试验菌液，按药典方法配制菌液。4.5.2选择配制适合的培养基、稀释液、冲洗液。4.5.3供试品的处理：验证所用的溶解剂、稀释剂、助溶剂、破乳剂等的有效性，使用量及微生物生长无影响。验证加热温度、离心速度和时间对微生物生长或分布无影响。不需前处理的供试品免做。4.5.4无抑菌性性样品的的验证方方法：依依据产品品溶解性性和微生生物限度度选择合合适的中中性稀释释剂溶解解和稀释释，用直直接接种种法验证证，常用用中性稀稀释液或或淋洗液液。4.5.5具有抑菌菌性样品品的验证证方法：：确定抑菌菌作用（（抑细菌菌、真菌菌试验验验证），，选择敏敏感菌株株对供试试品抑菌菌活性去去除效果果检验（（阳性菌菌回收试试验）。。消除样品品抑菌性性的方法法验证：：化学钝化化中和法法（化学学试剂中中合法））：利用用化学（（生物））专属性性灭活，，常用钝钝化剂有有：对氨氨基苯甲甲酸、卵卵磷脂、、聚山梨梨酯-80等。薄膜膜过滤法法和直接接接种法法也可用用。对化化学中和和剂不敏敏感的样样品，用用酶中和和，如β-内转氨酶酶。稀释中和和法：利利用降低低供试品品的相对对浓度，，将样品品稀释至至最低抑抑菌浓度度下进行行。薄膜过滤滤法：利利用体积积差异分分离，通通过薄膜膜过滤，，微生物物被截于于滤膜，，培养薄薄膜观察察有无微微生物生生长。各各方法组组合运用用，效果果更好。。③验证方法法:a.验证分组组：A组:样品组,适当方法法中和样样品,加入少量量验证微微生物(接种量少少于100cfu)。B组:对照组,0.1%蛋白胨或或PH7.0无菌氯化化钠蛋白白胨缓冲冲液,加少量微微生物(接种量少少于100cfu).C组：阳性性对照组组，不经经中和处处理，将将实验菌菌株直接接接种于于培养基基中(接种量少少于100cfu)。b.结果分析析:A组与B组微生物物生长数数量相似似，表明明中和剂剂的中和和方式有有效消除除了样品品的抑菌菌性，如如果B组与C组的微生生物数量量相似，，表明样样品预处处理用中中和剂的的毒性、、检测程程序和培培养条件件等均不不影响微微生物生生长。样样品如无无抑菌性性，省去去B组试验，，A组与C组直接比比较。A组微生物物生长数数量不及及C组微生物物生长数数量，表表明试验验用器具具材料或或培养条条件等方方面存在在对微生生物生长长不利因因素。c.为考查验验证方法法的稳定定性和重重现性，，验证至至少需3个不同批批次的同同类样品品，分别别进行3次验证实实验。五、供试品无无菌检查查验证:5.1按药典要要求确定定检验数数量、检检验量、、设立阳阳性对照照和阴性性对照。。5.2供试品无无菌检查查方法和和检验条条件与验验证方法法相同。。5.3直接接种种法验证证试验：：5.3.1供试品有有抑菌时时，按培培养基灵灵敏度试试验的菌菌种，向向该种无无菌检查查培养基基内加入入该微生生物，每每种培养养基接2瓶，每瓶瓶接种量量控制10-100cfu之间。5.3.2参照药典典规定确确定培养养基用量量，按无无菌检查查要求向向上述其其中一瓶瓶加入规规定量供供试品，，另一瓶瓶为阳性性对照。。5.3.3将种好的的容器按按药典规规定温度度培养14days。5.3.4验证结果果评价：：供试品与与阳性对对照相比比、供试试品容器器内微生生物生长长不明显显，说明明有抑菌菌性。可可使用中中和剂如如比温-80。β-内酰胺酶酶等消除除抑菌效效果。中中和剂不不能消除除抑菌作作用，适适当增加加培养基基体积稀稀释。5.4薄膜过滤滤法验证证试验：：5.4.1薄膜过滤滤法验证证试验供供试品有有抑菌特特性时，，在同型型号的每每个过滤滤器加规规定定量量的供试试品（容容器数及及每容器器的过滤滤体积））。淋洗洗至少3次，淋洗洗液为100ml/次，最后后一次淋淋洗液中中，接种种验证用用菌株（（10-100cfu）；取另另一滤器器不过滤滤供试品品，重复复上述淋淋洗操作作，作为为阳性对对照。分分别将灵灵敏度实实验的菌菌种及相相应培养养基逐一一试验。。5.4.2供试品和和阳性对对照接种种后、培培养基容容器按药药典菌株株要求温温度下培培养，时时间不超超过14days。5.4.3使用新的的滤膜过过滤器（（不同厂厂家或批批号、型型号）重重新进行行样品试试验组、、蛋白胨胨对照组组和阳性性对照组组的验证证确认。。5.4.4验证结果果评价：：供试品培培养基容容器内可可见微生生物生长长明显（（混浊）），与阳阳性对照照组比较较结果相相似，则则在无菌菌检查试试验中必必须过滤滤与验证证试验相相等量的的供试品品、淋洗洗液。淋淋洗相同同次数及及使用相相同量的的培养基基。供试品培培养基容容器内与与阳性对对照结果果相比微微生物生生长不明明显，应应增加淋淋洗次数数、重复复上述试试验。六、验证合格格标准:6.1平皿菌落落计:6.1.1通常用于于药品防防腐剂防防腐效力力测试和和微生物物限度检检查中。。计数每每毫升（（或克））样品的的微生物物含量。。6.1.2每种试验验菌每组组至少重重复3次（3个不同批批次的样样品）。。6.1.3合格标准准：A组（样品品试验组组）验证证微生物物平均生生长数量量不低于于C组（阳性性对照组组）验证证微生物物平均生生长数量量的70%，检验方方法通过过验证。。6.2直接接种种法：6.2.1培养基能能中和抗抗菌剂的的抑菌性性，并适适合广谱谱微生物物的生长长，包括括样品种种潜在微微生物生生长。6.2.2每种试验验菌种每每组实验验至少独独立重复复3次。如需需要改变变产品和和培养基基比率达达到中和和效果。。6.2.3合格标准准：3批（不同同批次的的样品））在14days内所有样样品试验验组中培培养基都都显示大大量的微微生物生生长，则则相应的的试验方方法通过过验证。。6.3薄膜过滤滤法：6.3.1适用于无无菌检查查和生物物限度坚坚查，样样品必须须能被过过滤。需需溶解的的样品应应验证该该样品的的溶解方方式及整整个试验验过程，，试验用用具和材材料及培培养条件件等不会会影响样样品中固固有的微微生物的的生长。。6.3.2样品试验验组、样样品溶液液通过薄薄膜，用用适量淋淋洗液淋淋洗3次，在最最后一次次淋洗液液中接入入少量（（10-100财富）验验证菌。。淋洗后后，将滤滤膜转移移到固体体培养基基（或液液体培养养基中））培养。。样品抑抑菌性强强、则应应进行中中和处理理，再验验证中和和效果。。6.3.3蛋白胨对对照组：：不加产产品的稀稀释液，，其他操操作及实实验条件件与样品品试验组组相同。。验证中中和用钝钝化剂（（针对需需预处理理的样品品）、过过滤器和和滤膜材材质是否否会对微微生物产产生影响响）。6.3.4阳性对照照组：将将与上述述两组等等量同种种验证菌菌液（10-100cfu）直接种种到固体体培养基基表面（（或液体体培养基基中）。。比较蛋蛋白胨对对照组和和阳性对对照组微微生物的的情况，，估算滤滤器和滤滤膜造成成微生物物的损失失量。6.3.53次试验（（3个不同批批次的样样品）结结果评价价：上述述3组试验结结果间差差异均在在70%以上（固固体培养养基）或或培养14days内所有试试验组的的液体培培养基微微生物均均有生长长，则认认为验证证微生物物的回收收率基本本相同，，相应的的微生物物验证方方法同过过验证。。七、验证试验验结果的的评价与与报告:7.1分析评价价主要包包括有：：7.1.1对每个验验证试验验的菌株株、每次次验证试试验的数数据及其其有效性性和合理理性评价价。7.1.2验证试验验数据所所表明的的检品预预处理方方式、检检验用器器具、材材料、培培养条件件等的合合理性是是否符合合规定要要求，它它们与药药品检验验的规程程要求是是否符合合。7.1.3验证试验验数据最最后要说说明该药药品的微微生物检检测方法法是否准准确、有有效、可可靠与可可行，是是否有较较好的重重现性。。最后得得出结论论。7.2验证试验验报告内内容包括括有：7.2.1验证试验验药品的的名称，，待验证证检验方方法的有有效登记记号。7.2.2验证试试验用用菌株株名称称、菌菌号、、试验验室控控制号号、转转种代代数。。7.2.3验证菌菌株的的制备备和接接种记记录。。7.2.4验证供供试品品的预预处理理方法法、检检验用用具和和材料料、检检测步步骤以以及培培养条条件等等。7.2.5验证试试验结结果的的评价价及结结论。。7.2.6验证条条件：：包括括验证证试验验的原原始记记录，，包括括验证证菌株株的制制备和和接种种量复复核、、验证证试验验结果果等。。无菌验验证范范例（（注射射剂无无菌检检查方方法））一、材材料：：1.1样品：：品名名、规规格、、批号号、生生产批批号。。1.2培养基基稀释释液：：硫乙乙醇酸酸盐液液体培培养基基、批批号；；改良良马丁丁液体体培养养液，，批号号；营营养肉肉汤培培养基基，批批号；；营养养琼脂脂培养养基，，批号号；0.1%蛋白胨胨涤养养，PH7.1±±0.2；培养养基和和稀释释液来来源。。1.3验证试试验用用菌种种：所所用菌菌代数数。金金黄色色葡萄萄球菌菌（26003）；铜铜绿假假单胞胞菌（（10104），枯枯草芽芽孢杆杆菌（（63501）;生孢梭梭菌（（64941）；白白色念念珠菌菌（98001）；黑黑曲霉霉菌（（98003），上上述菌菌种的的来源源及传传代数数。1.4仪器和和滤器器：HTY-2001A集菌仪仪；全全封闭闭无菌菌试验验过滤滤培养养器，，批号号及生生产厂厂商。。二、验验证方方法：：2.1菌液制制备：：取经34℃℃培养18-24h的金葡葡萄、、铜绿绿假单单胞菌菌，枯枯草孢孢芽菌菌的新新鲜肉肉汤培培养物物1ml，加入入无菌菌0.9%氯化钠钠溶液液9ml，10倍稀释释至10-5、10-7均为50-100cfu/ml，备用用。取经34℃℃培养18-24h的生孢孢梭菌菌硫乙乙醇酸酸盐液液体培培养物物1ml。加入入无菌菌0.9%氯化钠钠溶液液9ml，10倍稀释释至10-7均为50-100cfu/ml，备用用。取经24℃℃培养的的白色色念珠珠菌改改良马马丁液液体培培养物物1ml，加入入无菌菌0.9%氯化钠钠溶液液9ml，10倍稀释释至10-7均为50-100cfu/ml，备用用。取经24℃℃培养一一周的的黑曲曲霉料料面培培养物物，加加入无无菌0.9%氯化钠钠溶液液10ml，洗下下孢子子；吸吸出孢孢子悬悬液，，过滤滤除去去菌籽籽，收收集菌菌液至至另一一无菌菌试管管，取取菌液液0.1ml，加入入无菌菌0.9%氯化钠钠溶液液9.9ml，稀释释至10-7均为50-100cfu/ml，备用用。2.2菌液计计数：：每种种菌液液接种种工作作皿、、取平平均值值。计计数结结果列列表（（略））。。2.3方法验验证