以NFκB为靶点的缺血性急性肾衰基因治疗的实验研究 开题报告幻灯课件

以NF-κB为靶点的缺血性急性肾衰基因治疗的实验研究

导师研究生以NF-κB为靶点的缺血性急性肾衰导师1立论依据立论依据2急性肾功能衰竭（ARF)的概况发病率：2.5％；死亡率：高，50％；治疗方法：透析；改善预后的关键：是在阐明其发病机制的基础上进行有效的针对性治疗。急性肾功能衰竭（ARF)的概况发病率：2.5％；3急性肾功能衰竭(ARF)的发病机制与一些因子有关

单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)细胞间黏附分子-1（ICAM-1）内皮素（endothelin,ET）游离型一氧化氮合酶iNOS急性肾功能衰竭(ARF)的发病机制与一些因子有关单核细胞4免疫因子的表达、平衡受到转录因子的调控免疫因子的表达受到转录因子NF-κB的调控。免疫因子的表达、平衡受到转录因子的调控免疫因子的表达受到转5NFκB可由多种激活剂激活，由无活性的结合状态经磷酸化后活化，易位到细胞核内，与特异性的结合位点（κB位点）结合，启动基因的转录NFκB可由多种激活剂激活，由无活性的结合状态经磷酸化后活化6研究转录因子在疾病发病中的作用并进行干预，可在更早期阻断发病环节，起到“提纲挈领”“事半功倍”的效果。研究转录因子在疾病发病中的作用并进行干预，可在更早期阻断7NF-κB参与了缺血性ARF的发病

NF-κB在肾病综合征、动脉粥样硬化、病毒感染和肿瘤发生中起一定作用；我们的前期研究结果表明:NF-κB在缺血性ARF中活性升高；可能促进了早期、晚期肾损害的发生；是通过调控iNOS等炎性因子的表达来实现的。

NF-κB参与了缺血性ARF的发病NF-κB在肾病综合征8抑制NF-κB的策略在疾病中研究治疗心肌梗塞恶性肿瘤的转移抑制肾的排斥反应实验性肾小球肾炎抑制NF-κB的策略在疾病中研究治疗心肌梗塞9NFκBdecoy作用的示意图NFκBdecoy作用的示意图10阳离子脂质体转染法可能机制是：DNA负电荷与脂质体上的正电荷结合，脂质体上剩余的正电荷与细胞膜上的唾液酸残基的负电荷结合，然后通过二者的融合将DNA导入细胞阳离子脂质体转染法可能机制是：11脂质体介导转染的机制脂质体介导转染的机制12方法：HVJ脂质体DNA转染法以及缺陷；鱼精蛋白(protamine)与阳离子脂质体和DNA一道，按一定的电荷比例制成复合物（LPD）进行体内、外转染，可提高基因转染效率

阳离子脂质体转染法方法：HVJ脂质体DNA转染法以及缺陷；阳离子脂质体转染法13本研究将选择大鼠缺血性ARF模型，应用NF-κB结合位点引诱物ODN进行体内外转染，通过观察对MCP-1、ICAM-1、iNOS和ET-1表达的影响，肾功能和肾组织的形态学的改变,观察其对肾细胞及肾功能的保护作用，为基因治疗提供理论依据。本研究将选择大鼠缺血性ARF模型，应用NF-κB结合位点引诱14研究内容、步骤和方法研究内容、步骤和方法15研究内容

观察NF-κB结合位点引诱物ODN对体外刺激培养细胞的免疫因子产生的影响观察NF-κB结合位点引诱物ODN对缺血型ARF的预防和治疗作用。研究内容观察NF-κB结合位点引诱物ODN对体外刺激16研究步骤

体外转染：选用NRK-52E细胞株，观察转染后对表达MCP-1、ICAM-1、ET-1和iNOS的影响。体内转染：在肾动脉阻断的同时以及再灌注后不同时间，经肾动脉给予NF-κB结合位点引诱物ODN，进行观察。研究步骤体外转染：选用NRK-52E细胞株，观察转染后对17实验方法大鼠近端肾小管上皮细胞（NRK-52E）培养；阳离子脂质体的制备

；iARF模型的制备；肾动脉注射法。实验方法大鼠近端肾小管上皮细胞（NRK-52E）培养；18大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）培养本实验室已有传代的细胞株和成熟的方法大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）培养本实验室已有传代的细19鱼精蛋白-脂质体ODN/DNA(LPD)的制备

将ODN与鱼精蛋白、脂质体混合，使鱼精蛋白、脂质体与ODN＋/－电荷比率为4鱼精蛋白-脂质体ODN/DNA(LPD)的制备

20脂质体体外转染的实验步骤

细胞接种到48孔培养板，培养过夜或使铺满达50－80％；细胞培养液中加入LPD使ODN终浓度为1mmol/L，裸转染为直接将ODN与细胞孵育；同时各孔加入TNF使终浓度为50ng/ml，设立空白对照，置37℃，CO2孵箱内，培养2－12h。脂质体体外转染的实验步骤细胞接种到48孔培养板，培养过夜21体外分组

1.LPD组2.裸转染组3.空白对照组体外分组

22

转染效率：

荧光显微镜观察胞内荧光素标记的NF-BdecoyODN的分布

FCM检测细胞摄入率。

NF-B活性

凝胶电泳迟滞分析（EMSA）

各免疫因子的表达：

mRNA表达的半定量RT-PCR分析观察指标转染效率：观察指标23肾脏内转染

戊巴比妥钠(sodiumpentobarbital)50mg/kg,麻醉，并插管呼吸按本科建立的方法制备iARF模型；用30G针将200lLPD，注入左肾动脉;准备实验阶段用FITC标记LPD;夹闭60min后，开始再灌注;肾脏内转染戊巴比妥钠(sodiumpentobarbit24

注射后2,12，24hr处死大鼠，取出肾脏，做冷冻切片进行荧光显微镜检查，观察荧光的分布情况。

转染效率的观察注射后2,12，24hr处死大鼠，取出肾脏，做冷冻25体内转染分组Sham组iARF组NF-BdecoyODN治疗组错配物ODN治疗组体内转染分组Sham组26

肾功能检测及肾组织形态学的检查；免疫组化检查肾组织中的M/MΦ的分布；EMSA检查肾组织的NF-B活性的变化；RT-PCR和免疫组化检查MCP-1、ICAMET-1和iNOSmRNA的表达及其在肾脏中的分布。

观察指标观察指标27可能遇到的问题及解决办法虽然在设计体外实验部分的时候，已充分考虑到脂质体转染效率的影响因素如：+/-，脂质体本身的组成，但是，体内实验部分是否也能够在体外最佳条件下达到最佳效果。

肾动脉分离和注射的出血问题。EMSA技术的难度可能遇到的问题及解决办法虽然在设计体外实验部分的时候，已充28初步结果初步结果29图1NRK-52E细胞转染效率FCM测定1：空白对照；2.PL法转染；3：裸转染图1NRK-52E细胞转染效率FCM测定30图2NRK-52E细胞转染效率照片A：PL法转染2h后普通光镜观察；B：A视野的荧光镜观察。C：裸转染2h后普通光镜观察；D：C视野的荧光镜观察。E：空白对照普通光镜观察；F：E视野的荧光镜观察。N胞转染NFκBdecoy2h后普通光镜下观察图2NRK-52E细胞转染效率照片31经肾动脉给药2h后，NF-κBdecoy主要分布在肾小球经肾动脉给药2h后，NF-κBdecoy主要分布在肾小球32经肾动脉给药12h后，NF-κBdecoy主要分布在肾小管经肾动脉给药12h后，NF-κBdecoy主要分布在肾小33下一步研究计划NF-κBdecoy转染治疗后对ARF大鼠肾功能的影响：生化学指标组织学指标观察肾组织中NF-κB及其下游的分子MCP-1、ICAM-1、iNOS、ET-1的变化：EMSA,RT-PCR和免疫组化恳请各位老师提出宝贵意见并予以指导。下一步研究计划NF-κBdecoy转染治疗后对ARF大鼠34谢谢大家谢谢大家35以NF-κB为靶点的缺血性急性肾衰基因治疗的实验研究

导师研究生以NF-κB为靶点的缺血性急性肾衰导师36立论依据立论依据37急性肾功能衰竭（ARF)的概况发病率：2.5％；死亡率：高，50％；治疗方法：透析；改善预后的关键：是在阐明其发病机制的基础上进行有效的针对性治疗。急性肾功能衰竭（ARF)的概况发病率：2.5％；38急性肾功能衰竭(ARF)的发病机制与一些因子有关

单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)细胞间黏附分子-1（ICAM-1）内皮素（endothelin,ET）游离型一氧化氮合酶iNOS急性肾功能衰竭(ARF)的发病机制与一些因子有关单核细胞39免疫因子的表达、平衡受到转录因子的调控免疫因子的表达受到转录因子NF-κB的调控。免疫因子的表达、平衡受到转录因子的调控免疫因子的表达受到转40NFκB可由多种激活剂激活，由无活性的结合状态经磷酸化后活化，易位到细胞核内，与特异性的结合位点（κB位点）结合，启动基因的转录NFκB可由多种激活剂激活，由无活性的结合状态经磷酸化后活化41研究转录因子在疾病发病中的作用并进行干预，可在更早期阻断发病环节，起到“提纲挈领”“事半功倍”的效果。研究转录因子在疾病发病中的作用并进行干预，可在更早期阻断42NF-κB参与了缺血性ARF的发病

NF-κB在肾病综合征、动脉粥样硬化、病毒感染和肿瘤发生中起一定作用；我们的前期研究结果表明:NF-κB在缺血性ARF中活性升高；可能促进了早期、晚期肾损害的发生；是通过调控iNOS等炎性因子的表达来实现的。

NF-κB参与了缺血性ARF的发病NF-κB在肾病综合征43抑制NF-κB的策略在疾病中研究治疗心肌梗塞恶性肿瘤的转移抑制肾的排斥反应实验性肾小球肾炎抑制NF-κB的策略在疾病中研究治疗心肌梗塞44NFκBdecoy作用的示意图NFκBdecoy作用的示意图45阳离子脂质体转染法可能机制是：DNA负电荷与脂质体上的正电荷结合，脂质体上剩余的正电荷与细胞膜上的唾液酸残基的负电荷结合，然后通过二者的融合将DNA导入细胞阳离子脂质体转染法可能机制是：46脂质体介导转染的机制脂质体介导转染的机制47方法：HVJ脂质体DNA转染法以及缺陷；鱼精蛋白(protamine)与阳离子脂质体和DNA一道，按一定的电荷比例制成复合物（LPD）进行体内、外转染，可提高基因转染效率

阳离子脂质体转染法方法：HVJ脂质体DNA转染法以及缺陷；阳离子脂质体转染法48本研究将选择大鼠缺血性ARF模型，应用NF-κB结合位点引诱物ODN进行体内外转染，通过观察对MCP-1、ICAM-1、iNOS和ET-1表达的影响，肾功能和肾组织的形态学的改变,观察其对肾细胞及肾功能的保护作用，为基因治疗提供理论依据。本研究将选择大鼠缺血性ARF模型，应用NF-κB结合位点引诱49研究内容、步骤和方法研究内容、步骤和方法50研究内容

观察NF-κB结合位点引诱物ODN对体外刺激培养细胞的免疫因子产生的影响观察NF-κB结合位点引诱物ODN对缺血型ARF的预防和治疗作用。研究内容观察NF-κB结合位点引诱物ODN对体外刺激51研究步骤

体外转染：选用NRK-52E细胞株，观察转染后对表达MCP-1、ICAM-1、ET-1和iNOS的影响。体内转染：在肾动脉阻断的同时以及再灌注后不同时间，经肾动脉给予NF-κB结合位点引诱物ODN，进行观察。研究步骤体外转染：选用NRK-52E细胞株，观察转染后对52实验方法大鼠近端肾小管上皮细胞（NRK-52E）培养；阳离子脂质体的制备

；iARF模型的制备；肾动脉注射法。实验方法大鼠近端肾小管上皮细胞（NRK-52E）培养；53大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）培养本实验室已有传代的细胞株和成熟的方法大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）培养本实验室已有传代的细54鱼精蛋白-脂质体ODN/DNA(LPD)的制备

将ODN与鱼精蛋白、脂质体混合，使鱼精蛋白、脂质体与ODN＋/－电荷比率为4鱼精蛋白-脂质体ODN/DNA(LPD)的制备

55脂质体体外转染的实验步骤

细胞接种到48孔培养板，培养过夜或使铺满达50－80％；细胞培养液中加入LPD使ODN终浓度为1mmol/L，裸转染为直接将ODN与细胞孵育；同时各孔加入TNF使终浓度为50ng/ml，设立空白对照，置37℃，CO2孵箱内，培养2－12h。脂质体体外转染的实验步骤细胞接种到48孔培养板，培养过夜56体外分组

1.LPD组2.裸转染组3.空白对照组体外分组

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转染效率：

荧光显微镜观察胞内荧光素标记的NF-BdecoyODN的分布

FCM检测细胞摄入率。

NF-B活性

凝胶电泳迟滞分析（EMSA）

各免疫因子的表达：

mRNA表达的半定量RT-PCR分析观察指标转染效率：观察指标58肾脏内转染

戊巴比妥钠(sodiumpentobarbital)50mg/kg,麻醉，并插管呼吸按本科建立的方法制备iARF模型；用30G针将200lLPD，注入左肾动脉;准备实验阶段用FITC标记LPD;夹闭60min后，开始再灌注;肾脏内转染戊巴比妥钠(sodiumpentobarbit59

注射后2,12，24hr处死大鼠，取出肾脏，做冷冻切片进行荧光显微镜检查，观察荧光的分布情况。

转染效率的观察注射后2,12，24hr处死大鼠，取出肾脏，做冷冻60体内转染分组Sham组iARF组NF-BdecoyODN治疗组错配物ODN治疗组体内转染分组Sham组61

肾功能检测及肾组织形态学的检查；免疫组化检查肾组织中的M/MΦ的分布；EMSA检查肾组织的NF-B活性的变化；RT-PCR和免疫组化检查MCP-1、ICAMET-1和iNOSmRNA的表达及其在肾脏中的分布。

观察指标观察指标62可能遇到的问题及解决办