SRY基因检测及在性别鉴定中的应用 山东大学

科曰遗传学实验题目SRY基因检测及在性别鉴定中的应用SRY基因检测及在性别鉴定中的应用摘要SRY基因是人类的性别决定因子，该基因决定雄性的性别。为了验证SRY基因决定人类的性别表型，我们通过磁珠法分别提前男性和女性发根细胞中的基因组DNA，设计符合SRY基因扩增的引物，利用PCR扩增的方法获得大量SRY基因扩增产物，再通过琼脂糖凝胶电泳的方法检测SRY基因。1.引言SRY基因（sex-determiningregionofY-chromosome,全称：Y染色体性别决定区）是决定人类雄性性别的基因，该基因是决定男性睾丸发育的主要基因。人的SRY基因位于Yp11.3（Y染色体短臂末端），只含有一个外显子，没有内含子，转录单位长约1.1kb，编码一个204氨基酸的蛋白质。SRY基因是由Sinclair在1990年发现的。该基因比较特别。它的序列在不同男性体内惊人地相似。研究证明，它的序列几乎没有任何突变，从大约20万年以前人类最后一个共同祖先到现在，它一直没有变化。受精卵中的X染色体上有决定卵巢发育的基因，如果SRY基因没有及时启动的话，原始性腺就会自然而然地向卵巢方向发育。当SRY基因启动后，其基因编码的蛋白质需要先进入细胞核，继而启动一系列基因的表达，促进胎儿的原始性腺向睾丸方向发育。然后，这个最初的微小睾丸开始分泌睾酮。睾酮的出现，是SRY基因作为“幕后推手”最重要的价值体现。SRY基因是目前认为的唯一一个性别决定基因。因此在血液，精液样本中可以通过寻找该基因片断，达到判断测试者的性别的目的。通常采用的方法是，先使用PCR技术扩增该基因上某个片断，再利用凝胶电泳判断样本中是否含有该基因。若测试者是男性，样本中存在该基因，测试为阳性。女性测试者将会相应得到阴性结果。磁珠法提取基因组DNA原理：磁珠法中的细胞裂解液是一种蛋白变性剂，可使动植物的细胞裂解并使与DNA结合的蛋白质变性、DNA游离释放，磁珠可以特异性地吸附DNA，通过洗涤去除DNA以外的RNA、蛋白质等杂质，再用洗脱液解离吸附在磁珠上的DNA，得到纯度和浓度均很高的DNA，可用于PCR扩增、酶切、分子杂交等。PCR扩增原理：PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火一延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至93°C左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板一引物结合物在72C、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性一退火一延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2〜4分钟，2〜3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。科曰遗传学实验题目SRY基因检测及在性别鉴定中的应用2.材料和方法2.1实验材料材料：男生和女生的含毛囊的头发或口腔脱落的细胞；试剂和仪器：磁珠法提取DNA试剂盒，70%乙醇溶液，TE缓冲液，EB染液，琼脂糖，6X上样缓冲液（0.25%漠酚蓝，0.25%二甲苯青，30%甘油于水中，4°C贮存），TAE缓冲，PCR扩增仪，加样器，紫外成像仪，电泳槽；PCR检测材料：上下游引物、10XPCR缓冲液，25mMMgCl2，2.5mmol/LdNTP原液，1U/plTaq酶溶液，ddH2O。2.2实验方法2.2.1第一周（5月23日）：获取实验材料：分别拔取三根男生和女生的带有毛囊的头发，用清水轻轻冲洗。提取发根细胞中的基因组DNA：（为了使实验进行的较快，我们组采用了磁珠法提取DNA的方法）磁珠法：1、向1.5ml离心管加入380MBufferMGL和20MProteinaseK从毛发根部取1cm长的含毛囊的毛发加入上述离心管中2、将上述离心管振荡混匀，65°C水浴20min，间或混匀，使样品充分裂解。3、向充分裂解的样品加入400MBufferMA和10MMagicmagbeads，振荡混匀10s.4、将离心管置于磁力架上，待Magicmagbeads完全吸至管壁上之后，吸弃上清，从磁力架取出离心管。5、加入700M70%乙醇，振荡混匀10s.将离心管置于磁力架上1min，待Magicmagbeads完全吸至管壁上之后，吸弃上清，从磁力架取出离心管。6、重复步骤5，室温开盖干燥15min至管内无残液。7、加入15-25MTEBuffer,65C水浴20min，间或混匀，离心2min，8、将离心管置于磁力架上1min，待Magicmagbeads完全吸至管壁上之后，吸取上清至新的离心管，即获得基因组DNA。碱裂解法：1、在一个200ulPCR管中加20pl的0.2mol/LNaOH溶液。剪下带毛囊的发根部分，放入管中并盖上管盖，放入有热盖的PCR仪中，75C温育30min，以避免水分蒸发。2、加入50pl的0.04mol/LHCl中和。3、12000r/min离心5min去除未溶解的沉淀物，上清转入1个新管，DNA就在水溶液中。2.2.2第二周（5月30日）设计引物：根据人的SRY基因的序列，扩增其基因的序列为：SRY1：5’-TGGGACTGGTGACAATTGTC-3'SRY2：5’-GAGTACAGGTGTGCAGCTCT-3'PCR反应：1、按照设计的反应体系，分别在0.2ml离心管中（22pl/管）中加入下列试剂:试剂名称加入试剂的量/pl（终浓度）10XPCR缓冲液2.525mMMgCl22(2mM)2.5mmol/LdNTP2(0.2mmol/L)科曰遗传学实验题目SRY基因检测及在性别鉴定中的应用10umol/LSRY引物11(0.4umol/L)10umol/LSRY引物21(0.4umol/L)1U/plTaq酶溶液0.5(2U/100pl)ddH2O13男生/女生的DNA3体系总量252、混匀，瞬时离心。3、PCR扩增：变性94C3min变性94C30s复性50C30s循环35次延伸72C30s延伸72C5min保温10C84、扩增产物冷却至室温可于4C保存。2.2.3第三周（6月6日）电泳检测：1、制备2%的琼脂糖凝胶：称取8.0g琼脂糖粉末，放到一锥形瓶中，加入40ml的1XTAE电泳缓冲液。然后置微波炉加热至完全溶化，溶液透明。稍摇匀，得胶液。静置放置冷却至60r左右。取有机玻璃制胶板槽，水平放置胶槽，在一端插好梳子，在槽内缓慢倒入已冷至60°C左右的胶液，使之形成均匀水平的胶面。待胶凝固后，小心拔起梳子，使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。在槽内加入1XTAE电泳缓冲液，至液面覆盖过胶面。2、电泳：取8plPCR产物，加2ul上样缓冲液，混匀，点样，同时点DNA分子量marker。在5V/cm的电压下电泳。3、染色及紫外成像：电泳结束后用EB染色20min，紫外检测观察并导出图像。3.结果3.1电泳结果科曰遗传学实验题目SRY基因检测及在性别鉴定中的应用胶板23.2结果分析Marker:ADNA/HindIII；胶板1第3泳道：本组女生头发实验组；胶板2第15泳道：本组男生头发实验组。理论结果：男性样品可以见到一条约239bp的阳性扩增片段。女性样品为阴性扩增片段。实际结果：女性样品中出现一条约2000bp左右的片段。男性样品中也有一条比较模糊的2000bp左右的条带。证明没有扩增出SRY基因。观察其他组的实验结果，发现大多数男性和女性的样品都没有扩增出SRY基因，而且好几组出现了明显的多条带，即非特异性扩增条带。我们认为实际结果与理论不符合的原因可能有：①引物设计的不合理，没有扩增出特异性片段；②样品浓度太低，导致特异性扩增片段量太少颜色过浅无法观察出来；③凝胶做的不好。理论上2%的琼脂糖凝胶应该可以分离出0.1-3kb的DNA片段，但实际电泳结果中ADNA/HindIIIMarker的564bp和125bp的小片段条带也没有出现。所以我们认为可能与胶板有关。4.讨论4.1注意事项及改进之处：在样本选择上，可以换用外周血或唾液来重新检测，发囊细胞中提取出来的基因组DNA比较少。在磁珠法提取基因组DNA时，一定要注意不要把磁珠吸出来，磁珠上吸附有DNA，吸出磁珠即意味着DNA的损失。可以查阅相关资料后，再设计新的一对合适的引物和PCR反应，重新检测SRY基因。4.2扩展知识1.SRY基因PCR扩增检测性别的方法可对一滴血、一根毛发、多年的尸块、胎儿、有争议的性别等进行性别鉴定。可以广泛应用于法医鉴定、无创孕期胎儿性别鉴定以预防乂连锁隐性遗传病患儿的出生以及对有性别争议的运动员体检等方面。2.最新的研究也发现，SRY基因不仅在决定性别方面起着决定作用，对调节大脑功能也具有重要意义。神经物质多巴胺被认为与帕金森氏症有重要关联，而美国科学家近日首次发现