Fortebio Octet定量简明指南

Octet®SystemsBiomolecularkinetics•Quantitation•ImpuritytestingOctet定量简明指南^MfortebioBiologiesbyMoilecularDevices

<Bfortebio*BiologiesbyMgl^cularDewiicesOctet定量简明指南（一步法浓度测定）一步法：用现有的传感器，比如proA,proG,proL检测IgG等物质，通过分析物的结合速率来对其进行浓度测定。1实验准备样品板，greinerPN655209,200ul一孔加入缓冲液和样品等预湿板，greinierPN655209,200ul一孔加入预湿缓冲液!IIx../.；oc)ooooooor宓样品板)0000。"OOOCC%10QQ0<20OQGQOC■k•将预湿板放到蓝色的底盘中（A1位置卡住），然后将传感器放到预湿孔相应的位置的绿色盘（传感器盘）上，然后将绿色盘插入到蓝色盘上。!II■k•然后按照下图将传感器盘（凹面朝内）和样品板（A1位置右上角）放入仪器中，关好仪器门。注意：样品板一定要紧贴在shaker上!！加样注意点：1）预湿缓冲液，复性缓冲液，reference以及标准品稀释液都应该用分析物同样的缓冲液或者基质，所有缓冲液以及样品的体积不得少于200ulo2）将样品稀释到检测范围中，比如1-500ug/m,稀释液为fortebio公司的samplediluent缓冲液。配方为0.02%tween20,0.1%BSA,PBS,如果自配，不能保证其质量。3）标准品不需要每个实验都做，如果分析物和实验条件一致（比如实验时间和缓冲液）可以调用以前的标准曲线，但是传感器必须是同一个批次4）建议每次实验加入数个阳性对照，比如100ug/ml，设定可接受范围为90-110ug/ml。作为实验有效性的判定依据。比如某次实验检测结果为80ug/ml，则说明该次实验结果不可信。5）再生缓冲液一般在pH1.5-2.0的10mM甘氨酸缓冲液2程序设定打开仪器门前必须确定仪器在ready状态（请检查instrumentstatus窗口）。打开操作软件前请确认仪器门关闭，在桌面上点击，在wizard中点击basicquantitationwithregenerationNewQjantiktionExperimentBasicQuanttatonaBasicQuantitationwitiRegen已「日ticinAdvancedQuantitatian然后点击22.1样品板和程序设定：在platedefinition中根据样品的实际加样位置设置样品板Stepl:选中需要设置的孔，选中方式可以为1）拖鼠标选择某个区域2）单击3）按ctrl连击4）按shift选择某个连续区段5）右击cleardata去除点击以下图标，选择样品的种类。St：±TLil；iLrdUriknowFLStandard:标准品Unkown:未知样品、待测样品St：±TLil；iLrdUriknowFLReference:阴性对照样品Step2在右边的表格中必须输入标准品的浓度信息。以及dilutionfactor（稀释倍数），sampleID等信息。可选：在assaysetting中设置实验参数注意，一般不需要改动这些参数。点击assaysetting出现以下对话框As:ayParismciersA颂址心gAssa7paaiftetersBaacQuantiationssithRegeneratonAnbHHurrisnFab<HL(FABjwthrEoeneraaonHighsEnsitivitrassov「egt”前onProlehL-5tanda-drang=>l^tandartiAsaayl>4'Sin^Eana^teMulli口也司a/tERepicaleipeltar-fitirlice:RegeneraiioFi：NeiAralEabon:Tnrh.l叩4ShakeTpred

40D刁BLeindicatesabJlt+iassay.BelwBEfl羽waysteps:JPia<tihdlicinieritcitPotKtindlionsen±or±RegBr-fr^oncycles:J±1Quantitation,regeneration,Neutralization的时间和转速Betweenassaysteps:设置再生的重复次数，如果设置为3，5秒的regeneration^秒的Neutralization，共3次循环Pre-conditionsensors:检测第一列样品前再生一次Post-conditionsensors:检测最后一列样品后再生一次2.2传感器位置设定Stepl在sensorassignment中选择传感器位置。比如传感器在第四列，则把第1列到第3列选中，按remove（或者右击remove）即可。此时如果要选中第二列，则点击illSensorTrayHReplacesensorsintrayafteruse12345E~3~9~~1112翱娈腹■□□□□□□□口贸恣恣［!□□□□□□□□翌幽固ECO□□□□□□/芯瑟日□口口口□□口口黝箴旎日□口口口口口口口踌薮固⑴□□□□□□□□faBCDEFGHLegend:口UnassignedsensorsMissingsensorsStep2:在右上角的以下对话框中选择传感器的重复使用次数，pre-condition/post-condition的次数不计入内。RegenerationsTimessensorswillbereused:斗CApply可以在reviewexperiment里面，点击箭头，浏览整个实验。但是在这个界面里无法对实验参数进行修改。如果发现有错误，回到前面界面进行修改。2.3Runexperiment设置Stepl目录设置在下面的位置输入原始数据的根目录和子目录Kineticsdatarepository:根目录E>penrnentrUnname(SUbdireCtOrV)：子目录(原始数据目录)可选/DelatedewperimentstarlStartafter(s);颈：实验延迟时间，传感器预湿需要10分钟左右，从传感器放入预湿溶液中开始计算，如果传感器在缓冲液中已经泡了足够长时间，可以不使用这个步骤。/Shakesampleplatewhilewaiting延迟时是否样品板震动JSetplatetemperature实验温度设置，一般在30度。Step2:设置完毕后，点击，实验开始（点击前必须保证仪器门关闭）。在点击GO后，该方法文件以*.fmf的后缀放在原始数据文件夹中，可以通过fileopenmethodfile打开。2.4实时曲线此时，会出现runningtimebindingchart，显示实时的结合曲线，可以进行以下操作。IQ七站实验停止。3结果分析打开分析软件打开分析软件Stepl保证loadeddata的quantitation中没有其他数据，可以右击quantitation，点击removeall.E)-ij-LoaiedDatai|EineticsOpenExplorer...Remt>veAllMaskData...Step2在左下角找到需要处理的原始数据文件夹，在左上角双击打开Step3在上面中点击referencesubtractionaverage中的all/ReferenceSubtractionAverage□AllEorColuniR可选可以在右下的样品表格中，1）修改浓度信息l'rUte11）修改浓度信息l'rUte1nAProteinAG4Pvi-i+ir.hl-Ti'1hu1寥1MT.-ri'HbU2）修改样品的类型右击改样品，然后改变其类型。ChangetoStanderdChangetoUnknownChangeto-ControlChange危nIRe^fe-rre-nce*EditSc-nsqr/SampleInformartian]—SertCcjlor..rSetColorByGroupSrtColorEySizeColumn'sByTitleSize-Column-5EyDataSize-ColumnsE-yBothSetColumnDrdo-ri.1PrintPageSe*-tup..u.PrintPreview.™CopyToClipboardStep3独suits进入Results中Data独suitsStep4选择standardcurveequation一般为pointtopoint没有标准曲线的实验必须首先导出标准曲线，LoadEt：ELTLil：±l_没有标准曲线的实验必须首先导出标准曲线，LoadEt：ELTLil：±l_ils...点击，选择需要导出的标准曲线文件（*.fsc）。Step5选择bindingrateequation一般为initialslope有信号放大的方法选择RequilibriumStep6确认无误后，点击C=alcul：=LthEindirkgR：±te!每个孔的浓度会计算出来，列举在右下的表格中。其中KnownConc.:已知浓度，仅对标准品WellConc.：孔中样品浓度CalculatedConc.：计算浓度，为孔中样品浓度X稀释倍数Residual：残差，仅对标准品，即计算浓度和实际浓度的差值一般大于0.98r2：每个样品的起始斜率的拟合度，反应了该样品的结果可信度，一般大于0.98可以选择tablecolumn的wellconcentration在每个孔的位置对其浓度进行标识。如果需要保存标准曲线，点击脆共如果需要保存标准曲线，点击脆共火曲界•，保存一个格式为*.fsc的文件。Step7点击我作RmwN,,,，导出报告。

补充：capture法定量方法设定（仅限于8.1以上的版本）Capture法定量介绍：先将抗体固化在传感器上（一般为roA,proG,AMQ传感器），然后结合分析物，通过分析物的结合速率对分析物浓度测定的方法。比一步法多出抗体固化的步骤。传感器位置设置和分析方法是与一步法是相同的，这里只介绍操作软件中步骤的设置。选择AdvancedquantitationNewQuantitationNewQuantitationExperimentEasicQuantitatianEiasicQuantitationwithRegenerationaAdvancedQuantitation在platedefinition中的assaysetting中点击modify然后在右边的assayparameters中按照下面设置steptype,并点击regenerationAssayParametersStepTypeTime(s)Shake(rpm)StepOptions：StepTypeTime(s)Shake(rpm)StepOptions：©CaptureAntibody120400@Buffer120400叱Reusebuffe0Sample]l20400|-OfflineoSinglearial^teMultipleanalpteReplicatespersensortype:1InsertRemove■/Regenerahon.…,Time闾；Shakespeed(rpm);Fiegeneration;510CONeutralization:5ioco:El已t同已已nsteps:Reqerierdticncycles：:3却Pre-conditionsensors3/Post-conditionsensorsH一CaptureAntibod