EGCG与淀粉样纤维的作用英文文献翻译版

EGCG对多肽淀粉样蛋白的形成重定向后转变成为无定形结构，从而阻断了寡聚体的形成富含6折叠的淀粉样纤维或者聚集体的累积过程是非常复杂的，与细胞毒性相关的多级过程和许多人类蛋白错误折叠病相关，包括：帕金森病、阿尔兹海默症。这个过程涉及到各种各样的中间体，例如：短暂的、永久的、on-andoff-pathway中间体的形成，这些中间体的结构、大小、细胞毒性和规模都尚不清楚。在本文章中我们证明，通过一些小分子的反应可以对淀粉样纤维的形成进行重定向，从而使得off-pathway，具有很高稳定性的聚集体的生成。多酚化合物EGCG可以直接和自然为折叠的多肽结合，阻止了多肽进一步转化成为有毒性的、和on-pathway的中间聚集体，从而有效的抑制了@-突触核蛋白和6-淀粉样蛋白的原纤维的生成。这中无定形结构的生长代替了富含6折叠的淀粉样纤维，一种新型的没有毒性的@-突触核蛋白和6淀粉样蛋白的聚集体被提出，表明在神经退行性疾病中相似的聚合途径是通用的。许多蛋白质有不同的序列、结构和自我组装成形态上类似与富含6折叠的纤维聚集体，组装形成的纤维聚集体统称为淀粉样纤维。淀粉样纤维的形成与蛋白质的错误折叠有关，包含神经退行性疾病。例如：阿尔兹海默症、帕金森、亨廷顿。从功能上来看，这个过程包含了无数个生理学过程，例如：基因调控过程、长期记忆或黑色素体生物合成。尽管淀粉样纤维的组装对健康和疾病有非常重要的影响，对这个复杂的过程进行一个全面的理解仍然存在许多困难。尽管会联想到其他蛋白的聚合过程和聚合方法，例如：肌红蛋白和微管蛋白，在大多数情况下淀粉样纤维的形成不能简单的用成核聚集模型进行描述，如有些淀粉样蛋白可以完全不用经过成核阶段聚集形成聚集体。事实上，通过观察不同种类的蛋白中间体的聚集状态，发现淀粉样蛋白的自组装更加的复杂。球形低聚物和蠕虫状的结构经常被认做是原纤维，已经被认为是组装过程中最关键的中间体。然而，这些有毒低聚物的结构、大小、形态至今还没有被充分的说明。然而，在这期间，off-pathway的低聚物和原纤维已经被报道。最近提出的实验结果显示，竞争自组装途径决定了6微球蛋白纤维的形态，表明淀粉样纤维的形成不是一个线性过程而是一个多途径过程，这个过程中涉及到数量不等、稳定性不同、和许多亚稳态的聚集产物。其最决定性作用的是原纤维中间体，它在纤维组装过程中起着非常重要的作用，这些中间体已经广泛的被认为与蛋白错误折叠后的毒性相关联。许多研究表明，在蛋白质聚集的过程中，淀粉样纤维通过构象转变伴随或者着淀粉样纤维的自组装。例如，自然未折叠的多肽淀粉样6蛋白和@-突触核蛋白，开始在溶液中是处于一种随机卷曲的自然结构。然而，在纤维化过程中，他们的结构转变成为6折叠构型，表明6折叠结构的形成驱使了淀粉样纤维的自组装过程。这个结论通过分子动力学自组装模型证明，6折叠的构象增加了淀粉样原纤维的稳定性。X衍射-纤维衍射研究揭示了合成的@-突触核蛋白和A6淀粉样蛋白的纤维丝是交错的6折叠构象的特点，表明淀粉样纤维通有的结构组成是氢键连接的6折叠结构，而6折叠结构的趋势是垂直于长纤维轴。研究发现表明，淀粉样纤维的稳定性的主要作用是涉及多肽链主链之间的氢键作用，这就可以解释形成纤维的有不同序列的多肽链有相似的形态和结构。实验证明，淀粉样纤维的形成过程可以用分子伴侣和小分子进行修改。分子伴侣Hsp104,对于酵母阮病毒的传播是非常关键的，例如，分子伴侣Hsp可以在体外明显的增强Sup35和Ure2自发的组装。通过催化成核聚集为媒介形成种子，是淀粉样纤维形成的关键步骤。亨廷顿淀粉样蛋白的聚集体是亨廷顿疾病中最关键的疾病蛋白。与Hsp104相比，分子伴侣Hsp70和分子伴侣Hsp40阻止了与SDS稳定的自组装，在多聚反应的滞后期这种反应会增加。用Hsp70和Hsp40处理的聚集反应中，可溶的无定形蛋白聚集体代替了淀粉样纤维产生了非常有效的聚集，表明分子伴侣可以对淀粉样蛋白或多肽的聚集过程重定向，转变成为非淀粉样蛋白自组装。最近，在体实验显示了分子伴侣TRIC对淀粉样蛋白的形成是一种潜在的调节器。TRIC和Hsp70和分子伴侣Hsp40一起可以阻止亨廷顿原纤维的形成，但是却刺激了一些可溶性的多聚谷氨酰胺包含有新型的亨廷顿低聚物的自组装。这些结构没有毒性，但是可能会导致聚集通路的形成。一些小分子可以有效的影响淀粉样纤维组装的方式已经被广泛的证明。一些有机渗透剂，例如：三甲胺N-氧化物或甘油可以在体外大幅度的加速P原纤维的形成，这些化合物被认为可以改变淀粉样蛋白多肽之间的水合作用，创造一种热力学不稳定状态从而增强了6折叠的形成。相反，一些化合物例如多巴胺和卡米达佐氯化物可以有效的阻止淀粉样原纤维的生成。可能是通过稳定原纤维聚集体，即生成成熟纤维最关键的前体。这些化合物可能会干扰淀纤维形成级联系统的最后阶段，也可能会增强纤维聚集通路、毒性聚集体中间体的积累。最近也有报道称，一些物质可以选择性的抑制6淀粉样低聚物的生成而不是原纤维，表明这个假说是不独立的，竞争聚集通路与某些特殊的目标化合物相关。在这项研究中，我们研究了淀粉样纤维的形成通路是否可以在小分子的辅助下进行重定向。最近的研究证明EGCG强有力的抑制亨廷顿蛋白和@突触核蛋白的聚集，从而影响寡聚体的自组装。怎么理解这些寡聚体的结构和形成，然而，他们的on-pathway或off-pathway的聚集产物仍然是未知的。在本篇论文中，通过生物化学、生物物理学和细胞生物学的方法证明了EGCG可以调整@突触核蛋白和A6淀粉样蛋白的纤维形成过程。这个化合物可以直接和为折叠的天然多肽结合，阻止蛋白向淀粉样纤维的低聚物和原纤维通路的转变。反而是组装成了包含EGCG更高稳定性的球形低聚物。在淀粉样纤维聚集的早期，这些物质之间相互作用，对未折叠的蛋白质分子进行重定向，在他们形成淀粉样纤维的前期提供了一条可能的聚集途径。结论：EGCG可以促进AS低聚物的组装

的条件下进行孵育（如图,首先，我们运用了THT结合技术分析了EGCG对AS聚集过程的影响，纯化并经过标记的AS蛋白在添加了EGCG和没有添加色研影长度为0.5-2um（如图1C所示），EGCG我们检测了在485nm处发所示）射的THT荧光的强度来检测原纤维的生成。（如图b所示）。在没有EGCG的条件下，我们观察到了THT荧光增加，说明在滞后期10h后富含。折叠的AS聚集体增多，这个过程符合核依赖聚合机制和以前的研究结论一致。相反，在存在EGCG分子的时候，AS蛋白的聚集被抑制（图1b）的条件下进行孵育（如图,首先，我们运用了THT结合技术分析了EGCG对AS聚集过程的影响，纯化并经过标记的AS蛋白在添加了EGCG和没有添加色研影长度为0.5-2um（如图1C所示），我们检测了在485nm处发接下来，我们通过EM染究了EGCG对as原纤维形成的响，我们观察到初级as纤维的直径为5-15nm支持了THT和以前的研究结果。相反，EGCG的摩尔比为1：1和10：1的时候明显的降低了纤维的组装，有效的支持了无定形蛋白聚集体和平均直径大小为20nm的球形低聚物的（图1C和支持材料1）。因此，EGCG有效的抑制as淀粉样蛋白的生成，但是却会刺激紧凑的球形低聚物的生成。（图1C）

在其他实验中，EGCG对as聚集体的影响可以通过大小排阻色谱进行分析，未处理的as蛋白洗脱后的分子质量为51KDa（图不存在预期的分子量为14KDa的球形蛋白，但似乎是自然未折叠的更大更稳定的结构。增加as单体后EGCG—HOb'enl49—37.Id），支持了先前的结论即eEGCG处理过的样品中，洗脱出的分子量为500-1500KDa的可溶性低聚物。通过SDS和免疫印迹法证明这些低聚物是SDS-抗性结构，这种结构可以在浓缩胶电泳上进行染色（如图1d。3-7部分），表明通过EM染色观察到的球形颗粒具有高度的稳定性，在变性条件下不会进行组装。我们也检测到了一些小的as蛋白复合物，在34、68、102（图1d，8-13部分），表明用EGCG处理的样品单体中，asEGCG—HOb'enl49—37.Id），支持了先前的结论即eEGCG直接结合在自然未折叠的as上为了检测EGCG是否是直接结合在未折叠的as为了确认低聚物形成的顺序，我们采用了时间过程实验和通过SDS和银染实验来检测多聚体的形成。（图1e和支持材料2）。除了在17kDa处有as单体的出现外，用EGCG处理的样品孵育一小段时间后（2-8h）后，我们观察到了阶梯型的一系列分散的SDS结合的二聚体、三聚体和四聚体，分子量分别是在34、68、102.随着时间的推移，这些结构会自组装形成更大的蛋白质聚集体（＞250Kda），这个聚集体是一种亚稳态聚集体的且分子量非常大，没有办法进入凝胶色谱中进行分离。（图1e）这个说法也确认了球形的EGCG聚集体引发的as自组装会形成淀粉样纤维形成的通路中形成一种亚稳态的中间体。没有EGCG加入的时间实验中，通过SDS和银染的SDS-稳定的asEGCG直接结合在自然未折叠的as上为了检测EGCG是否是直接结合在未折叠的as上，我们采用了NBT染色检测的方法，这个反应可以检测蛋白与EGCG分子结合的颜色反应。如图2a所示，当有EGCG存在的时候，有一个紫色的as蛋白带在分子量为17KDa。而当EGCG不存在的时候，这个颜色反应不会发生。这表明了EGCG直接结合在未折叠的as多肽上，相互作用点是SDS的切口。用NBT染色发现，当一些蛋白折叠的过程中没有观察到EGCG的结合，例如：卵清蛋白、碳酸酐酶、糜蛋白酶原或溶菌酶，表明未折叠的多肽链对于EGCG的结合是必须的。为了调查这种可能性，用NBT染色检测变性和非变性处理后的BSA，EGCG容易于尿素变性处理后的BSA结合，而不是未被处理的蛋白（图2b）.为了研究EGCG是否直接与as单体的SDS-稳定态进行结合，时间分辨聚集反应运用NBT检测。as单体和SDS-切口的低聚物的紫色聚集物可以明显的可见。（图2C，支持材料2）表明在低聚反应阶段，化合物可以和所有的结构直接的结合。这些数据表明，在低聚物形成的过程中，as未折叠的自然构象会被保留。EGCG直接结合在as多肽的主链上CcEGCG1?024812'Time(h)IMW{kDa)116—82-64一4937一26CcEGCG1?024812'Time(h)IMW{kDa)116—82-64一4937一26-19-当as和BSA相比较时，我们的数据表明所有的蛋白都可以被EGCG所识别，尽管每种蛋白都有不同的氨基端序列。（如图2所示）这表明，这些化合物不会识别特定的序列，对所有蛋白来说都可以直接与多肽主链的结合是相同的。为了解决这个问题，我们采用了核磁共振技术（NMR）。首先，我们记录了存在和没有存在EGCG的条件下的as的一维光谱。与先前的数据一致，NMR分析证明了未处的）理的as是自然松散的蛋白。（如图3a）as这个现象对EGCG的共振的影响最为明显，在5.5、6.1、6.5ppm处。所观察到的逐步增宽现象是直接加入EGCG的结果。而两种化合物的光谱没有随着不同的时间变化，这个现象表明了EGCG和as是直接相互作用。（图2所示）在第二个实验中，我们记录了as和不同比例的EGCG二维的H1和15N光谱，（如图3b），通过仅仅控制包含的as的叠加光谱，揭示了共振逐渐变宽，这个现象在EGCG超过5倍和10倍的时候最明显。在等摩尔浓度下，as的C端共振浓度消失，表明化合物易于与蛋白质高自由度的区域进行结合。在EGCG：as的比例为5：1时，有一半的光谱消失，正如预期的一样，有聚集体的形成，这些聚集体的光谱太宽以至于无法看到。位于as中间部分序列的共振信号依然保持可见，尤其是EGCG产生的所有小的选择谐振都向上场移动，表明一旦与化合物的环发生作用，由于受到特殊的几何学转变的影响，受到当前转变的影响。等摩尔率条件下的多种化学转变在已经观察到，但是随着EGCG的过量而增加受影响的共振沿着在AS序列扩展而不与氨基酸类型的任何明显的相关性，这表明，在过量，EGCG不形成在AS分子的特定区域局部相互作用而是随机地结合到蛋白质的主链基团。所有的蛋白都向上场移动，没有表现出特殊的情况，说明没有跟特定的氨基酸序列有关。EGCG阻止了^折叠的形成先前的实验和理论研究表明，6折叠结构的形成在淀粉样纤维阶段是非常关键的（图1a）。我们研究表明EGCG通过阻止蛋白的随机结构向淀粉样?折叠的构象转变，阻碍了as原纤维的形成。为了检测这种假设，我们将用EGCG和未被EGCG处理的样品使用圆二色谱实验检测，和先前的实验结果相似，我们发现未被处理的as和处理后的蛋白在200nm-210nm之间有一个明显的负峰（图4a）。然而，as蛋白聚集体在220nm处的负峰逐渐的消失。因此，在as的圆二色谱中，as经历了聚集构象的从随机结构到富含6折叠的转变。然而，用EGCG处理的样品中，会以剂量依赖的方式阻止构象的转变。EGCG会促进无毒、off-pathway低聚物的形成先前的研究已经说明，预形成的淀粉样蛋白原纤维中的6折叠结构具有传播纤维种子的能力，也可以转变成为非聚集的、同源的多肽在水溶液中形成稳定的聚集体。为了检测EGCG-as纤维聚集体是否是纤维形成中的必须的，还是阻止纤维形成的聚集体产物。我们采用了在原有的as纤维和EGCG-稳定的低聚物中加入纤维种子的实验。两种等量结构中加入过量的as蛋白的多聚物和形成淀粉样纤维使用THT实验检测。as低聚物形成的淀粉样纤维经过超声后可以形成有效的纤维种子而EGCG稳定后的低聚物没有这样的效应。这表明EGCG作用产生的低聚物并非是未聚集蛋白转变成为淀粉样纤维的功能模体，因此，很可能是一种0ff-pathway的聚集体。最近的研究表明，原纤维as寡聚体可以被特异性结构的抗体A11检测。因此，我们检测在用EGCG处理过这个反应后，是否还会有这个结构的产生。运用时间分辨的斑点印迹实验，我们发现加入EGCG的与A11反应的纤维寡聚体的形成能够有效的被抑制，但是在没有加入EGCG的样品中却没有相同的现象。（图5b）。在孵育4-6小时后的阶段中，淀粉样低聚物的含量会剧增，经过24小时之后，这中低聚物无法再被检测到，而此时纤维的组装也达到了它的高峰期。这个现象支持了以前的研究结果，他们是瞬间的聚集中间体，这些中间体随着时间会进化，并且会伴随着成熟纤维的形成而减少。运用可多克隆控制抗体as-D可以识别as的独立构象，对EGCG处理和EGCG未处理的as蛋白进行检测。

为了调查，EGCG处理得到的低聚物是否会对哺乳动物的细胞的有毒性作用，我们进行了标准化的3-（4,5-二甲基-2-基）-2,5-二苯基漠（MTT）与PC12细胞37的还原测定。我们在体外制出有很低THT荧光强度的球形as-EGCG低聚物和有很高的THT荧光强度的富含6折叠的淀粉样纤维。在这些结构中添加了不同浓度的PC12细胞。和先前的实验结论相同，了不同浓度的PC12细胞。和先前的实验结论相同，as原纤维、纤维和THT反应的混合物会引起MTT明显的减小，显示出了细胞毒性。（图5C），已经有强烈的对比，我们观察到在PC12细胞中添加了一定数量的荧光强度比较低EGCG-产生的低聚物或者as蛋白单体（支持材料6），表明基于细胞检测实验中EGCG稳定产生的结构与不容的富含6折叠淀粉样纤维有更小的毒性。EGCG阻止。淀粉样原纤维的形成我们的研究表明：EGCG可以识别未折叠的多肽，对于所有蛋白来说都是直接结合在主链上。这表明EGCG可能会抑制其他有聚集倾向的自然没有折叠的多肽形成原纤维，例如：A6、单独的淀粉样多肽或者是牛磺酸。这里我们检测了EGCG对淀粉样01-42（选择这个蛋白质有一定的原因）原纤维形成的影响，P1-42被认为是AD的发病机理。我们在未聚合的A6多肽中加入不同浓度的EGCG，用THT荧光检测淀粉样纤维的形成。在没有EGCG的时候，在1h的滞后期A042形成了THT聚集体的荧光，而在有EGCG的时候，我们即使是在A0超过EGCG10倍的时候，观察到一个延长的滞后期且荧光强度消失。（图6a）接下来，我们通过电子显微镜研究了A642聚集体的形态。经过EGCG与A642（1：1、10：1）摩尔比处理72h，我们主要观察到了大部分的球状粒子和无定形结构。（图6b），相反的是，没有处理过的聚集反应观察到了典型的A642原纤维和纤维。支持了先前的实验结果。、用SDS和银染的方法对聚集反应进行随着时间的变化进行研究，表明EGCG结合的A642低聚物是保持在凝胶中的高分子量的SDS-稳定结构。（图6c）。总之，在低聚反应过程中，一些小分子低聚物可以进入凝胶检测。在没有EGCG存在的情况下，在相同的条件下，24小时内没有检测到SDS-稳定的A642结构。NBT染色实验证明EGCG是直接与未折叠的A042单体结合且有SDS-稳定的低聚物，与

未折叠的as蛋白有相同的现象。我们又运用了纤维种子实验检测EGCG与AP结合形成的低聚物是on或者是off-pathway的聚集产物。超声过的A。纤维可以促进了原纤维的生成，0Noseeds■Fibrillarseeds鼻EGCGstabilized而EGCG-结合的聚合物不会。（图7a），我们运用THT检测包含超声反应的淀粉纤维与未折叠的AP42单体与不同浓度的EGCG0Noseeds■Fibrillarseeds鼻EGCGstabilized*EGCGstabilizedEGCG超过AP42淀粉样纤o111圳9响8「时网维5倍时，能够完全抑制AP42淀粉样纤维的生成，而在反应物浓度等摩尔比的条件下，聚合作用被部分抑制，表明EGCG阻止纤维种子AP42纤维的形成具有浓度依赖的效应。我们也通过特异性结合抗体A11斑点杂交实验，检测了是否有EGCG-结合的AP低聚物。在用EGCG处理过的样品中，没有A11免疫性单体的出现。但是在未被处理的聚集反应中经过6-24h后就能很容易的被检测到。这表明EGCG稳定的AP42单体在结构上与之前描述的淀粉样单体的结构不同。最后，我们通过MTT检测了EGCG-Ap结合单体的毒性。预成型的纤维、具有THT反应活性的AP42原纤维会控制MTT的减少，但是当细胞与EGCG-处理后寡聚体和AP42单体一起孵育后，却没有观察到这个现象。（图7d所示）。基于这些结果，我们研究证明EGCG是属于通用型的淀粉样纤维形成过程中的调节器，它可以结合到未折叠的具有以及氨基酸序列的多肽链上，而且可以将他们转化成为一种新型的无毒性的、无定形的、off-pathway低聚物。讨论：as聚集过程的重定向以前的研究认为蛋白质的疏水核心是主要驱使as发生纤维化。相对稳定的as结构类似环状结构，这样可以将聚集区域NAC与环境屏蔽开阻止了原纤维的生成。我们的研究证明EGCG可以稳定未折叠并自然展开的as蛋白，增强了蛋白中分子之间的自抑制作用。因此形成了高稳定性的球形低聚物。表明：化合物对易发型聚集分子的聚集方式进行重定向。与淀粉样串联反应不同。自发性的as聚集过程与EGCG介导的低聚反应相比，反应过程较慢，推测是两条聚集路径对未折叠的、单体as分子的竞争。富含P折叠的分子降低的可以解释为EGCG-蛋白复合物的快速组装的形成低聚物造成的。EGCG对自然为折叠的as分子形成SDS-稳定性低聚物的机理不稳定。用EGCG处理的as蛋白的C端共振信号消失。这表明，化学物易于与蛋白中长期存在的中间分子结合。EGCG是一种芳香族化合物有大量的羟基，表明EGCG也许会引起在as单体之间的分子之间的反应，通过涉及到的羟基形成的氢键连接。在这种方式中，这个化合物的作为一个分子拉链和种子的作用驱使EGCG包含的的球形as低聚物的自我组装。然而，也可能与其他作用力因素有关，例如：氢键堆积和疏水作用。我们的NMR表明，EGCG的介导as低聚反应中，NAC的共振信号在很长的一段时间内都能看见，这表明在as的疏水中心驱使原纤维的形成并对成熟的纤维有一定的保护能力，但是不会刺激EGCG为中介物的低聚物的生成。包含EGCG的低聚物的NAC易于聚集端也许会形成一个拥有蛋白C端的疏水簇，这个疏水簇使得蛋白与蛋白分子之间不能很好的接触。除了自发的纤维化，EGCG以浓度依赖的方式阻止了AP和as的种子聚集，这和我们的研究结果是非常接近的，这表明EGCG稳定的单体和低聚物没有和纤维种子一样的结构并且不会形成淀粉样6折叠结构。这种结论对EGCG作为潜在的药物研究有非常重要的作用，因为这个实验表明化合物可以抑制淀粉样纤维化，即使在人体中已