mRNA差异显示技术DD及其对动物育种的作用曲亮黄瑞华课件

南京农业大学动物科技学院曲亮南京农业大学动物科技学院曲亮1mRNA差异显示技术（DD）及其对动物育种的作用曲亮黄瑞华*邱新深刘红林王林云(南京农业大学动物科技学院，南京，210095)

基金项目：江苏省高技术研究项目（BG2005304）mRNA差异显示技术（DD）及其对动物育种的作用曲亮黄瑞2DD的发明及其基础由Liang于1992年创立是分离差异表达基因强有力的工具在随后几年里，Liang等在技术方面做了大量改进，使技术更适用、更简便基于RT-PCR理论，依赖于3种技术1）RT-PCR技术2）以特定引物进行的PCR技术3）DNA电泳技术

DD的发明及其基础由Liang于1992年创立3DD的原理DD的原理45’M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’Poly(A)RNA5’T12MN3’锚定引物逆转录5’M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’3‘MNTTTTTTTTTTTT5’变性5’M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’3‘MNTTTTTTTTTTTT5’退火5‘T12MN3’锚定引物寡核苷酸随机引物3‘MNTTTTTTTTTTTT5’延长dNTP、Taq聚合酶3‘MNTTTTTTTTTTTT5’5’M’N’AAAAAAAAAAA3’变性、退火、延伸电泳显示T12MN(M为A、G、C，N为A、T、G、C)

启动cDNA第一链合成不同长度的PCR产物回收差异条带，再扩增，克隆测序，同源比对随机结合到cDNA链上5’M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’Poly5DD目前的应用领域主要用于医学研究的癌症、神经、骨科、病理、生殖等领域动植物遗传、育种，动物营养及微生物等领域DD目前的应用领域主要用于医学研究的癌症、神经、骨科、病理、6DD的优点以RT-PCR和DNA凝胶电泳为基础灵敏度高，仅需0.2μg的总RNA可以同时比较多个样品间基因表达的差异可以同时检测到“上调”及“下调”的基因时间短，实验过程中可步步验证比较可进行多基因家族的表达分析DD的优点以RT-PCR和DNA凝胶电泳为基础7DD的缺点假阳性高样品mRNA可能有部分降解有少量的DNA污染单条带可能由一种以上cDNA片段所构成有些特异cDNA片段太短,在Northern杂交时检测不到杂交信号PCR扩增了一些稀有mRNA片段,在杂交时显示不出差异表达的信号绝大多数差异条带仅含有3’-UTR500bp以内的一短片段的信息，这些区域的序列结构相对保守，得不到特异的基因对低丰度mRNA检出率低DD的缺点假阳性高8DD技术改进针对以上不足,特别是假阳性率高的缺点，从以下几个方面做了大量改进：引物设计反应条件的优化显示方法假阳性鉴定DD技术改进针对以上不足,特别是假阳性率高的缺点，从以下几个9DD在动物育种中的应用比较不同品种间的差异寻找数量性状QTL侯选基因研究杂种优势机制

比较世代间的差异

DD在动物育种中的应用比较不同品种间的差异10DD在现代动物育种中的应用展望目前主要致力于两个品种或组合间比较我们在苏淮白猪选育中的应用思路：提高各世代猪群生产性能的遗传稳定性，建立和完善繁殖性能和肉质性状的DD技术分析新品系内不同优点的家系或类型间的遗传相关检测新品系猪与其它品种猪的遗传距离DD在现代动物育种中的应用展望目前主要致力于两个品种或组合间11衷心感谢各位与会者衷心感谢各位与会者12引物设计mol等将12种锚定引物变为4种，并发现G的扩增效果最好王夏等在T12MN之前加上了一段T7启动子序列，提高了PCR反应的严谨性Liang发现9~10个mer长度的随机引物比较适宜Liang还发现，当长度为13bp，在5’端增加HindⅢ酶切位点，能更有效的扩增，并能提高特异性引物设计mol等将12种锚定引物变为4种，并发现G的扩增效果13反应条件优化RNA模板量在2-3μg时，能扩增出较多的条带不同条件下dNTP浓度不是固定不变的1.5-2.0mmol/L的Mg2+浓度效果较好40-42℃的退火温度通常能得到较好的扩增效果，周宁新等在PCR的头两个循环，用低严谨的退火温度36℃，在随后的循环中退火温度提高到45℃，获得了很清晰的电泳图谱反应条件优化RNA模板量在2-3μg时，能扩增出较多的条带14显示方法最初DDRT-PCR通过放射性同位素在变性胶上进行放射自显影成像Sanguinetti介绍了一个快速银染方法，只需15分钟，而且容易克隆回收Rompf等通过琼脂糖凝胶电泳分辨差异cDNA片段余桂华等建立了荧光mRNA差异显示方法，最大限度地降低了假阳性显示方法最初DDRT-PCR通过放射性同位素在变性胶上进行放15假阳性的鉴定Northernblot仍是鉴定差异的一个主要手段；分析较多条带，反向Northernblot是较为切合实际的选择Heinz通过SSCP分析排除了非差异表达的cDNA污染Callard把纯化后的PCR产物分成两部分:一部分用于克隆，另一部分用作探针杂交以筛选克隆Sompayra设计了向5’步移的方法假阳性的鉴定Northernblot仍是鉴定差异的一个主要16比较不同品种间的差异Pan等应用DD寻找杜洛克和二花脸猪背最长肌中差异表达的mRNA，对10条差异表达cDNA克隆、测序，有6条cDNA显示与GenBank上已鉴定的基因类似，另外4条是未知基因比较不同品种间的差异Pan等应用DD寻找杜洛克和二花脸猪背最17寻找数量性状QTL侯选基因Janzen等用DD分离的差异表达cDNA片段与猪ARPP-16转录物的3‘末端一致，试验组猪ARPP-16的表达量比对照组高4倍,提示猪ARPP-16基因可能在猪肌肉生长中起重要作用S.Ponsuksili应用DD方法寻找猪眼肌面积的可能侯选ESTs，构建4个RNA池，显示了27条非共有条带，有2个克隆显示与已知基因有高同源性，2个克隆与EST序列相似M.D.Li等应用DD方法发现梅山猪的TSH-β基因过量表达，大约为成年WC猪的3倍，推测β亚基的过量表达很可能是梅山猪比白猪合成系性成熟早的原因寻找数量性状QTL侯选基因Janzen等用DD分离的差异表达18研究杂种优势机制YGLiu应用DD技术研究两个杂交组合背最长肌中基因表达的差异，观测到8个不同的典型表达模式，相关性分析表明，大白、梅山正反杂交组合与母体效应有关，而在大白、长白杂交组合中，父本效应在杂种的基因表达中起作用，或基因表达偏向于某一亲本Liu(2005)等在研究大白和长白杂交组合背最长肌中基因表达的差异时，发现了一个猪的新基因，命名为猪的CA-Ⅲ基因，他催化可逆的二氧化碳水合作用，但还不确定与杂种优势是否相关研究杂种优势机制YGLiu应用DD技术研究两个杂交组合背19比较世代间的差异Ren等研究了梅山猪和大白猪及其正反F1代杂种猪背部皮下脂肪组织间的基因表达情况，4条EST分别与GenBank序列同源性较高，其余36条EST在亲子代之间的差异表达方式不尽相同比较世代间的差异Ren等研究了梅山猪和大白猪及其正反F1代杂20南京农业大学动物科技学院曲亮南京农业大学动物科技学院曲亮21mRNA差异显示技术（DD）及其对动物育种的作用曲亮黄瑞华*邱新深刘红林王林云(南京农业大学动物科技学院，南京，210095)

基金项目：江苏省高技术研究项目（BG2005304）mRNA差异显示技术（DD）及其对动物育种的作用曲亮黄瑞22DD的发明及其基础由Liang于1992年创立是分离差异表达基因强有力的工具在随后几年里，Liang等在技术方面做了大量改进，使技术更适用、更简便基于RT-PCR理论，依赖于3种技术1）RT-PCR技术2）以特定引物进行的PCR技术3）DNA电泳技术

DD的发明及其基础由Liang于1992年创立23DD的原理DD的原理245’M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’Poly(A)RNA5’T12MN3’锚定引物逆转录5’M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’3‘MNTTTTTTTTTTTT5’变性5’M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’3‘MNTTTTTTTTTTTT5’退火5‘T12MN3’锚定引物寡核苷酸随机引物3‘MNTTTTTTTTTTTT5’延长dNTP、Taq聚合酶3‘MNTTTTTTTTTTTT5’5’M’N’AAAAAAAAAAA3’变性、退火、延伸电泳显示T12MN(M为A、G、C，N为A、T、G、C)

启动cDNA第一链合成不同长度的PCR产物回收差异条带，再扩增，克隆测序，同源比对随机结合到cDNA链上5’M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’Poly25DD目前的应用领域主要用于医学研究的癌症、神经、骨科、病理、生殖等领域动植物遗传、育种，动物营养及微生物等领域DD目前的应用领域主要用于医学研究的癌症、神经、骨科、病理、26DD的优点以RT-PCR和DNA凝胶电泳为基础灵敏度高，仅需0.2μg的总RNA可以同时比较多个样品间基因表达的差异可以同时检测到“上调”及“下调”的基因时间短，实验过程中可步步验证比较可进行多基因家族的表达分析DD的优点以RT-PCR和DNA凝胶电泳为基础27DD的缺点假阳性高样品mRNA可能有部分降解有少量的DNA污染单条带可能由一种以上cDNA片段所构成有些特异cDNA片段太短,在Northern杂交时检测不到杂交信号PCR扩增了一些稀有mRNA片段,在杂交时显示不出差异表达的信号绝大多数差异条带仅含有3’-UTR500bp以内的一短片段的信息，这些区域的序列结构相对保守，得不到特异的基因对低丰度mRNA检出率低DD的缺点假阳性高28DD技术改进针对以上不足,特别是假阳性率高的缺点，从以下几个方面做了大量改进：引物设计反应条件的优化显示方法假阳性鉴定DD技术改进针对以上不足,特别是假阳性率高的缺点，从以下几个29DD在动物育种中的应用比较不同品种间的差异寻找数量性状QTL侯选基因研究杂种优势机制

比较世代间的差异

DD在动物育种中的应用比较不同品种间的差异30DD在现代动物育种中的应用展望目前主要致力于两个品种或组合间比较我们在苏淮白猪选育中的应用思路：提高各世代猪群生产性能的遗传稳定性，建立和完善繁殖性能和肉质性状的DD技术分析新品系内不同优点的家系或类型间的遗传相关检测新品系猪与其它品种猪的遗传距离DD在现代动物育种中的应用展望目前主要致力于两个品种或组合间31衷心感谢各位与会者衷心感谢各位与会者32引物设计mol等将12种锚定引物变为4种，并发现G的扩增效果最好王夏等在T12MN之前加上了一段T7启动子序列，提高了PCR反应的严谨性Liang发现9~10个mer长度的随机引物比较适宜Liang还发现，当长度为13bp，在5’端增加HindⅢ酶切位点，能更有效的扩增，并能提高特异性引物设计mol等将12种锚定引物变为4种，并发现G的扩增效果33反应条件优化RNA模板量在2-3μg时，能扩增出较多的条带不同条件下dNTP浓度不是固定不变的1.5-2.0mmol/L的Mg2+浓度效果较好40-42℃的退火温度通常能得到较好的扩增效果，周宁新等在PCR的头两个循环，用低严谨的退火温度36℃，在随后的循环中退火温度提高到45℃，获得了很清晰的电泳图谱反应条件优化RNA模板量在2-3μg时，能扩增出较多的条带34显示方法最初DDRT-PCR通过放射性同位素在变性胶上进行放射自显影成像Sanguinetti介绍了一个快速银染方法，只需15分钟，而且容易克隆回收Rompf等通过琼脂糖凝胶电泳分辨差异cDNA片段余桂华等建立了荧光mRNA差异显示方法，最大限度地降低了假阳性显示方法最初DDRT-PCR通过放射性同位素在变性胶上进行放35假阳性的鉴定Northernblot仍是鉴定差异的一个主要手段；分析较多条带，反向Northernblot是较为切合实际的选择Heinz通过SSCP分析排除了非差异表达的cDNA污染Callard把纯化后的PCR产物分成两部分:一部分用于克隆，另一部分用作探针杂交以筛选克隆Sompayra设计了向5’步移的方法假阳性的鉴定Northernblot仍是鉴定差异的一个主要36比较不同品种间的差异Pan等应用DD寻找杜洛克和二花脸猪背最长肌中差异表达的mRNA，对10条差异表达cDNA克隆、测序，有6条cDNA显示与GenBank上已鉴定的基因类似，另外4条是未知基因比较不同品种间的差异Pan等应用DD寻找杜洛克和二花脸猪背最37寻找数量性状QTL侯选基因Janzen等用DD分离的差异表达cDNA片段与猪ARPP-16转录物的3‘末端一致，试