HXY-第四章-目的基因的获取

HXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第1页!第四章目的基因的获取目的基因：准备要分离、改造、扩增或表达的基因。HXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第2页!

基因克隆的本质是把某一目的DNA片段通过无性方式进行扩增和表达，而这一过程往往是通过载体和寄主细胞来实现的。

一般而言，基因克隆包括四部分工作：1、目标DNA片段的获得；2、克隆载体的构建；3、寄主细胞的转化；4、重组体克隆的选择和鉴定。

目前，以大肠杆菌为寄主，以质粒和噬菌体等为载体的基因克隆体系已经相当的成熟。HXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第3页!节

基因组DNA片断化一、限制性内切酶法用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片断。酶切HXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第4页!二、随机片断化1.限制性内切酶局部消化法控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。①内切酶识别位点的碱基数影响所切出的产物的长度和随机程度。（1）限制性内切酶的选用原则HXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第5页!2.机械切割法（1）超声波超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp的随机片断。（2）高速搅拌1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片断。HXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第6页!①

保护dNTP的5’端P或3’端-OH③

用酸或碱脱保护（1）原理1.磷酸二酯法②

带保护的单核苷酸连接保证合成反应的定向进行。带5’保护的单核苷酸与带3’保护的另一个单核苷酸以磷酸二酯键连接起来。HXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第7页!

将个核苷酸的3’-OH端固定在固相支持物上。

固相磷酸三酯合成法是目前通用的合成方法。15合成的二核苷酸连接处有三个酯键！HXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第8页!化学合成的DNA片断一般在200bp以内。二、

化学合成DNA片断的组装用T4多核苷酸激酶使各个片段的5’端带上磷酸。1.互补连接法预先设计合成的片断之间都有互补区域，不同片断之间的互补区域能形成有断点的完整双链。（2）5’端磷酸化（1）互补配对（合成的DNA单链的5’端是-OH）HXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第9页!2.互补延伸连接法预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作为另一个片断延长的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的双链。3’

5’

5’

3’

5’

3’

T4DNA连接酶Klenow片段引物HXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第10页!DNA合成仪5.合成人工接头或衔接物含有各种酶切位点人工接头（Adaptor）或衔接物（Linker）序列。EcoRIEcoRILinkerAdaptorHXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第11页!（2）目前常用的载体

2.构建基因文库的载体选用载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。（1）对载体的要求载体系列：

容量为

24kpcosmid载体：

容量为

50kbYAC：

容量为

1MbBAC:容量为

300kbHXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第12页!（2）载体与基因组DNA大片段的连接①

粘性末端直接连接载体与外源DNA大片段的两个末端都有相同的粘性末端。如：Sau3A与BamHI的酶切末端。直接连接、人工接头或同聚物加尾。②人工接头法（adaptor）人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。HXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第13页!HXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第14页!例如：人的基因组是

3×109bp，插入DNA片断的平均长度如果是1.7×104bpN=ln(1-p)ln(1-f)=ln(1-99%)ln(1-f)=4.61×GfN=4.61×GfG：Genome大小；f：fragment大小N=4.61×Gf=4.61×3×1091.7×104=8.1×105HXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第15页!（1）不含内含子序列。（2）可以在细菌中直接表达。（3）包含了所有编码蛋白质的基因。（4）比DNA文库小的多，容易构建。4.构建cDNA文库的一般步骤（1）总RNA（totalRNA）提取3.cDNA文库的特点提取总RNA有商业化的试剂盒（kit）。HXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第16页!HXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第17页!用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。mRNAcDNA3’

3’

5’

5’

反转录酶引物mRNAcDNA链3’

3’

5’

5’

引物cDNA链3’

5’

引物②

降解mRNA模板或RNaseH碱HXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第18页!这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小片断。方法二：妙用RNaseH小片断正好成为DNA聚合酶的引物，用来合成冈崎片断。DNAPolI除去引物并修补后再使用DNA连接酶连成一整条DNA链。HXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第19页!HXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第20页!HXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第21页!HXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第22页!三、文库的查询（screening）用目的基因探针与文库中的重组载体进行Southernblot杂交。文库载体探针电泳后杂交放射自显影测序分析HXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第23页!纤维柱探针DNA探针DNA探针DNA探针DNATotalmRNA纤维柱探针DNA探针DNA探针DNA探针DNA过柱与探针碱基互补的mRNA结合到柱上，其它mRNA流走。特异mRNA洗脱RT-PCRHXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第24页!从表达A蛋白和不表达A蛋白的组织细胞中分别提取和分离总mRNA。将表达A蛋白的mRNA合成cDNA链。再同不表达A蛋白的总mRNA杂交成cDNA-mRNA双链。不能杂交的cDNA就包括特异表达的A基因的cDNA单链。用羟磷灰石柱收集单链cDNA，合成为双链DNA进行扩增、克隆、测序。HXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第25页!3.mRNA差异显示PCR（DDRT-PCR）mRNAdifferentialdisplayRT-PCR（1）3’端的锚定引物Oligo(dT)引物的3’端加两个核苷酸（倒数第二个不再是T）。

AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3’

5’

NMTTTTTTTTM：A、GorCN:A、G、TorC5’

3’

HXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第26页!（3）5’端的随即引物10mer

AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3’

5’

NMTTTTTTTT5’

3’

扩增cDNA链。RTNMTTTTTTTT5’

cDNA3’

NNNNNNNNNN5’

3’

NNNNNNNNNN5’

3’

cDNA第二链，并PCRHXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第27页!（5）随机-锚定引物PCR的产物电泳比较不同组织的240组引物组合PCR产物在测序胶中电泳。选择有差异的带，进一步PCR作探针。筛选文库，找到差别基因的全长序列。HXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第28页!原核基因组部分原核细胞提取基因组DNAPCR扩增HXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第29页!目的基因的引物1反转录成目的基因cDNA链目的基因的引物2目的

基因cDNA第二链PCRmRNAHXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第30页!大肠杆菌作为寄主进行DNA克隆的实验方案DNA片段的获得载体构建细菌转化重组体的鉴定限制性内切酶消化机械切割双链cDNA的合成化学法直接合成同聚物加尾粘性末端连接平末端连接加接头造成粘性末端重组噬菌体DNA转染重组质粒的转化体外包装进行转导表型鉴定核酸杂交免疫学分析酶切鉴定HXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第31页!由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。1.优点2.缺点目的基因内部也可能有该内切酶的切点。目的基因也被切成碎片！BamHIBamHIBamHIgeneHXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第32页!1）4bp的内切酶平均每46（4096）bp一个切点。2）6bp的内切酶平均每44（256）bp一个切点。随机程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。②内切酶粘性末端能与常用克隆位点相连。（Sau3A—BamHI）HXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第33页!1976年H.G.Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。第二节

化学合成目的基因一、目前常用的方法磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法自动化合成法。HXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第34页!原理与磷酸二酯法一样。只是参加反应的单核苷酸都是在3’端磷酸和5’-OH上都先连接了一个保护基团。2.磷酸三酯法HXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第35页!固相磷酸三酯合成过程固相支持物结果是全保护的DNA：5’DMT,3’固相支持物,核苷酸之间对氯苯。最后脱保护固相支持物固相支持物CHXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第36页!T4DNA连接酶T4多核苷酸激酶使5’-OH磷酸化完整的DNA双链（3）连接酶连成完整双链HXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第37页!1.直接合成基因三、

寡聚核苷酸化学合成的优点2.合成引物（20mer左右）（1）mRNA的含量很低，很难作cDNA

3.合成探针序列4.定点突变合成合成带有定点突变的基因片断。（2）有些基因比较短，化学合成费用较低HXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第38页!

将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。

理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。一、基因文库的构建1.基因文库（genelibrary）第三节

目的基因的保存和扩增HXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第39页!断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。（1）染色体DNA大片段的制备3.基因文库构建的一般步骤超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）。

①

物理切割法：内切酶Sau3A进行局部消化。可得到10-30kb的随机片断。②

酶切法：HXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第40页!各种酶的接头可以向公司定做或购买。接上人工接头粘性末端CCCCCC末端转移酶粘性末端③同聚物加尾HXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第41页!4.基因组文库的大小一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。N=ln(1-p)ln(1-f)p:文库包含了整个基因组DNA的概率（99%）f:插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因组DNA的百分数N：所需的重组载体数（克隆数）HXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第42页!1.cDNA以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。2.cDNAlibrary二、

cDNA文库的构建mRNAcDNA3’

3’

5’

5’

反转录酶引物利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库。HXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第43页!分离mRNA用商业化的OligodT纤维柱。

利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。mRNA只占总RNA的1%-2%。（2）mRNA的分离纯化①原理②mRNA的分离纯化Column（柱）HXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第44页!反转录酶（3）cDNA的合成①cDNA链合成逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。用OligodT（或随机引物）作引物，合成cDNA的链。

mRNAcDNA3’

5’

5’

AAAAAAATTTTTTTOligodT引物HXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第45页!方法一：剩下的cDNA单链的3’末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA.。cDNA链5’

cDNA第二链合成DNA聚合酶cDNA链cDNA第二链5’

3’

③cDNA第二链合成HXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第46页!mRNAcDNA3’

5’

反转录酶引物mRNAcDNA链3’

5’

引物mRNAcDNA链3’

5’

mRNAmRNADNA聚合酶DNA聚合酶cDNA第二链cDNA链3’

5’

RNaseHDNAligase去引物HXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第47页!④去掉发卡结构核酸酶S1用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA中有用的序列被切掉！）。cDNA链cDNA第二链5’

3’

cDNA链cDNA第二链5’

3’

5’

3’

HXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第48页!在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’端分别加上几个C或G，成为粘性末端。5.cDNA与载体连接：接上人工接头粘性末端CCCCCC末端转移酶HXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第49页!6.cDNA文库的大小一个cDNA文库要包含99%的mRNA时所需要的克隆数目。N=ln(1-p)ln(1-)p:文库包含了完整mRNA的概率（99%）:某一种低丰度（不足14份拷贝）mRNA占细胞整个mRNA的比例N：所需的重组载体数（克隆数）1n1nHXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第50页!第四节

目的基因的分离和扩增一、目的基因的分离1.探针柱分离特异mRNA根据已知的基因序列合成探针，结合到纤维素柱上，用来分离纯化该基因的mRNA。富集特定基因的mRNA或cDNA模板。HXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第51页!2.mRNA消解杂交原理：羟基磷灰石柱结合单链DNA-RNA或DNA-DNA双链，不结合单链DNA。（Hydroxylapatitecolumn）HXY-第四章-目的基因的获取共58页，您现在浏览的是第52页!AAA组织B组织总mRNA（A）总mRNA（B）含蛋白A的mRNA不含蛋白A的mRNA总cDNA链A杂交内含蛋白A的cDNA羟磷灰石柱过柱吸收RNA-DNA单链滤过羟磷灰石柱BAPCR16cDNA文库HXY-第四章-目的基因的获取共58页，您