《DNA重组技术的基本工具》课件课件

基因工程专题1基因工程专题11设想一

能否培养出具有抗虫性状的抗虫棉呢？设想一能否培养出具有抗虫2每100kg猪或牛的胰腺中仅可提取4~5g。1979年，美国将人的胰岛素基因重组到大肠杆菌内，实现了细菌生产胰岛素，大大降低了生产成本。治疗糖尿病特效药——据WTO调查：2005年全世界约有糖尿病患者1.8亿人，我国约6000万。胰岛素思考：转基因技术实现了一种生物的某些性状在另一种生物中表达。这些性状的表达与我们学过的基因的什么过程有关？密码子在生物界是的！DNA(基因)mRNA蛋白质(性状)转录翻译通用每100kg猪或牛的胰腺中仅可提取4~5g。1979年3基因工程的产物基因工程的产物4什么叫基因工程？基因工程，又叫DNA重组技术。通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传特性。基因工程的概念什么叫基因工程？基因工程，又叫DNA重组技术5《DNA重组技术的基本工具》课件［课件］6《DNA重组技术的基本工具》课件［课件］7基因工程培育抗虫棉的简要过程：在以上过程中关键步骤或难点是什么？普通棉花(无抗虫特性)苏云金芽孢杆菌提取抗虫基因通过运载体导入转基因棉花含抗虫基因转基因棉花产生伴胞晶体转基因棉花有抗虫特性基因工程培育抗虫棉的简要过程：在以上过程中关键步骤或难点是什8基因工程培育抗虫棉的关键步骤：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来关键步骤二：抗虫基因与棉花DNA“缝合”关键步骤三：抗虫基因进入棉花细胞解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？基因工程培育抗虫棉的关键步骤：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽9解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？“分子手术刀”——限制性核酸内切酶关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来关键步骤二：抗虫基因与棉花DNA“缝合”关键步骤三：抗虫基因进入棉花细胞“分子缝合针”——DNA连接酶“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体1.1、DNA重组技术的基本工具解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？“分子手术刀”——限10一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”⒈主要来源：⒉种类与命名：⒊作用特点（特异性）4.限制酶识别序列5.作用结果：识别特定核苷酸序列，并且使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。主要从原核生物中分离纯化产生黏性末端或平末端大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，少数由4、5或8个核苷酸组成，是回文序列。一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”⒈主要来源：识别特定核11⒉种类与命名：现在已经从约300种微生物中分离出了约4000种限制性内切酶(限制酶)。EcoRⅠSmaⅠ粘质沙雷氏杆菌（Serratiamarcesens）大肠杆菌（EscherichiacoliR）Goback练习：流感嗜血杆菌的d菌株(Haemophilusinfluenzaed)中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ⒉种类与命名：现在已经从约300种微生物中分12T磷酸二酯键1234512345AT磷酸二酯键1234512345A13《DNA重组技术的基本工具》课件［课件］14限制性内切酶与DNA解旋酶的区别切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键将DNA两条链的氢键打开形成两条单链Goback限制性内切酶与DNA解旋酶的区别切割特定的核苷酸序列的磷酸二15限制酶的识别序列：Goback能被限制性内切酶特异性识别的切割部位都具有回文序列：在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。限制酶的识别序列：Goback能被限制性内切酶特异性识别的16限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中轴线（如图），中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称、重复排列的。想一想限制酶所识别的序列有什么特点？限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱17当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切开时，产生的是黏性末端。当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。当限制18

EcoRⅠ黏性末端黏性末端EcoRⅠ黏性末端黏性末端19

EcoRⅠ黏性末端黏性末端重复演示EcoRⅠ黏性末端黏性末端重复演示20什么叫黏性末端？被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。什么叫黏性末端？被限制酶切开的DNA两条单链21SmaⅠ平末端平末端GobackSmaⅠ平末端平末端Goback22二、DNA连接酶——“分子缝合针”1.作用:2.作用原理：3.类型：预习DNA连接酶回答下列问题二、DNA连接酶——“分子缝合针”1.作用:2.作用原理23二、DNA连接酶——“分子缝合针”1.作用:把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来.2.作用原理：催化磷酸二酯键形成二、DNA连接酶——“分子缝合针”1.作用:24可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，E·coliDNA连接酶或T4DNA连接酶即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，E·co25

T4DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低T4DNA连接酶T4DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效263.类型：E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源功能大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)相同点差别3.类型：E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源功能大27三、“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体1、载体的作用2、种类

3、载体需要的条件预习“分子运输车”回答下列问题三、“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体1、载体的作用28三、“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体1、载体的作用将

转移到受体细胞中去。目的基因2、种类

质粒（常用，最常用的质粒是大肠杆菌的）λ噬菌体的衍生物动植物病毒三、“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体1、载体的作用293、载体需要的条件：⑴有一个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接。⑵对受体细胞无害⑶能够在受体细胞中自我复制并稳定地保存⑷有某些标记基因，便于筛选⑶假如目的基因导入受体细胞后不能复制，转基因生物能有预想的效果吗？⑴作为分子运输车——载体，如果没有切割位点将会怎样？⑵霍乱菌的质粒有多个限制酶切点，你会用它来做分子运输车吗？

⑷目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？

3、载体需要的条件：⑶假如目的基因导入受体细胞后不能复制，30

1）质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并且具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。4、质粒是基因工程最常用的载体。

2）质粒DNA上有一个或多个限制酶的切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中。

3）携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，在细胞中进行自我复制，或整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制。1）质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外315）真正被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行人工改造的。

4）质粒DNA上有特殊的标记基因，如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。5）真正被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行人工改造的32能复制并带着插入的目的基因一起复制有切割位点有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别能复制并带着插入的目的基因一起复制有切割位点有标记基因的存在33《DNA重组技术的基本工具》课件［课件］34分组讨论下列问题1、限制酶存在于原核生物中的作用是什么？2、为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？3、要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？4、如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？5、DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？6、DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?7、天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？分组讨论下列问题1、限制酶存在于原核生物中的作用是什么？2、35寻根问底1、限制酶存在于原核生物中的作用是什么？原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。寻根问底1、限制酶存在于原核生物中的作用是什么？362、为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。寻根问底2、为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？通过长期373、要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？要切两个切口，产生四个黏性末端。4、如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？

会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。寻根问底3、要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产385、DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？

迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。寻根问底5、DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？迄今为39寻根问底6、DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?1)只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键1.形成磷酸二酯键1)在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键2)以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成一条互补的DNA链2)将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板2.化学本质都是蛋白质（但组成和性质各不相同）寻根问底6、DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?1407、天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？提示：基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒（plasmid），即独立于细菌拟核染色体DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？不是，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：思考与探究P77、天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？提示411）载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。2）载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。3）载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组DNA的筛选。4）载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。5）载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。1）载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基42关于内含子和外显子的说法正确的是（）A.内含子和外显子在转录的过程中都能够转录成成熟的mRNA

B.只有外显子能够转录成mRNA，tRNA，rRNA

C.原核细胞基因中也有内含子和外显子

D.由于内含子不能编码蛋白质，故它属于非编码区知识拓展BGoback关于内含子和外显子的说法正确的是（）知识拓展BGo43274836152748361544限制性内切酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制性内切酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。在质粒上有酶Ⅰ的一个切点，在目的基因的两侧各有一个酶Ⅱ的切点。（1）请画出质粒被限制酶Ⅰ切割后所形成的黏性末端。（2）请画出目的基因两侧被限制酶Ⅱ切割后所形成的黏性末端。（3）在DNA连接酶作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接？为什么？

可以连接。因为由两种不同限制酶切割后形成的黏性末端是相同的（或是可以互补的）小试身手限制性内切酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制性内45基因工程专题1基因工程专题146设想一

能否培养出具有抗虫性状的抗虫棉呢？设想一能否培养出具有抗虫47每100kg猪或牛的胰腺中仅可提取4~5g。1979年，美国将人的胰岛素基因重组到大肠杆菌内，实现了细菌生产胰岛素，大大降低了生产成本。治疗糖尿病特效药——据WTO调查：2005年全世界约有糖尿病患者1.8亿人，我国约6000万。胰岛素思考：转基因技术实现了一种生物的某些性状在另一种生物中表达。这些性状的表达与我们学过的基因的什么过程有关？密码子在生物界是的！DNA(基因)mRNA蛋白质(性状)转录翻译通用每100kg猪或牛的胰腺中仅可提取4~5g。1979年48基因工程的产物基因工程的产物49什么叫基因工程？基因工程，又叫DNA重组技术。通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传特性。基因工程的概念什么叫基因工程？基因工程，又叫DNA重组技术50《DNA重组技术的基本工具》课件［课件］51《DNA重组技术的基本工具》课件［课件］52基因工程培育抗虫棉的简要过程：在以上过程中关键步骤或难点是什么？普通棉花(无抗虫特性)苏云金芽孢杆菌提取抗虫基因通过运载体导入转基因棉花含抗虫基因转基因棉花产生伴胞晶体转基因棉花有抗虫特性基因工程培育抗虫棉的简要过程：在以上过程中关键步骤或难点是什53基因工程培育抗虫棉的关键步骤：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来关键步骤二：抗虫基因与棉花DNA“缝合”关键步骤三：抗虫基因进入棉花细胞解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？基因工程培育抗虫棉的关键步骤：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽54解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？“分子手术刀”——限制性核酸内切酶关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来关键步骤二：抗虫基因与棉花DNA“缝合”关键步骤三：抗虫基因进入棉花细胞“分子缝合针”——DNA连接酶“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体1.1、DNA重组技术的基本工具解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？“分子手术刀”——限55一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”⒈主要来源：⒉种类与命名：⒊作用特点（特异性）4.限制酶识别序列5.作用结果：识别特定核苷酸序列，并且使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。主要从原核生物中分离纯化产生黏性末端或平末端大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，少数由4、5或8个核苷酸组成，是回文序列。一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”⒈主要来源：识别特定核56⒉种类与命名：现在已经从约300种微生物中分离出了约4000种限制性内切酶(限制酶)。EcoRⅠSmaⅠ粘质沙雷氏杆菌（Serratiamarcesens）大肠杆菌（EscherichiacoliR）Goback练习：流感嗜血杆菌的d菌株(Haemophilusinfluenzaed)中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ⒉种类与命名：现在已经从约300种微生物中分57T磷酸二酯键1234512345AT磷酸二酯键1234512345A58《DNA重组技术的基本工具》课件［课件］59限制性内切酶与DNA解旋酶的区别切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键将DNA两条链的氢键打开形成两条单链Goback限制性内切酶与DNA解旋酶的区别切割特定的核苷酸序列的磷酸二60限制酶的识别序列：Goback能被限制性内切酶特异性识别的切割部位都具有回文序列：在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。限制酶的识别序列：Goback能被限制性内切酶特异性识别的61限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中轴线（如图），中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称、重复排列的。想一想限制酶所识别的序列有什么特点？限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱62当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切开时，产生的是黏性末端。当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。当限制63

EcoRⅠ黏性末端黏性末端EcoRⅠ黏性末端黏性末端64

EcoRⅠ黏性末端黏性末端重复演示EcoRⅠ黏性末端黏性末端重复演示65什么叫黏性末端？被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。什么叫黏性末端？被限制酶切开的DNA两条单链66SmaⅠ平末端平末端GobackSmaⅠ平末端平末端Goback67二、DNA连接酶——“分子缝合针”1.作用:2.作用原理：3.类型：预习DNA连接酶回答下列问题二、DNA连接酶——“分子缝合针”1.作用:2.作用原理68二、DNA连接酶——“分子缝合针”1.作用:把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来.2.作用原理：催化磷酸二酯键形成二、DNA连接酶——“分子缝合针”1.作用:69可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，E·coliDNA连接酶或T4DNA连接酶即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，E·co70

T4DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低T4DNA连接酶T4DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效713.类型：E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源功能大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)相同点差别3.类型：E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源功能大72三、“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体1、载体的作用2、种类

3、载体需要的条件预习“分子运输车”回答下列问题三、“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体1、载体的作用73三、“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体1、载体的作用将

转移到受体细胞中去。目的基因2、种类

质粒（常用，最常用的质粒是大肠杆菌的）λ噬菌体的衍生物动植物病毒三、“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体1、载体的作用743、载体需要的条件：⑴有一个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接。⑵对受体细胞无害⑶能够在受体细胞中自我复制并稳定地保存⑷有某些标记基因，便于筛选⑶假如目的基因导入受体细胞后不能复制，转基因生物能有预想的效果吗？⑴作为分子运输车——载体，如果没有切割位点将会怎样？⑵霍乱菌的质粒有多个限制酶切点，你会用它来做分子运输车吗？

⑷目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？

3、载体需要的条件：⑶假如目的基因导入受体细胞后不能复制，75

1）质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并且具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。4、质粒是基因工程最常用的载体。

2）质粒DNA上有一个或多个限制酶的切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中。

3）携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，在细胞中进行自我复制，或整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制。1）质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外765）真正被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行人工改造的。

4）质粒DNA上有特殊的标记基因，如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。5）真正被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行人工改造的77能复制并带着插入的目的基因一起复制有切割位点有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别能复制并带着插入的目的基因一起复制有切割位点有标记基因的存在78《DNA重组技术的基本工具》课件［课件］79分组讨论下列问题1、限制酶存在于原核生物中的作用是什么？2、为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？3、要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？4、如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？5、DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？6、DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?7、天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？分组讨论下列问题1、限制酶存在于原核生物中的作用是什么？2、80寻根问底1、限制酶存在于原核生物中的作用是什么？原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。寻根问底1、限制酶存在于原核生物中的作用是什么？812、为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。寻根问底2、为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？通过长期823、要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？要切两个切口，产生四个黏性末端。4、如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？

会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。寻根问底3、要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产835、DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？

迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。寻根问底5、DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？迄今为84寻根问底6、DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?1)只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键1.形