单克隆抗体提纯技术

单克隆抗体提纯技术单克隆抗体的纯化方法同多克隆抗体的纯化，腹水特异性抗体的浓度较抗血清中的多克隆抗体高，纯化效果好。按所要求的纯度不同采用相应的纯化方法。一般采用盐析、凝胶过滤和离子交换层析等步骤达到纯化目的，也有采用较简单的酸沉淀方法。1.IgG的分离与提纯目前最有效的单克隆抗体纯化方法为亲和纯化法，多用葡萄球菌A蛋白或抗小鼠球蛋白抗体与载体（最常用Sepharose）交联，制备亲和层析柱将抗体结合后洗脱，回收率可达90％以上。蛋白可与IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3结合，同时还结合少量的IgM。洗脱液中的抗体浓度可用紫外光吸收法粗测，小鼠IgG单克隆抗体溶液在A280nm时，1.44（吸光单位）相当于1mg/ml。经低pH洗脱后在收集管内预置中和液或速加中和液对保持纯化抗体的活性至关重要。

1．材料

(1)20mMol/LpH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液

20mMol/LNaCl

(2)20mMol/LpH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液

40mMol/LNaCl

(3)20mMol/LpH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液

80mMol/LNaCl

(4)20mMol/LpH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液

(5)饱和硫酸铵液

(6)DEAE—纤维素柱

2．操作方法

（1）小鼠腹水用冷PBS液稀释4倍后，于1.00×105转离心30min，去沉淀。

（2）在4℃于上清中缓缓滴加饱和硫酸铵液，边加边搅拌，使溶液最终为50％硫酸铵浓度。

（3）此溶液置冰中30min~60min，然后5000r/min离心10min，去上清。

（4）将沉淀溶于Tris－HCl缓冲液（40mMol/LNaCl）中（溶液可能混浊）。

（5）装入透析袋于Tris－HCl缓冲液（20mMol/LNaCl）中透析除盐。

（6）离心去沉淀。

（7）溶液稀释（1:100或更高倍稀释）后，于280nm测蛋白含量，估计蛋白质含量

1A280unit=0.8mg蛋白质

一般每ml腹水中，含有总蛋白约25mg~36mg。

（8）过DEAE—纤维素柱：纤维素柱高40cm，以20mMol/LNaClTris缓冲液平衡。透析样品以Tris缓冲液等量稀释。

样品进入柱床速度为1ml~2ml/min，以NaCl线形梯度洗脱。大部分单克隆IgG于40mMol/L和80mMol/LNaCl洗脱，也有极少例外的单克隆抗体于120mMol/L~150mMol/LNaCl洗脱。

测OD280nm收集蛋白峰，单克隆IgG保存备用。

杂交瘤产生各种免疫球蛋白，但主要是IgG和IgM，究竟是哪种为主，则决定于抗原的免疫程序。免疫一次，且3天后就取脾，多为产生IgM的B淋巴细胞。免疫多次的多为IgG。IgG的分离与提纯（2）材料与试剂配制

1．动物血清

2．硫酸铵饱和溶液

硫酸铵800g~850g

H2O1000ml

加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后以28％NH4OH调pH至7.0（不调pH值也可以）。

注：硫酸铵以质量优者为佳，因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。如次品必须除去重金属，可在溶液中通入H2S，静置过夜后滤过，加热蒸发H2S即可。

3．0.01Mol/LpH7.4PB液

A液：0.10Mol/LNaH2PO4液

NaH2PO4·2H2O15.60g

加H2O至1000.ml

B液：0.10Mol/LNa2HPO4液

Na2HPO4·12H2O35.80g

加H2O至1000ml

取A液19ml，B液81ml加水至1000ml即可。

4．1％BaCl2溶液

5．纳氏液

HgI115.00g

KI80.00g

加H2O至500.00ml

溶化后过滤，然后再加20％NaOH500.00ml，混合即可。

6．0.50Mol/L的HCl液和0.50Mol/L的NaOH液。

7．洗脱液：0.03Mol/L的NaCl液。

8．透析袋（或玻璃纸）。

（二）操作方法

1．取20ml血清，加生理盐水20ml，再逐滴加入（NH4)2SO4饱和溶液10ml，使成20％(NH4)2SO4溶液，边加边搅拌，充分混合后，静置30min。

2．3000r/min离心20min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白。

3．在上清液中再加（NH4）2SO4饱和溶液30ml，使成50％（NH4）2SO4溶液，充分混合，静置30min。

4．3000r/min离心20min，弃上清。

5．于沉淀中加20ml生理盐水，使之溶解，再加（NH4)2SO4饱和溶液10ml，使成33％(NH4)2SO4溶液，充分混合后，静置30min。

6．3000r/min离心20min，弃上清，以除去白蛋白。重复步骤5，2~3次。

7．用10ml生理盐水溶解沉淀，装入透析袋。

8．透析除盐，在常水中透析过夜，再在生理盐水中于4℃透析24h，中间换液数次。

以1％BaCl2检查透析液中的SO42－或以纳氏试剂检查NH4（取3~4ml透析液，加试剂1~2滴，出现砖红色即认为有NH4存在），直至无SO42－或NH4出现为止。也可采用SephadexG25或电透析除盐。

9．离心去沉淀（去除杂蛋白），上清液即为粗提IgG（即γ球蛋白，如以36％的饱和硫酸铵沉淀血清的产物即为优球蛋白，Euglobin，含γ球蛋白）。

10．过DEAE－纤维素层析柱。（装柱过程见层析技术）。以0.01Mol/LpH7.4PBS（0.03Mol/LNaCl）洗脱，收集洗脱液。

也可采用SephadexG150或G200柱。

11．蛋白质及其定量鉴定（见本章第八节）。

12．IgG的纯度鉴定可采用下列方法之一鉴定。

⑴区带电泳：玻片琼脂或醋酸纤维膜电泳均可。加样电泳后，只在γ—球蛋白的迁移部位出现一条带。操作时，同时可用全血清样品，不同浓度（NH4）2SO4盐析样品进行电泳，以资比较。

⑵琼脂双相双扩散鉴定：预先准备该IgG免疫异种动物所获的抗IgG血清。将IgG与抗IgG血清进行双相双扩散，如IgG提纯的话，则在两样品孔之间出现一条沉淀线。

⑶免疫电泳鉴定：（操作见第三章免疫电泳部分）。孔内加待测样品，电泳后，在槽内加抗IgG血清，琼脂扩散24h，观察结果。如果提取的IgG纯的话，则只出现一条弧形的沉淀线，且沉淀线位于γ—球蛋白区。此鉴定必须同时进行全血清及抗血清抗体的免疫电泳，以资比较。

⑷圆盘电泳鉴定：用全血清样品及提纯样品同时进行圆盘电泳。全血清样品在圆盘电泳上出现数十条区带，而纯化的IgG则只有一条区带。

13．IgG的浓缩与保存

⑴IgG的浓缩：参看本章第九节。

⑵IgG的保存：一般浓缩至1％以上的浓度，再分装成小瓶冻干保存，或加0.01％硫柳汞在普通冰箱或低温冰箱保存，注意防止反复冻融。

（三）IgG的简易快速提取法

应用硫酸铵盐析及DEAE－纤维素层析法提纯化的IgG，不仅操作复杂、需时较长，处理过程中样品体积大大增加，而且透析时变性严重，容易引起抗体效价降低等。为了克服这一不足，特别是当大量提取IgG时，则往往采取下列的简易办法。

1．DEAE－纤维素直接提取法

取样品直接过DEAE－纤维素柱。下面介绍的是最为简单的烧杯法。

⑴以一定数量的DEAE52放入烧杯中，加入0.01Mol/LpH8.0PB缓冲液，静置30min，去上清细粒，再重复一次。

⑵用布氏漏斗（内放两层滤纸）过滤。

⑶以5g湿重的DEAE－纤维素加1ml血清及3ml蒸馏水混合液的比例，加入各成分，充分搅拌。

⑷于4℃中放置1h，中间搅拌数次。

⑸用布氏漏斗抽滤，再用0.01Mol/LpH8.0PB缓冲液冲洗纤维素，抽滤。滤液即为提取的IgG液。

2．DEAE－SephadexA－50为弱碱性阴离子交换剂，经NaOH将Cl－型转变为OH－型后，可吸附酸性蛋白，血清中除γ－G属中性蛋白外其余均属酸性蛋白。当溶液的pH在6.5时，酸性蛋白均被DEAE－SephadexA－50吸附，只有γ－G留在溶液中。因此利用这一原理可以提取γ－G。这种提取法流程大大缩短，纯化前后样品体积变化不大，而且所得γ－G无变性现象。经过四次处理，其纯度也较好。缺点是收集量少，损耗大。

⑴DEAE—SephadexA—50的处理。取DEAE－SephadexA－50若干克，悬浮于蒸馏水中，1h后倾去上层小颗粒，然后用0.50Mol/LNaOH处理1h，蒸馏水洗至中性，再用0.5Mol/LHCl处理0.5h，水洗至中性，最后以0.01Mol/LpH6.5PB液平衡、抽干。

⑵取一定的血清量，加等量的0.01Mol/LpH6.5PB液，再加液体体积1/4的滤干的DEAE－SephadexA－50，混合、4℃放置1h，不时搅拌、抽滤、收集滤液。

⑶再用同样重量的DEAE－SephadexA－50处理滤液。反复处理三次。（全程共四次）。获得滤液即为γ－G制品。

⑷DEAE－SephadexA－50的回收。用0.5Mol/L的Na2HPO4洗脱，抽滤至滤液中无蛋白（OD280﹤0.04）后，再用蒸馏水洗至中性即可回收使用。

（四）禽血清IgG的分离与提纯（Na2SO4法）

1．试剂

⑴5％葡聚糖硫酸盐

⑵0.02Mol/LMnCl2溶液

⑶无水硫酸钠

⑷pH8.2硼酸盐缓冲液

⑸0.06Mol/LpH7.4PB液

2．操作方法

⑴取禽血清10ml加5％葡聚糖硫酸盐液，0.40ml和0.025Mol/LMnCl21.00ml充分混合，静置，然后离心去沉淀，此步目的是为了去掉脂类物质。

⑵于上清液中加无水硫酸钠使每毫升血清含0.18g，缓慢加入，混匀，静置30min，3000r/min离心去上清。

⑶以pH8.2硼酸盐缓冲液将沉淀稀释至原血清的一半再加硫酸钠使成0.16g／ml，同上法离心去上清。

⑷重复步骤⑶，加Na2SO4，使成0.14g/ml。

⑸以少量硼酸盐缓冲液溶解沉淀，然后装透析袋除盐48h。

⑹过SephadexG200柱，收集第一峰和第二峰。第一峰是IgM，第二峰主要是IgG。

⑺如要进一步提纯，则用第二峰再过DEAE—纤维素柱，以0.06Mol/LpH7.4PB液洗脱，洗脱下来的蛋白液即为IgG。

也可以按以下操作方法进行：

⑴以18％硫酸钠（W/V）提取一次，再以14％的硫酸钠提取一次。

⑵将粗提的免疫球蛋白以PBS溶解，按9％加入无水硫酸钠，离心。再将上清按5％加入无水硫酸钠，离心。将两沉淀溶解、混合，在常水中透析过夜，再在生理盐水中4℃透析，直至无SO42－为止。

⑶离心将上清液以pH8.00.20Mol/LPBS液平衡。

⑷过SephadexG200柱，以pH8.00.20Mol/LPBS液洗脱，收集洗脱液，取第二峰即为鸡IgG。2.IgA的分离与提纯材料与试剂配制

1．DEAE52纤维素

2．0.10Mol/LZnSO4液

ZnSO4·7H2O2.88g

加水至1000.00ml

3．饱和硫酸铵溶液

4．10％EDTA—Na

5．SephadexG200

6．0.01Mol/LpH7.4PB液

7．0.10Mol/LpH6.4PB液

8．血清

（二）操作方法

1．取血清加等量的0.1Mol/LZnSO4液，调pH至7.0，室温搅拌1h，离心去沉淀。

2．于上清液中加入等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置30min或冰箱过夜。

3．10000r/min离心10min，去上清。

4．取沉淀溶于4ml10％EDTA－Na溶液中。

5．生理盐水中透析除盐。

6．过DE52柱，用0.01Mol/LpH7.4PB液洗脱蛋白（IgG）弃去。

7．换用0.1Mol/LpH6.4PB液洗脱，收集蛋白峰，即为IgA。

8．再过SephadexG200柱，洗液为0.01Mol/LpH7.4PBS（0.14Mol/LNaCl），收集洗脱液测OD280值，取第一峰即为纯化IgA。

9．透析、浓缩、鉴定。3.免疫球蛋白：分泌型IgA的分离与提纯（一）材料与试剂1．初乳2．SephadexG2003．0.10Mol/LpH6.8PB液4．0.01Mol/LpH7.4PB液5．DEAE52（二）操作方法1．取初乳20ml，10000rpm离心10min，弃去表面脂肪层及底部的沉淀物。2．取乳清过SephadexG200柱（柱规格为2.50cm×90cm），以0.10Mol/LpH6.8PB液洗脱，第一峰为IgA（含IgG）。3．收集乳液，于0.01Mol/LpH7.4PB液中透析。4．将透析液浓缩至5mg/ml以上。5．过DE52层析柱，用0.01Mol/LpH7.4PB液洗脱，洗下蛋白峰为IgG，弃去。6．换用0.10Mol/LpH6.8PB液或0.01Mol/LpH7.4PBS（0.10Mol/LNaCl）液洗脱，收集洗脱液，即为较纯的IgA液。7．必要时，可再过一次SephadexG200柱。8．浓缩，鉴定免疫球蛋白提取(Immunoglobulinisolation)：连续提取免疫球蛋（一）试剂及配制1．饱和硫酸铵液2．各种磷酸盐缓冲液⑴0.2mol/L原液A液：0.20Mol/LNaH2PO4液NaH2PO4·H2O31.20gH2O1000mlB液：0.20Mol/LNa2HPO4液Na2HPO4·12H2O71.7gH2O1000ml⑵0.10Mol/LpH8.0PB液

A液：53mlB液：947mlH2O加至2000ml⑶0.005Mol/LpH8.0PB液取0.10Mol/LpH8.0PB液100ml，加H2O至2000ml⑷0.025Mol/LpH8.0PB液取0.10Mol/LpH8.0PB液500ml，加水至2000ml。⑸0.035Mol/LpH8.0PB液取0.10.1Mol/LpH8.0PB液700ml，加水至2000ml。⑹0.10Mol/LpH5.8PB液A：920mlB：80mlH2O加至2000ml⑺0.40Mol/LpH5.2pB液a液.0.40Mol/LNaH2PO4液NaH2PO4·2H2O62.40gH2O加至1000mlB液.0.40Mol/LNa2HPO4液Na2HPO4·12H2O143.4gH2O加至1000ml取a液960mlb液40ml混合即可。⑻0.01Mol/LpH8.0PBS液取0.10Mol/LpH8.0PB液100mlNaCl8.20gH2O加至1000ml3．DEAE－纤维素（细粒级）4．SephadexG200（二）操作方法1．取一定量的血清，加等量的生理盐水，然后逐渐滴加饱和硫酸铵溶液，使成40％的饱和度，静置30min。2．10000r/min离心10min，去上清。3．加入一定量的生理盐水，使沉淀溶解，再加入饱和硫酸铵溶液，使成40％饱和度。10000r/min离心10min，去上清。4．再重复步骤3一次。5．将沉淀以少量生理盐水溶解，透析，除盐浓缩。6．制备DEAE－纤维素柱，以0.005Mol/LpH8.0PB液平衡。同时制备SephadexG200凝胶柱，以0.01Mol/LpH8.0PBS液平衡并进行洗脱。7．以0.005Mol/LpH8.0PB液洗脱，得蛋白液为IgG。7．以0.025Mol/LpH8.0PB液洗脱，得蛋白主要是IgE，再过SephadexG200凝胶柱，收集第一峰即为纯IgE。8．以0.035Mol/LpH8.0PB液洗脱，得蛋白主要是IgA，再过SephadexG200凝胶柱，收集第一峰即为纯IgA。10．以0.10Mol/LpH5.8PB液洗脱，洗脱液主要有IgM、IgG及白蛋白的混杂物。11．以0.40Mol/LpH5.2PB液洗脱，得蛋白液主要是IgM。过SephadexG200，收集第二峰即为纯IgM。免疫球蛋白提取(Immunoglobulinisolation)：Fab片段的制备方法利用胃蛋白酶分解IgG，将抗体断链为Fab和Fc片段。具体操作方法如下：1．将IgG粉末100mg，溶于2ml0.10Mol/LpH4.0醋酸缓冲液。溶液稍成白浊，30℃，保温10min。2．取结晶胃蛋白酶1.50mg，溶于1.50ml0.10Mol/LpH4.0醋酸缓冲液，加入上述溶液中，于30℃作用16h。3．用0.10Mol/LpH8.0PBS透析一夜。4．加入硫醇使成0.10mol/L，在室温下搅拌30min。5．加入1Mol/L的碘乙酰胺（Indoacetamide）使成为0.10Mol/L，室温下搅拌1h。6．用0.01Mol/LPBS1000ml透析过夜，3000r/min，离心30min，去沉淀。7．以上清过SephadexG100(40cm×2.0cm）以0.10Mol/LPBS洗脱。8．以每管6ml收集，约在第8管开始，Fab片段被洗脱。9．测OD280nm，将Fab管合并，浓缩、冻干。10．如制备F(ab)2，上述4～6步骤则可以省略。免疫球蛋白提取(Immunoglobulinisolation)：禽IgA提取与纯化（一）材料与试剂配制1．禽胆汁2．饱和硫酸铵溶液3．0.01Mol/LpH7.4PBS液4．0.10Mol/LpH6.4PBS液（0.30Mol/LNaCl）5．DEAE52－纤维素（二）操作方法1．取冷藏的胆汁3Ⅹml，缓慢滴加Ⅹml饱和硫酸铵液，边加边搅拌，使成25％饱和硫酸铵液。4℃放置30min。1．3000r/min离心30min，去沉淀。2．取上清，加饱和硫酸铵