药学分子生物学重点

绪论分子生物学(molecularbiology〕:是在分子水平争辩生命现象的科学，是现代生命科学的共同语言。核心内容是通过生物的物质根底——核酸、蛋白质、酶等生物大分子的构造、功能及其相互作用等运动规律的争辩来说明生命分子根底，从而探讨生命的奇特。药学分子生物学(pharmaceuticalmolecularbiology)：由于分子生物学的理论、技术渗入到药学争辩领域，从而使药物学争辩以化学、药学的培育模式转化为以生命科学、药学和化学相结合的药模式。核酸、蛋白质、酶等生物大分子的构造、功能及相互作用分子生物学在医药工业中的应用：1、DNA重组技术与药争辩2、药物基因组学、药物蛋白质组学与现代药物争辩3、药物蛋白质组学是基因、蛋白质、疾病三者相连的桥梁科学第一章核酸的分子构造、性质和功能核酸的根本构造〔重点把握：磷酸核苷碱基戊糖引起DNA构象转变的因素：核苷酸挨次、碱基组成、盐的种类、相对湿度。DNA双螺旋构造有利 氢键 不利疏水力稳定性的影响：mRNA:遗传信息

碱基积存力

静电斥力真核生物的mRNA构造:5”53’非编码区—3’polyAmRNA5”码区—终止区—3’非编码区tRNA的二级构造：三叶草形三级构造：倒L功能： 承受氨基酸、携带氨基酸，把氨基酸转运到核糖体上，然后依据mRNA上的密码挨次装配成多肽或蛋白质。rRNA：组成核蛋白体核酸分子杂交的原理：复性〔DNA〕反义RNA的作用机制〔把握：Ⅰ类反义RNA:直接作用于靶mRNA的SD码区，直接抑制翻译，或与靶mRNA链RNA，从而易被RNAⅡ类反义RNA：与mRNAmRNA化，抑制翻译；Ⅲ类反义RNA：则直接抑制靶mRNA双链RNA诱导诱导RNAi的过程主要分为两个阶段〔重点把握：Ⅰ启动阶段Ⅱ执行阶段启动阶段：当细胞中由于感染等缘由消灭双链RNA细胞中一种称为Dicer链RNA21-23bpRNA〔siRN，单链siRNARNARISC〕执行阶段：当目标mRNA与RISC中的siRNARISCRNA，并由细胞中的核酸酶将其进一步降解，从而抑制目标基因的表达病毒核酸的特点〔了解：病毒只含一种核酸，构成病毒体的心髓。核酸类型多态化分子量小，基因组构造简洁，所含基因组数目少病毒基因组核酸复制多样化病毒核酸更易受宿主细胞的影响而发生基因突变和重组DNARNA样的核酸成为传染性核酸DNA:脱氧核糖、磷酸、碱基组蛋白：碱性氨基酸，带正电，如精氨酸、赖氨酸。非组蛋白：酸性氨基酸，带负电，如天冬氨酸、谷氨酸。少量RNA酶RNA的含量最少。基因的定义：基因的生物学定义:是携带生物遗传信息的构造单位，又是把握一个特定性状的功能单位。基因的分子生物学定义：指DNA具有肯定长度的片段。严格地说，基因不仅包含编码蛋白质肽链或RNA包括为保证转录所必需的调控序列。基因组(genome)：是细胞中一套完整单体遗传物质的总和。基因组构造的异同：原核生物原核生物真核生物基因组很小基因组浩大简单，含多种序列成分几乎无蛋白质和核酸结合和蛋白质结合形成染色体有操纵子构造基因家族化，有重复序列基因多连续，有重叠基因基因不连续〔真核细胞病毒除外〕多顺反子单顺反子以单拷贝和多拷贝两种形式存在以单拷贝和多拷贝两种形式存在第三章、可移动的遗传因子〔转座子)和染色体外的遗传因子转座子(transposon)：原核生物和真核生物基因组中存在着可以从一个部位转移到另外一个部位的DNA逆转录转座子〔retransposon〕:指内部含逆转录酶编码序列，通过DNA RNA DNA方式进展转座，即转座子转录产生相应的RNA，再经过逆转录生成的转座子DNA并整合到基因组中。质粒〔plasmid〕:是多数细菌和某些真核生物细胞染色体外的双链环状DNA遗传重组〔geneticrecombination〕:减数分裂时，通过同源染色体的交换和非同源染色体的独立安排，使子代细胞的遗传信息产生了重组合，这种现象称为遗传重组。同源重组〔homologousrecombination〕:指发生在两条双链DNA的同源序列之间，涉及的是大片段同源DNA位点特异重组〔site-specificrecombination〕:指不依靠于DNA序列的同源性，而依靠于能与某些酶相结合的特异DNA简述原核生物转座子的类型及组成特点：①IS——两端有ITR,只能编码转座酶；②类转座子——构造同IS，但不能独立存在，仅作为复合转座子的两端组件；③复合转座子——两端由ISIS④TnAITR,可编码转座酶、解离酶和抗性物质。解释逆转录病毒与逆转录转座子的区分：② 转录病毒是具有感染力量的病毒颗粒，可以在细胞之间转移；②逆转录转座子是宿主DNA但是不能在细胞之间转移。DNA⑴质粒的复制 严密型质粒的复制松弛型质粒的复制⑵质粒的不相容性⑶质粒的转移性⑷质粒的选择性标记试述大肠杆菌同源重组酶的特点〔p92：⑴RecBCD:具有外切核酸酶活性，序列特异性的单链内切酶的活性DNAATPaseATP为解旋供给能量；⑵RecA：DNAATPase各种DNA⑶RuvAB：RuvAHolliday〔ATPase〕凭借其解旋酶活性，推动HollidayRuvHolliday同源重组与位点特异重组有何不同：①同源重组中DNA位点特异性重组是在某些特异的DNA②同源重组后染色体内的DNA位点特异性重组中DNADNA序列发生重排，从而得到不同的结果。Holliday模型的步骤：1、两个DNA分子单链的同一部位发生断裂；2holliday连接体；3、通过分支移动产生同另一分子的互补序列形成异源双链DNA；180，中间体切开并修复，形成两个双链重组体的DNA。分别为片段重组体和拼接重组体。第四章DNA的复制、突变、损伤和修复复制〔replication〕DNADNADNA，一股单链从亲代完整地承受过来，另一股单链则完全从合成。复制子：两个复制起始点之间的DNA复制叉：DNAY形构造称为复制叉。使DNA〔1〕ATPDNA解开成为两条单链。DNASSB—在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整。DNADNA聚合酶：原核生物：DNA-pol对复制中的错误进展校读，对复制和修复DNA-polⅡ

中消灭的空隙进展填补DNA-polⅢ是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。合成后随链，引物酶活性DNAβ：DNADNAδ:先导链合成DNAγ：线粒体DNA的合成DNAε：机制不明类似于δ端粒：真核生物染色体线性DNA端粒的构造特点：1、由末端单链DNA2、末端DNAG、C端粒的功能：1、维持染色体的稳定性；2、维持DNA端粒酶的组成：端粒酶RNA；端粒酶协同蛋白；端粒酶逆转录酶、逆转录酶抑制剂：3”-叠氮胸苷〔AZT〕DNAD噬菌体和病毒DNA的复制：滚环复制AZT逆转录酶合成病毒DNAAZTDNAAZT3’-OH3’-5’磷酸二酯键，使病毒DNA〔HIV〕突变可分为：自发突变；诱发突变突变类型 碱基置换突变 点突变〔转换、颠换〕单点突变碱基插入〔较长〕 多点突变碱基缺失〔较长〕的转变移码突变：是指三联体密码的阅读方式转变，造成蛋白质氨基酸排列挨次发生转变。依据密码子遗传信息转变分类：同义突变、错义突变、无义突变依据突变表现型对外界环境的敏感性分类：非条件性突变、条件性突变突变型与野生型的变换：正相突变、回复突变突变缘由：〔一〕自发突变〔脱氨基、脱嘌呤〕〔二〕诱发突变１．射线〔１〕碱基类似物〔２〕氨基嘌呤〔３〕碱基修饰剂〔亚硝酸、羟胺、烷化剂〕〔４〕ＤＮＡ插入剂〔三〕基因的人工诱变DNA的修复系统：一、复制修复二、损伤修复

尿嘧啶糖基酶系统错配修复无嘌呤〔AP〕修复光复活修复甲基转移酶修复切除修复三、复制后修复 大肠杆菌的重组修复系统SOS修复光复活修复〔原理胸腺嘧啶在uv的作用下生成TT二聚体〔胸腺嘧啶二聚体复活酶在蓝光的照耀下激活，是二聚体解离。限制与修饰限制：限制性内切酶切断外来的DNA修饰：甲基化酶保护细胞自身的DNA渥曼青霉素的作用机制〔抑制肿瘤细胞〕抑制DNA损伤修复的蛋白激酶的活性，DNA的修复功能减弱，增加多耐药细胞对化疗药物的敏感性。第五章转录、转录后加工转录〔transcriptio：生物体以DNA为模板合成RNA的过程。转录单位：RNADNA模板的一个特定位点，并在另一位点处终止，这一特定区域称为转录单位。〔位于转录起点到转录终点之间的DNA〕不对称转录：转录选择性称为不对称转录。有两方面含义1〕在DNA指引转录，另一股链不转录；〔2〕模板链并非总是在同一单链上复制与转录一样点：以DNA为模板；由5’向3’方向延长；反响体系需要Mg2+区分：启动子〔promote：是指RNADNA序列。原核生物启动子：1、转录起始点保守序列2、-10序列(Pribnow框〕-35序列(Sextama框〕作用部位间隔区: 17bp转录效率最高CAP结合位点RNAII的启动子构造：1、起始子；2、TATA框(-25)；3、CAAT框(-75)；4、GC框(-90)；5、增加子(远上游序列)〔enhancer):1、远上游序列；2、转录频率增加；4、大多为重复序列；5、组织特异性、细胞特异性；6、无基因专一性；7、受外部信号调控原核生物转录起始需要RNA聚合酶全酶〔δ；两个α、β、β’,后四个为核心酶〕ρ因子：NTP酶的活性；解旋酶的活性。〔非依靠ρ因子的终止〕RNA聚合酶变构，转录停顿；使转录复合物趋于解离，RNA产物释放。转录因子(transcriptionalfactors,TF)：RNA些关心因子〔蛋白质〕〔真核生物〕RNA生物合成抑制剂：利福霉素：抑制细菌RNA聚合酶〔抑制聚合酶的活性起始阶段〕利迪链霉素：抑制细菌RNA聚合酶〔作用于β亚基抑制延长〕RNA聚合酶〔抑制聚合酶活性〕真核生物mRNA前体加工：〔15端加帽〔5端有N7甲基鸟苷酸；〔2〕3’PolyA〔聚腺苷酸化〕;内含子剪接；甲基化帽子构造的功能:1、mRNA稳定性，使mRNA免遭核酸酶的攻击。2mRNA供给信号，促进蛋白质的生物合成。3RNA的合成。内含子分类：,rRNAII：线粒体、叶绿体，转录产物是mRNAmRNAtRNA第I转录产物是rRNA〔经过两次转酯反响：鸟核苷-OH攻击第一个外显子与内含子之间的磷酸二酯键第一个外显子3”-OH攻击内含子与其次个外显子之间的磷酸二酯键两个外显子相连III类的内含子的自我剪接：GU-AG规章〔套索构造〕tRNA前体的加工：1、核酸内切酶在tRNA两端切断23”端逐个切去附加的碱基33”端加上-CCA-OH4、核苷的修饰(碱基修饰：甲基化；复原反响；核苷内的转位反响；脱氨反响)。第六章蛋白质生物合成——翻译及翻译后过程蛋白质生物合成的概念mRNAmRNA分子中核苷酸的排列挨次所组成的密码信息合成蛋白质的过程。蛋白质生物合成体系：根本原料：20种编码氨基酸模板：mRNAtRNA装配机：核蛋白体放因子等能源物质：ATP、GTP无机离子：Mg2+K+ORF)：mRNA5’-AUG端终止密码子之间的核苷酸序列，称为开放阅读框架codomRNA3代表一种氨基酸(或其他信息)，这种三联体形式的核苷酸序列称为密码子。遗传密码的性质：方向性、连续性、简并性、摇摆性、通用性、偏爱性摇摆性：反密码子与密码子之间的配对有时并不严格遵守常见的碱基配对规律，这种现象称为摇摆配对。原核生物mRNA的特点〔重点〕12、SD序列: 起始AUG上游, -AGGA-保守序列，是核蛋白体结合位点。3mRNA可编码几种功能相关的蛋白质，为多顺反子(polycistron)。真核生物mRNA的特点〔重点〕1、转录和翻译分别在细胞核和细胞浆中完成。2、半衰期相对较长〔几小时甚至几天〕、Kozak序列：mRNA起始密码子处的一段保守序列-CCACCAUGG-，能增加翻译起始的效率。4、单顺反子真核生物:起始氨基酰-tRNA: Met-tRNAiMet-tRNA：Met-tRNAMet原核生物：起始氨基酰-tRNA: fMet-tRNAfMet 甲酰甲硫氨酰-tRNA原核生物mRNA在核蛋白体小亚基上的准确定位和结合涉及两种机制：S-DmRNA与小亚基结合。rpS-1识别并结合。原核生物的肽链合成起始：分别与核蛋白体结合而形成翻译起始复合物的过程。〔IF-〕mRNA在小亚基定位结合；起始氨基酰-tRNA的结合；(IF-1、IF-2、GTP)核蛋白体大亚基结合。：1.进位(positioning)/注册(registration)(EF-TuEF-Ts催化)成肽(peptidebondformation)〔肽酰基转移酶〕转位(translocation)〔转位酶〕核蛋白体循环：肽链延长在核蛋白体上连续循环式进展，又称为核蛋白体循环。多聚核蛋白体：1条mRNA模板链都可附着10～100个核蛋白体，这些核蛋白mRNA与多个核蛋白体形成的聚合物称为多聚核蛋白体。蛋白质生物合成阻断剂〔P205~208〕抗生素类阻断剂〔嘌呤霉素、氯霉素、放线菌酮〕抗代谢药物〔长春碱、三尖杉酯碱〕〔eEF-2失活-糖基化，阻断蛋白质合成〕干扰素 失活-磷酸化;降解病毒mRNA)的正确折叠的保守蛋白质。分子伴侣有以下功能：①封闭待折叠蛋白质的暴露的疏水区段；②创立一个隔离的环境，可以使蛋白质的折叠互不干扰；③促进蛋白质折叠和去聚拢。〔一〕侧链氨基酸的微小修饰二硫键的形成甲基化、磷酸化及乙酰化〔二〕剪切和剪接加工N端的切除剪切信号肽的切除前体蛋白加工活性肽的剪切释放〔三〕添加化学基团第八章基因工程及其在医药工业的应用基因工程的根本原理〔简答题：猎取目的基因—选择和构建载体—目的基因与载体的连接—重组体导入受体细胞—重组体的筛选—克隆基因的表达限制性内切酶切割后产生的3种粘性末端：5’-粘性末端；3’-粘性末端；平头末端影响限制性内切酶活性的因素：1、DNA的纯度2、DNA甲基化程度3DNA的分子构型4、反响温度5、反响系统组成：缓冲液、pH等6、酶量、反响体积、酶切时间合理使用DNA连接酶(DNAligase)：DNA5´-3´-羟基末端之DNADNA分子或片段连接。DNA连接酶的分类：(1)T4DNA连接酶DNA分子大肠杆菌DNA连接酶 只能连接粘性末端DNARNA的修饰酶：末端脱氧核苷酸转移酶——同聚物加尾5’-末端的磷酸限制酶在DNA的任何部位都能将DNA切开吗？DNA的特异序列〔回文序列DNA。DNADNA连接酶有何不同点？1、DNA连接酶：主要是连接DNA片段之间的磷酸二酯键，起连接作用，在基因工程中起作用。2、DNADNADNA复制中起作用3DNA连接酶是将DNADNA连接酶不需要模板DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形DNA链；载体必备条件：1、能自主复制；2、有多克隆位点MCS；3、具有遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；4、分子量小，以容纳较大的外源DNA。质粒(plasmid)：是细菌染色体外的遗传单位，环状双链DNA分子。存在于宿主细胞内、独立于染色体外的、自主复制的遗传成分。克隆载体(cloningvector):能使插入的外源DNA不能表达，这样的载体为克隆载体表达载体:为使插入的外源DNA序列转录，进而翻译成多肽链而设计的载体称表达载体。LacZ’β-N端，而细菌染色体能编码β-C端,形成α互补产生了具有活性的β-X-gal被杂合的β-半乳糖苷酶水解，形成蓝色化合物，因此在平板上产生蓝色菌落。而LacZ’序列上存在多克隆位点，由于目的基因的插入，破坏了LacZ’蓝色化合物，所以平板上消灭白色菌落，白色菌落为阳性克隆的菌落。DNA重组:DNA分子通过共价连接〔磷酸二酯键〕而组合成的DNA分子的过程。〔1〕克隆载体表达载体穿梭载体*原核表达载体的表达系统元件是：启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号3个系统：DNA复制及重组体的选择系统：复制子、选择标记外源目的基因的转录系统：启动子、转录终止子、抑制物基因蛋白质的翻译系统：核糖体结合位点〔SD序列、翻译起始密码子、翻译终止密码子穿梭载体〔shuttlevector)：原核细胞复制所需的序列构造。真核细胞表达所需的构造元件和相应的选择标记基因。基因序列未知承受不同方法猎取目的基因〔简答题基因组DNA文库基因序列未知cDNA文库基因序列聚合酶链反响基因序列化学合成法 基因组DNA文库〔名解：基因组DNA的集合。PCR反响体系：1、模板DNA；2、dNTP；3、引物；4、TagDNA聚合酶；5、缓冲液。步骤：DNADNA与引物退火；引物延长。人工合成基因局限性：1、长度：<60bp；2、中性突变：密码子选择需留意；3、二级构造和重复构造影响拼接；4、合成费用高。载体与目的基因的连接主要有以下5〔选择简答〕1、粘性末端连接2、平头末端连接〔linker〕技术4、同源多聚尾连接法5、人工接头〔adaptor〕技术〔选择〕1、插入失活法〔单酶切〕2、定向克隆法〔双酶切〕5’端脱磷法〔CIP〕基因组DNA文库与cDNA文库的比较〔10分：基因组DNA文库的构建：组织或细胞染色体DNA限制性内切酶基因片段克隆载体重组DNA分子受体菌

cDNA文库的建立：mRNA反转录酶cDNA第一链复制双链cDNA载体含重组分子的转化菌〔基因文库〕

重组DNA分子受体菌cDNA文库1、cDNA文库比基因组DNA文库小得多。2、从cDNA文库筛选基因比较简洁。3、基因组DNA文库：内含子和外显子4、cDNA文库：只有外显子感受态细胞(competentcell)：用特别方法〔CaCL2〕处理后，受体细胞才具DNA的力量，这种细胞称感受态细胞。重组基因导入原核细胞：CaCl2转化法重组基因导入哺乳动物细胞的方法：1、磷酸钙转染；2、电穿孔；3、DEAE葡聚糖介导转染；4、脂质体转染；5、显微注射。重组体的筛选鉴定方法主要有：1、遗传学方法2、核酸杂交法〔鉴定〕3、免疫学方法〔鉴定〕4PCR方法筛选重组子5、酶切鉴定6、DNA测序〔鉴定〕核酸分子杂交法主要包括：〔一〕菌落原位杂交〔二〕Southern印迹〔DNA〕〔三〕斑点印迹〔四〕Northern印迹〔RNA〕PCR的根本原理是什么?PCR扩增某一基因，必需预先得到什么样的信息?答：DNA半保存复制的原理，在体外进展DNA的变性、复性和引物延长。(2)DNA序列。基因表达(geneexpression)生物学功能产物的过程。可诱导基因：在特定环境信号刺激下，相应的基因被激活，基因表达产物增加，这种基因称为可诱导基因。诱导(induction)：(induction)。这种基因是可阻遏基因。阻遏(repression)可阻遏基因表达产物水平降低的过程称为阻遏(repression)基因表达的调控方式:阻遏负调控:调控蛋白+DNA序列 基因的表达(相应蛋白质降低)促进正调控:调控蛋白+DNA序列 基因的表达(相应蛋白质增加)顺式作用元件：与相关基因处在同一个DNA分子上，起调控作用的DNADNA序列。对一个基因的表达具有调控作用的另一个基因的产物。乳糖操纵子色氨酸操纵子〔转录翻译偶联对基因表达的调控〕诱导产生各种热休克蛋白，与σ32有关。沉默子(silencer)：某些基因的负性调整元件，当其结合特异蛋白因子时，对基因转录起阻遏作用。真核生物的基因表达调控：一、染色体重排的调控二、染色质水平调控〔一〕活性染色质DNA拓扑构造变化；2.对核酸酶〔DNaseI)敏感〔二〕组蛋白的修饰乙酰化修饰 作用：降低核小体的稳定性磷酸化修饰 作用：降低与DNA的亲和力三、DNA水平调控〔一〕基因的丧失、扩增与重排〔二〕DNA的甲基化和去甲基化四、转录水平调控〔一〕顺式作用元件：启动子；增加子；沉默子〔二〕反式作用因子转录调整因子分类〔按功能特性〕 根本转录因子特异转录因子五、翻译水平调控〔一〕5’UTR构造〔UTR非翻译区〕〔帽子构造、mRNA二级构造、先导序列〕〔二〕蛋白因子磷酸化〔三〕3’UTR构造RNA对基因表达调控〔P299〕小干扰RNA与基因沉默微小RNA与基因沉默转录因子的构造： DNA结合域

α螺旋-β转角-α螺旋锌指构造碱性亮氨酸拉链螺旋-环-螺旋〔填空〕 酸性激活域转录激活域 谷氨酰胺富活域脯氨酸富含域基因表达(geneexpression)生物学功能产物的过程。可诱导基因：在特定环境信号刺