高效液相色谱法

关于高效液相色谱法第1页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六

高效液相色谱法是以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上，采用颗粒十分细的固定相，并采用高压泵输送流动相而建立的一种液相色谱法。第2页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六HPLC与经典LC区别经典液相色谱高效液相色谱常压或减压填料颗粒大柱效低分析速度慢色谱柱只用一次不能在线检测高压，40～50Mpa填料颗粒小，2～50μm柱效高，40000～60000块/m分析速度快色谱柱可重复多次使用能在线检测第3页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六HPLC与GC差别气相色谱高效液相色谱只能分析挥发性物质，只能分析20%的化合物不能用于热不稳定物质的分析用毛细管色谱可得到很高的柱效有很灵敏的检测器如ECD和较灵敏的通用检测器（FID和TCD）流动相为气体、无毒、易于处理运行和操作容易仪器制造难度较小几乎可以分析各种物质可以用于热不稳定物质的分析色谱柱不能很长，柱效不会很高没有较高灵敏的通用检测器

流动相有毒、费用较高运行和操作比GC难一些仪器制造难度大第4页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六流动相差别GC：流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用

HPLC：流动相为液体流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素流动相种类较多，选择余地广流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相可以增大分离选择性第5页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六

操作条件差别

GC：加温操作

HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）第6页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六第7页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六第一节液相色谱柱效第8页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六速率理论（与GC对比）

1.第9页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六2.第10页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六2）涡流扩散项及其影响讨论：

1）流动相流速对HPLC板高的影响第11页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六第12页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六3）传质阻力项及其影响第13页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六第二节高效液相色谱仪

高压输液系统、进样系统、分离系统和检测系统。此外还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。当注入欲分离的样品时，高压泵将贮液器中流动相经过进样器，将样品带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，得到液相色谱图。第14页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六第15页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六第16页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六第17页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六第18页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六第19页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六第20页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六

1．高压输液系统

固定相颗粒极细，对流动相阻力很大，配备有高压输液系统。一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成。（1）流量稳定、无脉动，流量精度和重复性在1~2%左右；（2）流量范围宽，且连续可调，一般在0.01~10mLmin-1之间，制备型仪器能达到100mLmin-1；

第21页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六

（3）输出压力高、密封性好，要求最高压力300~500kg/cm2；（4）耐腐蚀，能适用于各种有机溶剂、水和缓冲溶液；（5）操作、更换溶剂方便，易于清洗和维修，容易实现梯度淋洗和流量程序控制等。第22页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六

第23页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六2．进样系统

高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5～30cm），柱外展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。进样系统是引起往前展宽的主要因素。

第24页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六第25页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六3、分离系统——色谱柱

色谱柱包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长5～30cm，内径为4～5mm，凝胶色谱柱内径3～12mm，制备往内径较大，可达25mm以上。第26页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六

柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料（＜20μm）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。第27页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六4．检测系统

（1）溶质性检测器仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等。第28页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六第29页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六第30页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六第31页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六光电二极管阵列检测器第32页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六

（2）总体检测器对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。第33页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六5、附属系统

包括脱气、梯度淋洗、恒温、自动进样、馏分收集以及数据处理等装置。其中梯度淋洗装置是高压液相色谱仪中尤为重要的附属装置。

梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。第34页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六

梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度，来调整混合样品中各组分的k值，使所有谱带都以最佳平均k值通过色谱柱。它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的程序升温，所不同的是，在梯度洗脱中溶质k值的变化是通过溶质的极性、pH值和离子强度来实现的，而不是借改变温度（温度程序）来达到。第35页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六梯度淋洗装置外梯度:利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度:一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。第36页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六第三节分配色谱

（PartitionChromatography）

根据分离机理的不同，高效液相色谱法主要可分为分配色谱、液固吸附色谱、离子交换和离子色谱、空间排阻色谱等。其中，最常用的是分配色谱法。一般将其分为液液色谱和键合相色谱.第37页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六

在液液分配色谱中，一个液相作为流动相，另一个液相则涂在惰性担体上作为固定相。两者之间互不相溶，有一个明显的分界面。试样溶于流动相后，在色谱柱内经过分界面进入固定液（固定相）中，由于试样组分在固定相和流动相之间的相对溶解度存在差异，因而溶质在两相间进行分配，很快达到分配平衡。这种分配平衡的总结果导致各组分的差速迁移，从而实现分离。第38页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六

由于固定液在流动相中有微量溶解，固定液会不断流失而导致保留行为发生变化，柱效和分离选择性变坏。因此，化学键合固定相逐渐代替涂渍固定相。第39页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六一、化学键合相色谱法（CBPC）

采用化学键合固定相的液相色谱称为化学键合相色谱法，简称键合相色谱。由于键合固定相非常稳定，在使用中不易流失，适用于梯度淋洗，特别适用于分离容量因子k值范围宽的样品。第40页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六1、键合固定相类型用来制备键合固定相的载体几乎都用硅胶。利用硅胶表面的硅醇基(Si—OH)与有机分子之间成键,即可得到各种性能的固定相。（1）疏水基团：如不同链长的烷烃（C8和C18）和苯基等；

第41页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六

（2）极性基团：如氨丙基、氰乙基、醚和醇等；（3）离子交换基团：如作为阴离子交换基团的胺基、季铵盐；作为阳离子交换基团的磺酸等。第42页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六第43页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六2、硅烷化（≡Si—O－Si－C）键合固定相

具有热稳定好，不易吸水，耐有机溶剂的优点。能在70℃以下，pH=2～8范围内正常工作，应用较广泛。第44页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六3、正相色谱（NormalPhaseLiquidChromatography）流动相的极性小于固定相的极性。常用于分离极性较强的化合物，组分与极性固定相的作用力主要是静电力，溶剂极性越强，洗脱能力也越强；溶剂极性越弱，洗脱能力也越弱。分离顺序是极性较低的组分保留值小，先流出色谱柱。常用饱和烃作流动相，加入适量极性溶剂以调节溶剂的强度，如甲醇、异丙醇等。第45页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六4、反相键合相色谱法

（ReversePhaseLiquidChromatography）

流动相的极性大于固定相的极性。常用于分离极性较弱的化合物，由于固定相是非极性的，溶剂的强度随溶剂极性的降低而增加。分离顺序是极性较强的组分保留值小，先流出色谱柱。在洗脱序列中，水的极性最大，故水是洗脱强度最弱的溶剂。若增加水中的有机成分，则溶剂的洗脱强度增加；相反，若在水中加入无机盐，则增加了溶质的保留值。第46页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六

在反相色谱中，通常以水为流动相的主体，再加入不同配比的有机溶剂作调节剂。常用的流动相是甲醇/水、乙腈/水、四氢呋喃/水，粘度小，没有紫外吸收，而且能与水或缓冲溶液混合。

第47页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六

关于反相键合相色谱的分离机理，可用所谓疏溶剂作用理论来解释。这种理论把非极性的烷基键合相看作一层键合在硅胶表面上的十八烷基的“分子毛”，这种“分子毛”有较强的疏水特性。当用极性溶剂为流动相来分离含有极性官能团的有机化合物时，一方面，分子中的非极性部分与固定相表面上的疏水烷基产生缔合作用，使它保留在固定相中；而另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动相的作用，促使它离开固定相，并减小其保留作用。显然，两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行为。第48页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六第49页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六

反相色谱中，溶质的分离以溶质的疏水结构的差异为基础，溶质的极性越弱，疏水性越强，保留值越大。引入取代基增强溶质的疏水特性，能提高保留值，并与取代基的数目有关。如果分子中增加极性基团，会使保留减小。根据溶质分子中非极性骨架的差别，或官能团的性质、数目、位置的不同，能够预测溶质得洗脱顺序。第50页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六

例如，在苯酚分子上引入不同的官能团，引入甲基则保留值增加，引入一个乙基相当于引入两个甲基的影响，引入一个丙基相当于引入三个甲基的影响；在苯酚分子中引入羟基时则保留值降低，并且对苯二酚要比邻苯二酚或间苯二酚较早洗脱出来；引入一个硝基时保留值增大，然而引入两个或三个硝基时，由于苦味酸和2，4—二硝基酚易溶于水，保留值明显减小。第51页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六

烷基键合相的作用在于提供非极性的表面，键合到表面上的碳的数量决定样品的保留值。烷基配合基的疏水特性随着碳链的长度而增加，溶质的保留值也将随着烷基配合基碳链长度的增加而增加。第52页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六

溶剂强度是描述溶剂色谱性能的主要指标，是溶剂对样品的洗脱能力，它决定于溶剂与溶质之间的分子作用力。溶剂与样品作用力强，则洗脱能力强，组分k值小；反之组分k值高，保留时间长。色谱分离过程中，溶质在流动相和固定相之间的分配系数决定于溶质与流动相和固定相的相互作用。这种作用不仅决定于参与作用分子的极性，而且决定于不同类型分子间的作用力，即范德华力和氢键力。第53页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六

在选用溶剂时，为了获得合适极性的溶剂，常采用二元或多元混合溶剂系统作为流动相，改善色谱系统的选择性，获得所需要的溶剂强度和溶解度。通常根据所起的作用，所采用的溶剂可分成洗脱剂及调节剂两种。洗脱剂决定基本的色谱分离情况，而调节剂则起调节保留时间长短，并改善样品中某些分离不理想组分的分离状况。第54页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六

在反相色谱柱上，增加洗脱液强度对8种化合物分离的影响。在（a）中流动相包含90%的乙腈和10%的缓冲溶液，因为乙腈具有很高的洗脱强度，所有的化合物都很快从色谱柱中洗脱出来，由于色谱峰相互重叠，只观察到三个色谱峰；当降低洗脱强度，使乙腈的浓度降为80%，分离效果好一些，可以观察到五个色谱峰；当乙腈的浓度降为60%，可以观察到六个色谱峰；当乙腈的浓度降为40%时，可以很清楚地观察到八个色谱峰，除了2和3两种物质，其它的化合物都被很好地分离了；继续降低乙腈的浓度（30%，35%），所有的化合物都得到很好地分离，但分析时间被大大延长，检测灵敏度下降。

第55页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六

梯度洗脱色谱分离要求在尽量短的时间内获得足够的分辨率，但过大的分辨率会影响分析速度，并且随着容量因子值的增大，谱带展宽，使检测变得比较困难。对于容量因子值相差很大的复杂混合物，在恒定状态下洗脱，早出来的峰很尖，容量因子往往很小，甚至分不开，晚出来的峰很宽，无法检测。梯度洗脱是溶剂组成随时间连续变化而进行的洗脱，能使容量因子相差1000~10000的样品组分，在合理的分析速度下，得到很好的分离。第56页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六第57页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六第四节液固色谱(LSAC)

液—固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相，吸附剂通常是些多孔的固体颗粒物质，在它们的表面存在吸附中心。液固色谱实质是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离的。

第58页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六

1．分离原理当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的活性中心就要吸附流动相分子。同时，当试样分子（X）被流动相带入柱内，只要它们在固定相有一定程度的保留就要取代数目相当的已被吸附的流动相溶剂分用）于是，在固定相表面发生竞争吸附:

X+nSad=Xad+nS第59页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六

达平衡时,有

其中Kad为吸附平衡常数，值大表示组分在吸附剂上保留强，难于洗脱。Kad值小，则保留值弱，易于洗脱，试样中各组分据此得以分离。第60页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六

2．固定相极性吸附剂最常用的是硅胶，其次是氧化铝；非极性吸附剂最常见的是活性炭。第61页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六3、流动相

在吸附色谱中对极性大的试样往往采用极性强的洗脱剂；对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。洗脱剂的极性强弱可用溶剂强度参数（ε0）来衡量。ε0越大，表示洗脱剂的极性越强。在硅胶吸附剂中ε0值的顺序相同，数值可换算（ε0硅胶=0.8×ε0氧化铝）。第62页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六第63页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六第64页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六

常用：底剂（烷烃）+有机极性调节剂例：正己烷或庚烷+氯仿---4．影响k的因素与固定相性质和流动相性质有关溶质分子极性↑，洗脱能力↓，k↑，tR↑

溶剂系统极性↑，洗脱能力↑，k↓，tR↓

注：调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间第65页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六5．出柱顺序强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱

6．硅胶吸水量↑，LSC→LLC

硅胶含水量较小吸附色谱硅胶极性较大硅胶含水量>17%分配色谱硅胶失活→载体吸附的水→固定液第66页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六第五节离子交换色谱法（IEC）

和离子色谱法（IC）

一、离子交换色谱法利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法。凡在溶液中能够电离的物质，通常都可用离子交换色谱法进行分离。它不仅适用无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。第67页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六1、离子交换原理

利用不同待测离子对固定相亲和力的差别来实现分离的。其固定相采用离子交换树脂，树脂上分布有固定的带电荷基团和可游离的平衡离子。当待分析物质电离后产生的离子可与树脂上可游离的平衡离子进行可逆交换：

第68页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六

阳离子交换：

阴离子交换：

一般形式：R—A＋B＝R－B＋A第69页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六

达平衡时，以浓度表示的平衡常数（离子交换反应的选择系数）：

式中[A]r，[B]r分别代表树脂相中洗脱剂离子（A）和试样离子（B）的浓度，[A]、[B]则代表它们在溶液中的浓度。离子交换反应的选择性系数见从表示试样离子B对于A型树脂亲和力的大小：KB/A越大，说明B离子交换能力越大，越易保留而难于洗脱。一般说来，B离子电荷越大，水合离子半径越小，KB/A值就越大。第70页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六第71页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六

对于典型的磺酸型阳离子交换树脂，一价离子的KB/A值按以下顺序：

Cs+＞Rb+＞K+＞NH4+＞Na+＞H+＞Li+

二价离子的顺序为：

Ba2+＞Pb2+＞Sr2+＞Ca2+＞Cd2+＞Cu2+，Zn2+＞Mg2+

对于季铝型强碱阴离子交换树脂，各阴离子的选择性顺序为：

ClO4-＞I-＞HS04-＞SCN-＞NO2-＞Br-＞CN-＞Cl-＞BrO3-＞OH-＞HCO3-＞H2P04-＞IO3-＞CH3COO－＞F－第72页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六

2．固定相作为固定相的离子交换剂，其基质大致有三大类：合成树脂（聚苯乙烯）、纤维素和硅胶。而离子交换剂又有阳离子和阴离子之分，再根据官能基的离解度大小还有强弱之分。第73页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六第74页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六3．流动相

大多是一定pH和盐浓度（或离子强度）的缓冲溶液。通过改变流动相中盐离子的种类、浓度和pH值可控制k值，改变选择性。如果增加盐离子的浓度，则可降低样品离子的竞争吸附能力，从而降低其在固定相上的保留值。

第75页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六

一般，对于阴离子交换树脂来说，各种阴离子的滞留次序为：柠檬酸离子＞SO42－＞C2O42-＞I-＞NO3-＞CrO42-＞Br-＞SCN-＞Cl-＞HCOO-＞CH3C00-＞OH-＞F-

用柠檬酸离子洗脱要比用氟离子快。第76页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六

阳离子的滞留次序大为：

Ba2+＞Pb2+＞Ca2+＞Ni2+＞Cd2+＞Cu2+＞Co2+＞Zn2+＞Mg＞Ag+＞Cs+＞Rb+＞K+＞NH4+＞Na+＞H+＞Li十差别不如阴离子明显。第77页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六

关于pH值的影响，要视不同情况而定。例如，分离有机酸和有机碱时，这些酸碱的离解程度可通过改变流动相的pH值来控制。增大pH值会使酸的电离度增加，使碱的电离度减少；降低pH值，其结果相反。但无论属于哪种情况，只要电离度增大，就会使样品的保留增大。

第78页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六二、离子色谱法（IC）

离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种分离方法。由于离子交换色谱法在无机离子的分析和应用受到限制。例如，对于那些不能采用紫外检测器的被测离子，如采用电导检测器，由于被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景电导信号掩没而无法检测。

1975年Small等人提出一种能同时测定多种无机和有机离子的新技术。第79页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六离子色谱仪第80页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六第81页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六离子色谱连续抑制原理图第82页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六

在离子交换分离柱后加一根抑制柱，抑制柱中装填与分离柱电荷相反的离子交换树脂。通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具有高背景电导的流动相转变成低背景电导的流动相，从而用电导检测器可直接检测各种离子的含量。这种色谱技术称为离子色谱。第83页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六

若样品为阳离子，用无机酸作流动相，抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换剂。当试样经阳离子交换剂的分离往后，随流动相进入抑制柱，在抑制柱中发生两个重要反应：

R+－OH＋H+Cl--→R+－Cl十H2OR+一OH-＋M+Cl--→M+OH－＋R+－Cl-第84页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六

经抑制柱后，一方面将大量酸转变为电导很小的水，消除了流动相本底电导的影响。同时，又将样品阳离子M+转变成相应的碱，由于OH-离子的淌度为Cl-离子的2.6倍，提高了所测阳离子电导的检测灵敏度。在分离柱后加一个抑制柱的离子色谱亦称为抑制型离子色谱或称双柱离子色谱。由于抑制柱要定期再生，而且谱带在通过抑制柱后会加宽，降低了分离度。第85页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六Frits等人提出不采用抑制柱的离子色谱体系，而采用了电导率极低的溶液，例如1×10-4～5×10-4mol·L-1苯甲酸盐或邻苯二甲酸盐的稀溶液作流动相，称为非抑制型离子色谱或单柱离子色谱。第86页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六第六节尺寸排阻色谱法（SEC）

尺寸排阻色谱法又称凝胶色谱法，主要用于较大分子的分离。它不具有吸附、分配和离子交换作用机理，而是基于试样分子的尺寸和形状不同来实现分离的。尺寸排阻色谱被广泛应用于大分子的分级，即用来分析大分子物质相对分子质量的分布。

第87页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六

（1）保留时间是分子尺寸的函数，有可能提供分子结构的某些信息；

(2)保留时间短，谱峰窄，易检测，可采用灵敏度较低的检测器；

（3）固定相与分子间作用力极弱，趋于零。由于柱子不能很强保留分子，因此柱寿命长；

（4）不能分辨分子大小相近的化合物，相对分子质量差别必须大于10％才能得以分离。第88页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六

1、分离原理

尺寸排阻色谱是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方法。其固定相为化学情性多孔物质——凝胶，凝胶内具有一定大小的孔穴，体积大的分子不能渗透到孔穴中去而被排阻，较早地被淋洗出来；中等体积的分子部分渗透；小分子可完全渗透入内，最后洗出色谱柱。这样，样品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。

第89页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六第90页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六2、固定相

所谓凝胶，指含有大量液体（一般是水）的柔软而富于弹性的物质，它是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体。第91页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六3、流动相

能溶解样品，与凝胶相似，能润湿凝胶。

溶剂的粘度要小，因为高粘度溶剂往往限制分子扩散作用而影响分离效果。

选择溶剂还必须与检定器相匹配。常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。

以水溶液为流动相的凝胶色谱适用于水溶性样品；以有机溶剂为流动相的凝胶色谱适用于非水溶性样品。第92页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六第七节影响分离的因素1．第93页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六2．对流动相的要求：1）与固定液不反应2）对样品有良好溶解度

k=1~10k=2~5最理想的3）与检测器匹配：

UV（常用，测定波长应大于溶剂的截止波长）荧光，电化学4）使用粘度小、纯度高的流动相（甲醇，乙腈）使用前过滤、脱气第94页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六3．洗脱方式

1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵）类似GC的等温度洗脱

2）梯度洗脱：在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例即不断改变其极性（两个泵）适于分析极性差别较大的复杂组分类似GC的程序升温（沸程较长样品）第95页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六第96页，共106页，2022年，5月20日，20点8分，星期六

液相色谱分离类型选择参考表溶于水——排阻色谱，水为流动相相对分子质量＞2000不溶于水——排阻色谱，非水流动相同系物——分配色谱不溶于水异构体——吸附色谱样品分子大小差异——排阻色谱反相液一液色谱相对分子质量溶于水，不离解＜2000排阻色谱，水为流动相碱——阳离子交换色谱