2021年单细胞测序技术在胰腺癌领域应用现状和展望

2021年单细胞测序技术在胰腺癌领域应用现状和展望摘要胰腺癌是预后极差的恶性肿瘤，其特征是癌细胞与肿瘤微环境中存在复杂的相互作用网络和极高的异质性，导致缺乏早期诊断和有效治疗的策略。新兴的单细胞测序技术从单细胞层面进行基因组、转录组或表观遗传学分析，揭示疾病内在的分子机制，相比于传统的研究方法，更有助于阐明肿瘤内异质性问题。目前，单细胞测序技术已广泛应用于胰腺癌领域的研究，并取得了显著成果，加深了对胰腺癌特征的理解，促进了诊疗技术的发展。胰腺癌是侵袭性的恶性肿瘤，95%为导管腺癌。近年来，随着生活方式的改变，以及人口老龄化、预期寿命增加等因素，其发病率和死亡率平均每年升高0.3%［1］。胰腺癌已成为第三大癌症相关死亡原因［2］,预计2030年将成为第二大癌症相关死亡原因［3］。由于缺乏特异性症状及生物学标记物，早期诊断非常困难；胰腺癌进展迅速，多数病人确诊时已无法手术［4］;同时，该肿瘤对大多数治疗方法不敏感［5］,因此预后极差，总体5年生存率＜10%［6］。总的来说，胰腺癌已成为严重威胁人类健康的恶性疾病，受到了越来越多的关注和重视。一些研究结果表明，胰腺癌细胞及其微环境中独特的相互作用网络及高度异质性可能在肿瘤的起源、进展及耐药方面发挥重要作用［7-8］,阐明其内在的复杂机制已完成该领域学者的共同目标。尽管开展了大量工作，但效果并不理想，与其他肿瘤相比，近年来胰腺癌病人5年生存率的改善最低［9］,其中一个重要原因在于传统研究方法在探索肿瘤异质性上的局限性。单细胞测序技术为突破这一困境带来了希望，它能够深层次地分析细胞不同亚群的分布、状态及相互作用等，弥补了传统测序技术的一些不足，提供了新的研究手段。目前，一些基于单细胞测序技术的研究已取得显著成果，对胰腺癌的发生进展有了新的认识，为早期诊断和有效治疗提供了可能的靶点，促进了精准医学在胰腺癌领域的发展。1单细胞测序技术概述单细胞测序是指对单个细胞的遗传信息进行测序，分析其基因组、转录组、表观遗传学等生物信息的技术。主要有以下几个步骤：从新鲜组织样本分离单细胞、细胞溶解、核酸获取、扩增序列、测序及分析［10］。目前各个步骤的技术已趋于成熟，单细胞测序已广泛应用于科研及临床的各个领域。在肿瘤研究领域，测序技术可用于研究肿瘤遗传变异、代谢活动、进展过程等，从而阐明肿瘤内在的分子机制，为临床诊疗提供理论支持。传统的测序技术针对组织样本中所有细胞，得到全部遗传信息，但只能反映这群细胞的平均变异水平，不能得到单个细胞的遗传信息［11］。随着对于肿瘤内异质性的重视不断加深，传统的测序技术已不能满足研究需求。单细胞测序技术应运而生，其可以揭示每个细胞独特的遗传信息，并发现新的细胞类型，同时其分析更高效，还能解决一些样本量较少的问题。这项技术的应用正帮助人们更好地了解肿瘤的本质特征。2单细胞测序技术在胰腺癌领域的应用胰腺癌的早期诊断胰腺位于上腹部深处，周围有血管包绕，影像学检查难以发现早期肿瘤。胰腺癌缺乏特异性症状及生物学标记物，病人从出现症状到确诊往往延误2个月以上［12］。偶然发现的早期胰腺癌病人和晚期确诊的病人5年生存率相差极大［1］,说明胰腺癌的早期诊断对改善预后意义重大。目前，单细胞测序技术已应用于胰腺癌的癌前病变及起源相关的研究，为早期诊断提供了一些新的见解。胰腺囊性肿瘤被认为是胰腺癌的前体病变，其中最常见的是导管内乳头状黏液性瘤(IPMN)。大部分IPMN是低级别异性增生，但一些IPMN具有侵袭性成分并发展为胰腺癌，这部分病人预后明显变差［13］,目前没有可靠的标记物区分惰性和侵袭性IPMN。Bernard等［14］对2例低级别IPMN(LGD)、2例高级别IPMN(HGD)和2例胰腺癌标本的5403个细胞做了单细胞RNA测序，分析了从LGD向胰腺癌发展的过程中，上皮细胞和肿瘤微环境中的异质性变化。该研究结果显示LGD中有促癌基因转录组表达，但同时有抑癌通路激活，而HGD中这些抑癌通路消失，出现和胰腺癌类似的信号通路。在胰腺癌中发现了特异性表达C-X-C趋化因子配体12(CXCL12)的炎症性成纤维细胞，CXCL12在胰腺癌进展中起重要作用［15］,上述成纤维细胞的出现伴随着免疫逃逸微环境的形成。此外，在IPMN微环境中发现了树突状细胞，表明癌前病变期间存在炎症阶段，而在肿瘤进展过程中逐渐消失。上述研究探究了囊性病变向胰腺癌发展的过程中微环境内发生的改变，单细胞测序技术帮助识别了各种细胞的变化过程，并在LGD中发现了转录表型类似HGD和胰腺癌的细胞群。另一项关于IPMN的研究利用单细胞测序技术分析了新鲜IPMN组织中单个肿瘤细胞的体细胞突变，识别了IPMN中存在的遗传异质性［16］。该研究结果证明了IPMN中KRAS突变存在的多克隆性，发现了新的频繁突变的抑癌基因ARID1A，并鉴别了不同细胞发生的不同基因突变。腺泡细胞化生是胰腺癌起始过程的早期事件，但对相关的分子机制了解很少。Schlesinger等［17］应用胰腺癌小鼠模型，对处于疾病不同阶段的肿瘤组织进行了单细胞测序，发现腺泡化生细胞具有不同的亚群，在肿瘤进展过程中不断变化，并和其他细胞相互作用，鉴定了在化生过程中参与调控KRAS下游通路基因的转录因子ONECUT2,该转录因子与预后相关，可能作为胰腺癌早期进展的新的驱动因子。此外，该研究根据不同阶段的基因表达差异，指出了几个可能预示恶性进展的标记物，如MMP7、IGFBP7等。这些结果为阐明胰腺癌的起源机制提供了基础，有助于发现可用于早期诊断的标记物。该研究结果部分解释了化生过程中的异质性，但并未确定哪些腺泡化生细胞会发展为癌症，基于这些结果的进一步分析可能带来更深刻的理解。这些针对胰腺癌癌前病变的研究充分发挥了单细胞测序技术的优势，为理解胰腺癌的起源过程补充了新的理论，同时也留下很大空间等待更进一步的探索。胰腺癌的进展和转移胰腺癌的恶性特征之一在于进展迅速，基因组和转录组的数据揭示了一些肿瘤起始相关的基因突变，但关于胰腺癌进展的机制仍不清楚，因此临床上缺乏有效干预手段。主要原因是不同胰腺癌之间的异质性、以及胰腺癌内部微环境的异质性给研究人员带来了极大的挑战。单细胞测序技术的发展为探索肿瘤遗传和功能的异质性、检测不同细胞亚群提供了有力的工具，这为阐明肿瘤进展的机制带来了希望。Peng等［18］利用单细胞转录组测序技术研究了胰腺癌内部的异质性和调控胰腺癌进展的相关因素，发现2种有不同恶性基因表达谱的导管细胞亚群，其中具有独特增殖特征的导管细胞亚群与肿瘤浸润性T细胞的失活状态有关，此外，该研究证明了胰腺癌中Wnt、Notch等异常通路的作用，并发现了如EGLN3、MMP9等参与癌变的新基因，以及FOS、KLF5等转录因子。这项研究结果提供了新的预后标记物，并为阐明胰腺癌的异质性和肿瘤进展机制打下了基础。转移恶化是胰腺癌导致死亡的主要原因之一，发生转移的病人只能接受姑息治疗，预后极差。即使早期诊断并接受手术，大部分病人也会在4年内复发［1］,提示胰腺癌可能存在早期微转移。因此，了解转移过程的机制、寻求预防和治疗转移性疾病的方法对改善胰腺癌病人的预后非常重要。Lin等［19］对原发肿瘤和转移组织进行单细胞测序，识别了多种不同的细胞亚群，发现转移灶中几乎没有成纤维细胞，并根据基因表达将肿瘤细胞分为2个亚群，其中上皮间质转化型预示着更差的预后。这项研究确定了原发肿瘤和转移性病变之间的异质性，提供了胰腺癌微环境的相关信息，可能为病人的治疗提供一些参考。循环肿瘤细胞也是研究肿瘤转移的对象之一。之前已有观点认为循环中肿瘤细胞具有在远处器官启动肿瘤生长的能力［20-21］,但血液中的癌细胞极其罕见，阻碍了传统的研究方法进行更深入的探索，而单细胞测序可以弥补这种样本量少的问题，目前Yu等［22］开发了新的测序方法以更准确地鉴定循环肿瘤细胞，这将有效推动相关研究，以探索新的治疗靶点或预后标记物。最近，一项研究构建了高转移性胰腺癌病人来源的异种移植小鼠模型，并分选了循环肿瘤细胞进行单细胞RNA测序，从而发现了肿瘤转移过程中高度上调的关键基因BIRC5，这是有丝分裂和细胞凋亡的关键调控因子，研究结果显示敲除或用YM155抑制BIRC5会使癌细胞死亡，表明BIRC5促进了循环中癌细胞的存活；且单用YM155或联合化疗可抑制肿瘤转移［23］。这些结果拓展了对胰腺癌转移机制的理解，并提供了预防转移的治疗靶点。胰腺癌的治疗大部分胰腺癌病人没有手术机会，化疗仍是主要的治疗手段［24］,而传统的细胞毒类药物对胰腺癌病人生存期的改善微乎其微［25］。免疫治疗是新兴的治疗方法，已在其他肿瘤治疗中取得了较好的效果，但胰腺癌特殊的微环境使其对大部分免疫治疗没有反应。成纤维细胞是构成胰腺癌微环境的主要细胞。研究结果表明，成纤维细胞通过向癌细胞提供代谢需要的物质维持肿瘤生长［26］,但抑制成纤维细胞的治疗方法得出了相互矛盾的结果，提示成纤维细胞中各个亚群存在不同的甚至相反的功能。为了更好地了解肿瘤微环境，Dominguez等［27］通过单细胞转录组测序，在动物模型中绘制了胰腺癌进展过程中成纤维细胞图谱。重要的是，该研究识别了一类转化生长因子B调控的表达LRRC15蛋白的成纤维细胞，并在人胰腺癌中证明了其存在，这一特殊亚群只出现在肿瘤组织且与抗程序性死亡配体（PD）-L1治疗不敏感有关。这一结果为针对肿瘤成纤维细胞的治疗提供了可能的靶点，有望改善胰腺癌的治疗效果。除成纤维细胞外，免疫细胞也在肿瘤微环境中发挥了巨大作用。之前有研究结果表明，肿瘤细胞表面表达的CD47抑制了巨噬细胞的吞噬功能［28］,抗CD47抗体可改善细胞介导的免疫反应［29］,阻断CD47-SIRPa通路可以起到抑制肿瘤的作用［30］。但CD47在胰腺癌中的表达和作用机制尚不清楚，因此，Pan等［31］研究了靶向CD47治疗在胰腺癌小鼠中的作用，并利用单细胞测序技术分析其机制。研究发现抗CD47治疗导致了肿瘤微环境的改变，如促炎巨噬细胞增多，免疫抑制相关的巨噬细胞减少。在2种小鼠模型中进行抗CD47与抗PD-L1联合治疗，测序结果表明对关键基因的影响并不一致，这种差异的原因还有待研究。这一研究结果可能为调控胰腺癌病人的免疫微环境带来新的理解。事实上，一些结果显示调节成纤维细胞与免疫治疗结合的方法能够改善预后［32-34］,多种治疗方法的协调，如联合靶向癌细胞和间质，逆转抑制性免疫反应和增强抗肿瘤免疫活性，可能是治疗胰腺癌最有希望的方向［35］。而单细胞测序技术能帮助探索胰腺癌及微环境中各个细胞亚群的功能，有助于阐明内在的具体机制，从而为联合治疗提供有效的靶点，并有望基于个体差异实现精准医疗。3单细胞测序技术的局限性及未来方向单细胞测序技术的应用为胰腺癌研究带来了新的希望，破解肿瘤内异质性的能力使其成为胰腺癌领域的利器。但不可否认，该技术也存在一定的局限性，如耗时长、对样本质量要求高、花费大、可能存在误差等，这些缺点可能会随着技术的完善被逐步解决。目前很多单细胞测序研究的样本量均较小，这可能导致研究结果不适用于所有的胰腺癌病人，同时一些研究结果也引出了更多值得关注和探索的问题，例如鉴定出的不同细胞亚群在肿瘤中怎样发挥作用、这些细胞在疾病不同阶段或不同位置有哪些变化等，未来应继续将单细胞测序技术与传统的研究方法结合，扩大样本量，在已有