性病诊断标准

性病诊断标准目录淋病诊断标准附录A（规范性附录）淋球菌感染的实验室诊断梅毒诊断标准附录A（规范性附录）梅毒螺旋体暗视野检查尖锐湿疣诊断标准及处理原则附录A（规范性附录）醋酸白试验附录B（规范性附录）尖锐湿疣的组织病理检查附录C（资料性附录）尖锐湿疣推荐治疗方案生殖器疱疹诊断标准及处理原则附录A（规范性附录）生殖器单纯疱疹病毒感染的实验室诊断附录B（资料性附录）生殖器疱疹的处理和治疗方案关爱皮肤健康淋病诊断标准1范围本标准规定了淋病的诊断依据、诊断原则和诊断标准。本标准适用于全国各级各类医疗、疾病预防控制机构及其工作人员对淋病的诊断和报告。2诊断依据流行病学史有不安全性接触史或多性伴史或性伴淋病感染史或新生儿的母亲有淋病史。临床表现无合并症淋病男性淋菌性尿道炎潜伏期1d〜10d,常为3d〜5d。最初症状为尿道口红肿、发痒、有稀薄或黏液脓性分泌物。24h症状加剧，出现尿痛、烧灼感，排出黏稠的深黄色脓液。也可有尿频、尿急。查体可见尿道口红肿充血及脓性分泌物。女性泌尿生殖系统的淋病淋菌性尿道炎潜伏期2d〜5d,有尿频、尿急、尿痛、尿血及烧灼感。尿道口充血发红，有脓性分泌物；症状比男性淋菌性尿道炎轻，部分患者可无明显症状。淋菌性宫颈炎为女性淋病的主要表现，出现白带增多、阴道口有黏液脓性分泌物排出，外阴瘙痒，阴道内轻微疼痛和烧灼感。妇科检查可见阴道口充血，水肿，子宫颈口充血，糜烂，有黏液脓性分泌物。女童淋病表现为弥漫性阴道炎继发外阴炎，可见阴道口、尿道口、会阴部红肿，病变部位可出现糜烂、溃疡和疼痛。阴道有脓性分泌物，排尿困难。多数是因为与患淋病的父母密切接触而感染，少数因性虐待所致。有合并症淋病男性淋病合并症淋菌性附睾炎、睾丸炎发病急，初起时阴囊或睾丸有牵引痛，进行性加重，且向腹股沟处扩散。常有全身症状，体温可升高至40℃。检查可见附睾、睾丸肿大、压痛，病情严重时可触及肿大的精索及腹股沟淋巴结。病变晚期可引起附睾结缔组织增生，纤维化和输精管闭锁，引起不育。淋菌性前列腺炎表现为发热、尿痛、尿频、尿急，有排尿不尽感和会阴胀痛，前列腺肛检有明显压痛和肿大。前列腺分泌物中有大量脓细胞、卵磷脂小体减少。其它合并症还可并发尿道旁腺炎、尿道周围脓肿、海绵体炎、淋菌性龟头炎或龟头包皮炎、尿道狭窄等。女性淋病合并症淋菌性盆腔炎包括淋球菌性子宫内膜炎、输卵管炎、输卵管卵巢脓肿、腹膜炎等。多由于淋菌性宫颈炎未及时治疗或不规则治疗，炎症上行感染引起。好发于育龄妇女。多数病人有白带增多，且为脓性或血性。全身症状明显，如畏寒、发热、头痛、厌食、恶心、呕吐、双下腹痛。检查可见下腹压痛和肌紧张，尿道、宫颈等处有脓性分泌物。可发展为输卵管卵巢脓肿或盆腔脓肿，此时可在附件和阴道后穹窿处触及肿物，触痛明显，按之有波动感，如果脓肿破裂，则有腹膜炎甚至中毒性休克等表现。以后可造成输卵管粘连、阻塞以至不孕或异位妊娠。淋菌性前庭大腺炎出现前庭大腺红肿、疼痛，腺体开口处有脓性分泌物，大阴唇下1/2肿胀明显，还可伴有全身症状和腹股沟淋巴结肿大。泌尿生殖器外的淋病淋菌性眼结膜炎新生儿淋菌性眼结膜炎常为经患淋病母亲产道分娩时感染所致，多为双侧性。多于生后3天出现症状。而成人淋菌性眼结膜炎多为自我接种感染或密切接触被分泌物污染的物品所致，单侧或双侧。临床表现为睑结膜充血水肿、有较大量黄白色脓性分泌物，治疗不及时角膜可失去光泽，继而溃疡，甚至穿孔及发生全眼球炎，最后可导致失明。淋菌性咽炎主要由于口交所致。表现为咽部疼痛、灼热，吞咽困难。查体咽粘膜充血，扁桃体红肿，有脓性分泌物附着于咽后壁。淋菌性直肠炎多见于肛交后，表现为肛门瘙痒、疼痛或坠胀感，排便时加重，有脓性分泌物排出。查体可见直肠粘膜肿胀，糜烂，渗血。播散性淋病淋球菌通过血行播散至全身。表现有高热、寒战、关节疼痛、皮损等。关节疼痛好发于膝、肘、腕等关节，局部肿胀，关节腔内积液，关节活动受限，即为淋菌性关节炎。皮损初起为红色小丘疹、红斑，继而出现水疱或脓疱。可发生致命的并发症如淋菌性脑膜炎、心内膜炎、心包炎、心肌炎等。实验室检查涂片革兰染色：男性无合并症患者取尿道分泌物，涂片，作革兰染色，可见典型的细胞内革兰阴性双球菌。淋球菌分离培养：女性患者、有合并症患者及泌尿生殖器外患者，应作淋球菌分离培养以确定诊断。从临床标本中分离到形态典型、氧化酶试验阳性的菌落，取菌落作涂片检查，可见革兰阴性双球菌。如标本取自泌尿生殖器外淋病患者或在法医学上有重要意义时，则应对培养的菌株经糖发酵试验或荧光抗体试验以进一步鉴定确证。按患者临床类型选择检查项目，实验室检查方法见附录A。3诊断原则应根据接触史、临床表现及实验室检查做综合分析，以确定诊断。4诊断标准病例同时符合2.1和2.2任何一项者。病例同时符合疑似病例和2.3者。附录A(规范性附录)淋球菌感染的实验室诊断A.1标本的采集取材部位的正确与否以及采集的标本质量的好坏对病原学检测的可靠性十分重要。淋球菌的易感细胞是柱状上皮细胞。男性尿道舟状窝及女性宫颈外膜和阴道壁为复层鳞状上皮，不是淋球菌的易感部位。A.1.1取材拭子：藻酸钙拭子、普通棉拭子及涤纶拭子均可采用。A.1.2取材部位：应根据患者的年龄、性别、性接触方式及临床表现决定标本采集的适合部位。同一患者行多部位取材可增加检出阳性率。对男性异性恋患者，一般仅采集尿道标本，有口交史者加取咽部标本；对男男性接触患者应采集尿道、直肠及咽部标本；对女性患者常规采集宫颈标本，必要时从尿道、直肠、咽部、前庭大腺和尿道旁腺取材；对幼女采集阴道分泌物；对播散性淋球菌感染者，除泌尿生殖道标本外，还可采集血液、关节液或皮损标本。对新生儿眼炎患者采集眼结膜分泌物，对其母亲采集宫颈、尿道或直肠标本。A.1.3取材方法：从不同的解剖部位取材，有一些特殊的注意事项及方法：(1)尿道：对男性患者，先用生理盐水清洗尿道口，将男用取材拭子插入尿道内2cm〜3cm,稍用力转动，保留数秒钟再取出，以采集到粘膜上皮细胞。对女性患者，可抵着耻骨联合轻轻按摩尿道后，用同男性相似的方法取材。(2)宫颈：取材前用温水或生理盐水湿润扩阴器，应避免使用防腐剂和润滑剂，因为这些物质对淋球菌的生长有抑制作用。如果宫颈口外面的分泌物较多，先用无菌棉拭清除过多的分泌物。将女用取材拭子插入宫颈管内1cm〜2cm,稍用力转动，保留10s〜30s后取出。(3)直肠：将取材拭子插入肛管2cm〜3cm,向侧方用力，避免接触粪团，从紧靠肛环边的隐窝中取出分泌物。如果拭子碰到粪团，应更换拭子重新取材。(4)阴道：对子宫切除的妇女和青春期前女孩可采集阴道标本。将取材拭子置于阴道后穹窿10s〜15s,采集阴道分泌物。如果处女膜完整，则从阴道口取材。(5)咽部：从咽后壁或扁桃体隐窝采集分泌物。(6)其他部位：血液标本抽取后可立即接种于不含多茴香脑磺酸钠(SPS)的血液培养基上，或将经肝素抗凝的血液离心，取白细胞层接种于淋球菌选择性固体培养基上。皮损标本可用针吸、钻孔或刀片刮取的方法采集。关节液可用针吸方法采集并作肝素化处理，以防凝结成块。A.1.4标本的运送：淋球菌的抵抗力弱，对热敏感，不耐干燥。取材后标本若不能立即接种时，需采用运送系统。Amies培养基及Stuart培养基为常用的二种非营养型运送培养基。置于非营养型运送培养基中的标本应在12h内送到实验室，接种于选择性培养基，分离阳性率可达90%以上。超过24h则分离阳性率下降。A.2实验室诊断方法淋球菌感染的实验室诊断技术主要有：(1)涂片染色直接显微镜检查，观察淋球菌的形态特征；（2）分离培养淋球菌；（3）直接检测临床标本中淋球菌细胞成份如抗原或DNA。A.2.1直接显微镜检查最常用的方法是分泌物涂片作革兰染色，在光学显微镜下观察淋球菌细胞形态。A.2.1.1涂片固定：取材后将拭子在玻片上稍用力滚动一下，制成薄而均匀的涂片，自然干燥后将涂片（涂膜面向上）迅速通过火焰2〜3次，加热固定。应避免加热过度使细胞形态扭曲。A.2.1.2革兰染色：包括以下四个步骤：（1）将结晶紫溶液铺满在涂片的涂膜面上，染色1min,流水轻轻冲洗；（2）将碘液铺满涂膜面上，染色1min,流水轻轻冲洗；（3）用乙醇或丙酮脱色，至涂膜无蓝色脱下为止。一般需10s〜20s（时间长短取决于涂片的厚薄，应避免过度脱色），流水轻轻冲洗；（4）用碱性复红或沙黄染液复染1min,流水冲洗后用吸水纸轻轻吸干。A.2.1.3结果观察：在光学显微镜（1000X油镜下）下检查涂片。检查时注意观察细胞类型（如上皮细胞、多形核白细胞），病原体的染色特性（革兰阳性或阴性）、形状（球状或杆状）及位置（细胞内或细胞外）等。淋球菌为革兰阴性菌，常成对排列，菌体呈肾形，二菌长轴平行，接触面平坦或稍凹，位于多形核白细胞内。A.2.1.4结果报告：多形核白细胞内见到形态典型的成对的革兰阴性双球菌为阳性；多形核白细胞外见到形态典型的革兰阴性双球菌为可疑;有或无多形核白细胞但无革兰阴性双球菌为阴性（可仅报告多形核白细胞数）。A.2.1.5临床意义：革兰染色的敏感性和特异性取决于标本的类型。对来自男性淋菌性尿道炎的尿道分泌物标本，其敏感性及特异性可高达95%〜99%,具诊断价值。但检测宫颈标本、无症状男性尿拭子及取自直肠的涂片时，其敏感性仅40%〜70%。革兰染色的特异性较高，宫颈标本如取材正确，没有阴道分泌物污染，检查见到形态典型的细胞内革兰阴性双球菌则支持淋病的诊断。不推荐用革兰染色直接显微镜检查诊断直肠和咽部淋球菌感染。亦不能用于疗后判愈。如果在多形核白细胞外见到形态典型的革兰阴性双球菌，需做培养进行确证。A.2淋球菌的分离培养A.2.2.1培养基：分离淋球菌一般选用营养丰富的选择性培养基。常用的选择性培养基有Thayer-Martin（T-M）培养基、含抗生素的血液琼脂或巧克力琼脂培养基。可购买商品化的培养基或实验室自配，培养基应密封在塑料袋中，于4c冰箱贮存，贮存时间不应超过3周，时间过久则分离率降低。A.2.2.2接种标本：取材后标本应尽可能及早接种。培养基应先置于室温中预温。将取材的拭子转动涂布于平皿的上1/4范围，然后用接种环分区划线，以保证获得较纯的单个菌落。A.2.2.3培养条件：接种标本后，立即将平皿置于36℃,含5%〜10%CO2,湿润（70%湿度）的环境中培养。淋球菌为需氧菌，但初代分离需要CO2。CO2环境可由CO2培养箱、CO2产气袋或烛缸提供。使用烛缸时，应使用白色、无芳香味的无毒蜡烛。在烛缸底部放些浸水棉球以保持一定的湿度。A.2.2.4观察结果：培养24h后检查平皿，此时没有菌生长的平皿应继续培养至48h,仍无菌生长才可丢弃，作出淋球菌培养阴性的报告。对选择性培养基上分离的可疑菌落应作进一步鉴定。A.2.3淋球菌的鉴定A.2.3.1初步鉴定：菌落特征，氧化酶试验和革兰染色是初步鉴定淋球菌的三个主要依据。A.2.3.1.1菌落：选择性培养基上分离出的淋球菌菌落大小及形态随培养基及培养时间的不同可有差异。一般而言，在巧克力培养基平皿上生长24h时直径大约为0.5mm〜1mm,呈圆形、凸起、湿润、光滑、半透明或灰白色菌落，通常有黏性。培泉8h后菌落直径可达3mm,边缘平滑或呈锯齿状，表面粗糙。A.2.3.1.2氧化酶试验：淋球菌具有氧化酶，它产生的氧离子能将氧化酶试剂氧化成醌类化合物，出现颜色反应。(1)试剂：有两种：盐酸四甲基对苯二胺及盐酸二甲基对苯二胺，前者更敏感。工作液为0.5%〜1%水溶液。(2)方法：氧化酶试剂滴加于可疑菌落上，观察颜色变化。也可先将试剂滴在一小张滤纸上，然后用白金耳或塑料接种环挑取可疑菌落与之接触；或先将菌落涂在滤纸上，再滴加试剂，观察有无颜色变化。(3)结果：在10s〜15s内出现深紫红色(二甲基对苯二胺)或深紫兰色(四甲基对苯二胺)即为阳性反应。(4)注意事项：氧化酶试剂对细胞有毒性，可迅速杀死淋球菌。因此，需保留菌株时应注意不要将试剂滴于全部可疑菌落上，留一部分菌落作转种。(5)临床意义：淋球菌氧化酶试验为阳性，但氧化酶反应并非特异性试验。所有奈瑟菌属细菌及许多其它细菌包括多数弧菌、布氏菌属、绿脓杆菌及嗜血杆菌属等氧化酶反应亦呈阳性。如氧化酶阴性，一般可排除淋球菌。A.2.3.1.3.革兰染色：取单个可疑菌落制备涂片作革兰染色，在显微镜下检查。24h的新鲜菌落可见到呈典型肾形的革兰阴性双球菌(约占25%),其余呈单球、四联或八叠形。超过48小时的较老培养物，因细菌自溶，革兰染色常难以说明问题。A.2.3.2确诊试验对于取自泌尿生殖道的标本，在选择性培养基上分离出氧化酶阳性的革兰阴性双球菌一般可诊断为淋球菌，准确性98%。但对取自泌尿生殖道以外部位的标本或涉及医疗法律案例的分离株，应对培养的菌株经糖发酵试验或荧光抗体试验进一步鉴定确证。A2.3.2.1.糖发酵试验：该试验检测奈瑟球菌分解特定糖类葡萄糖、麦芽糖、乳糖及蔗糖)而产酸的能力。根据淋球菌仅分解葡萄糖，脑膜炎球菌分解葡萄糖和麦芽糖等可将淋球菌与其它奈瑟球菌加以鉴别。(1)试剂：配制20%的葡萄糖、麦芽糖、乳糖及蔗糖，过滤灭菌。配制缓冲平衡盐指示溶液(BSS)：每1L中含磷酸氢二钾(K2HPO4)0.4g、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.1g、氯化钾(KCl)8.0g、酚红0.6g、pH7.1〜7.2。过滤灭菌，贮于4℃备用。(2)方法：WHO推荐的微量试管法：①取在非选择性(不含抗生素)巧克力琼脂或血液琼脂培养基上过夜生长的纯培养淋球菌(2接种环)，在0.4mLBSS中制成浓厚菌悬液；②取5支小试管，在1〜4管中分别加入20%过滤灭菌的葡萄糖、麦芽糖、乳糖及蔗糖各0.05mL。第5管不加糖，作为阴性对照管；③每管加入0.1mLBSS。④每管加0.05mL菌悬液，充分混匀。置37℃水浴箱中孵育4h,观察结果。(3)结果观察：淋球菌仅发酵葡萄糖，不发酵其他糖类。仅葡萄糖管颜色由红变为黄色为淋球菌。(4)注意事项：用于试验的糖类纯度要高，尤其是麦芽糖应为分析纯级。糖发酵试验中常因杂菌污染导致假阳性反应或培养物过老自溶而导致假阴性反应。因此，待测菌应为纯培养物，不能用选择性培养基上的初代分离菌(可能含有杂菌)。此外，菌悬液浓度要足够高。(5)临床意义：选择性培养基上分离出的氧化酶阳性、革兰阴性的双球菌，若糖发酵试验阳性可确定为淋球菌。糖发酵试验的特异性为99%〜100%,某些淋球菌菌株尤其是AHU-分离株反应弱，可呈现阴性葡萄糖反应，需用另外的试验加以鉴定。麦芽糖阴性的脑膜炎球菌也会被误鉴定为淋球菌，对泌尿生殖道外的分离株最好采用一种以上的鉴定方法。A.2.3.2.2荧光抗体染色法：抗淋球菌主要外膜蛋白I的单克隆荧光抗体与淋球菌结合后，在荧光显微镜下可见到发特异荧光的淋球菌。(1)试验方法：用接种环取数个菌落(可用初代分离菌)涂布于玻片上，加一滴生理盐水，制备成涂片，干燥后加热固定。将30UL荧光抗体试剂加于涂膜上，放于一湿盒中，置37℃15min。用蒸馏水轻轻冲洗涂片，洗去未结合的抗体。涂片置空气中干燥，加一滴封固液，盖上盖玻片，在荧光显微镜下观察结果。(2)结果观察：在荧光显微镜下见到发苹果绿色荧光的双球菌为阳性。(3)注意事项：加试剂后的涂片应放在湿盒内以防干燥，否则干燥的荧光抗体附着在玻片上会产生非特异性荧光。封固剂中甘油的纯度要高，否则其产生的自发荧光会影响结果的正确判断。(4)临床意义：选择性培养基上分离出的氧化酶阳性、革兰阴性的双球菌，若荧光抗体染色阳性可确定为淋球菌。但市售的某些抗淋球菌荧光抗体也可和脑膜炎球菌及其他奈瑟球菌起交叉反应，也有少数淋球菌不与所用试剂起反应。A.3培养基A.3.1Thayer-Martin(T-M培养基A.3.1.1成分：T-M培养基的组成包括：(1)GC基础培养基；(2)血红蛋白粉；(3)VCNT抑菌剂(含万古霉素、多粘菌素、三甲氧苄胺嘧啶和制霉菌素)；(4)Iso-Vitalex增菌剂。A.3.1.2配制方法：以配制500ml培养基为例。(1)称取GC琼脂粉18g,置一烧瓶中，加235ml蒸馏水，摇匀后置沸水浴15min〜30min,使琼脂完全溶解。(2)称取血红蛋白粉5g,加于乳钵内，用250ml蒸馏水分次研磨溶解后，置沸水浴15min〜30min。(3)将上述两种溶液置于121℃高压灭菌15min,冷却至50℃,在无菌条件下将血红蛋白溶液缓慢加入到琼脂液内，弃去可能存在的血红蛋白沉渣。(4)取1小瓶Iso-Vitalex增菌剂，用所附的一小瓶稀释液溶解后加入到步骤(3)所配的混合液中，边加边摇。(5)取一小瓶VCNT抑菌剂，用5ml无菌蒸馏水溶解后加入到步骤(4)所配的混合液中，边加边摇。(6)在无菌条件下将配好的培养基分装入无菌平皿中，待凝固后，置塑料袋封存，置4c冰箱保存备用。A.3.2血液琼脂培养基A.3.2.1成分：包括：(1)GC基础培养基；(2)脱纤维羊血。A.3.2.2配制方法：以配制500ml培养基为例。(1)取GC琼脂粉18g,置一烧瓶中，加450ml蒸馏水，摇匀后置沸水浴15min〜30min,使琼脂完全溶解。(2)将GC琼脂溶液置于121℃高压灭菌15min,冷却至50℃。(3)在无菌条件下将50ml脱纤维羊血(羊血在临用前置37℃水浴预热)加入到琼脂溶液中，摇匀后分装于无菌平皿中，待凝固后，置塑料袋封存，置4℃冰箱保存备用。A.3.3运送培养基有商品化或自制的运送培养基，取10g培养基粉，置1L烧瓶中，加500ml蒸馏水，充分混合，121℃高压灭菌15min，冷却至50℃，然后分装于小管中，每管6ml。在分装时，不时摇动混匀琼脂，以使活性炭末能处于均匀混悬状态。关爱皮肤健康梅毒诊断标准1范围本标准规定了梅毒的诊断依据、诊断原则、诊断标准和鉴别诊断。2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。梅毒Syphilis梅毒是苍白螺旋体（又名梅毒螺旋体）感染人体所引起的一种系统性、慢性经典的性传播疾病，可累及人体多系统多脏器的损害，产生多种多样的临床表现，导致组织破坏、功能失常，甚至危及生命。前带现象Prozonephenomenon非梅毒螺旋体抗原试验（如RPR试验）中，有时由于血清抗体水平过高，抗原抗体比例不合适，而出现弱阳性、不典型或阴性的结果，但临床上又有典型的二期梅毒体征，将此血清稀释后再做血清学试验，出现了阳性的结果，称?quot;前带现象”。3缩略语下列缩略语适用于本标准。VDRLVenerealDiseaseResearchLaboratory性病研究实验室（玻片试验）USRUnheatedserumreagin血清不需加热的反应素（玻片试验）TRUSTToluidineredunheatedserumtest甲苯胺红血清不需加热试验RPRRapidplasmareagin快速血浆反应素（环状卡片试验）FTA-ABSFluorescenttreponemalantibody-absorption荧光螺旋体抗体吸收（试验）TPHATreponemapallidumhemagglutinationassay梅毒螺旋体血凝试验TPPATreponemapallidumparticleagglutinationassay梅毒螺旋体颗粒凝集试验4诊断依据一期梅毒流行病学史：有多性伴，不安全性行为，或性伴感染史。临床表现：硬下疳：潜伏期一般为2〜4周。一般为单发，但也可多发；直径约1cm〜2cm,圆形或椭圆形浅在性溃疡，界限清楚、边缘略隆起，疮面清洁；触诊基底坚实、浸润明显，呈软骨样的硬度；无明显疼痛或触痛。多见于外生殖器部位。腹股沟或患部近卫淋巴结肿大：可为单侧或双侧，无痛，相互孤立而不粘连，质硬，不化脓破溃，其表面皮肤无红、肿、热。实验室检查：暗视野显微镜检查：皮肤黏膜损害或淋巴结穿刺液可查见梅毒螺旋体（见附录A）。非梅毒螺旋体抗原血清学试验：阳性。如感染不足2〜3周，该试验可为阴性，应于感染4周后复查（见附录A）。梅毒螺旋体抗原血清学试验：阳性（见附录A）。二期梅毒流行病学史：有多性伴，不安全性行为，或性伴感染史，或有输血史（早期梅毒病人为供血者）。临床表现：可有一期梅毒史，病期在2年以内。皮损呈多形性，包括斑疹、斑丘疹、丘疹、鳞屑性皮损、毛囊疹及脓疱疹等，常泛发对称。掌跖部易见暗红斑及脱屑性斑丘疹。外阴及肛周皮损多为湿丘疹及扁平湿疣。皮损一般无自觉症状，可有瘙痒。口腔可发生黏膜斑。可发生虫蚀样脱发。二期复发梅毒，皮损局限，数目较少，皮损形态奇异，常呈环状或弓形。全身浅表淋巴结肿大。可出现梅毒性骨关节损害、眼损害、内脏及神经系统损害等。实验室检查：暗视野显微镜检查：二期皮损尤其扁平湿疣、湿丘疹及黏膜斑，易查见梅毒螺旋体（见附录A）。非梅毒螺旋体抗原血清学试验：阳性（见附录A）。梅毒螺旋体抗原血清学试验：阳性（见附录A）。三期梅毒（晚期梅毒）流行病学史：有多性伴，不安全性行为，或性伴感染史。临床表现：可有一期或二期梅毒史。病期2年以上。晚期良性梅毒皮肤黏膜损害：头面部及四肢伸侧的结节性梅毒疹，大关节附近的近关节结节，皮肤、口腔、舌咽的树胶肿，上腭及鼻中隔粘膜树胶肿可导致上腭及鼻中隔穿孔和鞍鼻。骨梅毒，眼梅毒，其他内脏梅毒，累及呼吸道、消化道、肝脾、泌尿生殖系、内分泌腺及骨骼肌等。神经梅毒，可发生梅毒性脑膜炎、脑血管栓塞、麻痹性痴呆、脊髓痨等。心血管梅毒，可发生单纯性主动脉炎、主动脉瓣闭锁不全、主动脉瘤等。实验室检查：非梅毒螺旋体抗原血清学试验：阳性（见附录A）。梅毒螺旋体抗原血清学试验：阳性（见附录A）。脑脊液检查：白细胞计数三10X106/L,蛋白量＞500mg/L,且无其他引起这些异常的原因。脑脊液VDRL试验或FTA-ABS试验阳性（见附录A）。组织病理检查：有三期梅毒的组织病理变化（见附录A）。隐性梅毒（潜伏梅毒）流行病学史：有多性伴，不安全性行为，或性伴感染史。临床表现：早期隐性梅毒：病期在2年内，根据下列标准来判断：①在过去2年内，有明确记载的非梅毒螺旋体抗原试验由阴转阳，或其滴度较原先升高达4倍或更高。②在过去2年内，有符合一期或二期梅毒的临床表现。③在过去2年内，有与疑似或确诊的一期或二期梅毒，或疑似早期隐性梅毒的性伴发生性接触史。晚期隐性梅毒：病期在2年以上。无证据表明在既往2年中获得感染。无法判断病期者亦视为晚期隐性梅毒处理。无论早期隐性梅毒或晚期隐性梅毒，均无任何梅毒性的症状和体征。实验室检查：非梅毒螺旋体抗原血清学试验：对于无既往梅毒史者，非梅毒螺旋体抗原试验阳性（滴度一般在1：8以上）。对于有既往梅毒治疗史者，与前次非梅毒螺旋体抗原试验结果相比，本次试验结果阳转或其滴度升高4倍或更高（见附录A）。梅毒螺旋体抗原血清学试验：阳性（见附录A）。脑脊液检查：无异常发现。胎传梅毒（先天梅毒）流行病学史：生母为梅毒患者。临床表现：早期胎传梅毒：一般在2岁以内发病，类似于获得性二期梅毒，发育不良，皮损常为水疱-大疱、红斑、丘疹、扁平湿疣；梅毒性鼻炎及喉炎；骨髓炎、骨软骨炎及骨膜炎；可有全身淋巴结肿大、肝脾肿大、贫血等。晚期胎传梅毒：一般在2岁以后发病，类似于获得性三期梅毒。出现炎症性损害（间质性角膜炎、神经性耳聋、鼻或腭树胶肿、克勒顿关节、胫骨骨膜炎等）或标记性损害（前额圆凸、马鞍鼻、佩刀胫、锁胸关节骨质肥厚、赫秦生齿、腔口周围皮肤放射状裂纹等）。胎传隐性梅毒：即胎传梅毒未经治疗，无临床症状，梅毒血清学试验阳性，脑脊液检查正常，年龄小于2岁者为早期胎传隐性梅毒，大于2岁者为晚期胎传隐性梅毒。实验室检查：暗视野显微镜检查：在早期胎传梅毒儿的皮肤黏膜损害或胎盘中可查到梅毒螺旋体（见附录A）。非梅毒螺旋体抗原血清学试验：阳性（见附录A）。梅毒螺旋体抗原血清学试验：阳性（见附录A）。5诊断原则应根据病史、临床症状、体检及实验室检查等进行综合分析，作出诊断。6诊断标准一期梅毒疑似病例：应同时符合4.1.1，4.1.2和4.1.3.2项。确诊病例：应同时符合疑似病例的要求和4.1.3.1、4.1.3.3中的任一项。二期梅毒疑似病例：应同时符合4.2.1，4.2.2和4.2.3.2项。确诊病例：应同时符合疑似病例的要求和4.2.3.1、4.2.3.3中的任一项。三期梅毒（晚期梅毒）疑似病例：应同时符合4.3.1，4.3.2中的任一项和4.3.3.1项。确诊病例：应同时符合疑似病例的要求和4.3.3.2、4.3.3.3、4.3.3.4中的任一项。隐性梅毒（潜伏梅毒）疑似病例：应同时符合4.4.1，4.4.2和4.4.3.1项。确诊病例：应同时符合疑似病例的要求和4.4.3.2、4.4.3.3项。胎传梅毒（先天梅毒）疑似病例：应同时符合4.5.1，4.5.2和4.5.3.2项。确诊病例：应同时符合疑似病例的要求和4.5.3.1、4.5.3.3中的任一项。7鉴别诊断一期梅毒硬下疳：需与软下疳、生殖器疱疹、性病性淋巴肉芽肿、糜烂性龟头炎、白塞病、固定型药疹、癌肿、皮肤结核等发生在外阴部的红斑、糜烂和溃疡鉴别。梅毒性腹股沟淋巴结肿大：需与软下疳、性病性淋巴肉芽肿引起的腹股沟淋巴结肿大，以及转移癌肿鉴别。二期梅毒梅毒性斑疹：需与玫瑰糠疹、银屑病、扁平苔藓、手足癣、白癜风、花斑癣、药疹、多形红斑、远心性环状红斑等鉴别。梅毒性丘疹和扁平湿疣：需与银屑病、体癣、扁平苔藓、毛发红糠疹、尖锐湿疣等鉴别。梅毒性脓疱疹：需与各种脓疱病、脓疱疮、臁疮、雅司、聚合性座疮等鉴别。黏膜梅毒疹：需与传染性单核细胞增多症、地图舌、鹅□疮、扁平苔藓、化脓性扁桃体炎等鉴别。梅毒性脱发：需与斑秃鉴别。三期梅毒结节性梅毒疹：需与寻常狼疮、结节病、瘤型麻风等鉴别。树胶肿：需与寻常狼疮、瘤型麻风、硬红斑、结节性红斑、小腿溃疡、脂膜炎、癌肿等鉴别。神经梅毒：梅毒性脑膜炎需与结核性脑膜炎、隐球菌性脑膜炎、钩端螺旋体病引起的脑膜炎等相鉴别。脑膜血管梅毒需与各种原因引起的脑卒中相鉴别。麻痹性痴呆需与脑肿瘤、动脉硬化、阿尔茨海默病（老年性痴呆）、慢性酒精中毒和癫痫发作等相鉴别。脊髓痨需与埃迪（Adie）综合征、糖尿病性假脊髓痨等鉴别。心血管梅毒：梅毒性主动脉瘤需与主动脉硬化症相鉴别。梅毒性冠状动脉病需与冠状动脉粥样硬化相鉴别。梅毒性主动脉瓣闭锁不全需与感染性心内膜炎、先天性瓣膜畸形等引起的主动脉瓣闭锁不全相鉴别。附录A（规范性附录）梅毒螺旋体暗视野检查A.1梅毒螺旋体暗视野检查A.1.1原理暗视野映光检查是采用一个特殊的聚光器，分为干系和湿系两种，其中央均为黑漆所遮蔽，仅在圆周边留有光线斜角处，光线只可从其圆周边缘斜角射到载玻片上。梅毒螺旋体检查一般采用湿系聚光器。倘若斜射光线遇到载玻片上的物体，如螺旋体等，物体会发光显现。A.1.2材料暗视野显微镜、钝刀（刮勺）、载玻片、注射器、注射针头、无菌等渗盐水。A.1.3取材A.1.3.1皮肤黏膜损害取材：首先在载玻片（厚度为1.0〜1.2mm）上滴加50〜100UL盐水备用。然后用棉拭子取无菌盐水轻轻擦去皮损上的污物。如皮损上有痂皮，可用钝刀小心除去。再用钝刀轻轻地刮数次（避免出血），取组织渗液与载玻片上的盐水混匀，加盖玻片置暗视野显微镜下检查。A.1.3.2淋巴结取材：消毒淋巴结表面皮肤，用无菌干棉球擦干。用1mL无菌注射器配12号针头，吸取无菌等渗盐水0.25mL〜0.5mL,以无菌操作穿刺淋巴结并注入盐水，再吸入注射器内，反复2〜3次后，取少量淋巴液于载玻片上，加盖玻片，置暗视野显微镜下检查。A.1.4方法A.1.4.1.在暗视野聚光器（此法用湿系暗视野聚光器）上加一滴甘油缓冲液（甘油和0.1mol/LPBS，pH7.0按7:3配制）。A.1.4.2载玻片置载物台上，上升聚光器使甘油缓冲液接触载玻片，先用10倍物镜，使物像清晰，再用40倍物镜观察，寻找有特征形态和运动方式的梅毒螺旋体。A.1.5结果及解释A.1.5.1暗视野显微镜下，典型的梅毒螺旋体呈白色发光，其螺旋较密而均匀。运动规律，运动性较强，其运动方式包括①旋转式，围绕其长轴旋转；②蛇行式，全身弯曲如蛇行；③伸缩其螺旋间距离而移动。观察其运动形式有助于与其他螺旋体相鉴别。A.1.5.2未检出螺旋体不能排除梅毒的诊断，阴性结果可能说明：①螺旋体数量不足（单次暗视野显微镜检查阳性率小于50%）。②患者已接受抗生素或杀灭梅毒螺旋体的药物治疗。③损害接近自然消退。④损害不是梅毒。A.2梅毒血清学检查当人体感染梅毒螺旋体后4〜10周左右，血清中可产生一定数量的抗类脂质抗原的非特异性反应素（主要是IgM、IgG）和抗梅毒螺旋体抗原的特异性抗体（主要是IgM、IgG）。这些抗体均可用免疫学方法进行检测。血清学检查是辅助诊断梅毒的重要手段。根据检测所用抗原不同，梅毒血清学试验分为两大类：一类为非梅毒螺旋体抗原血清试验，包括VDRL玻片试验、USR玻片试验、RPR试验、TRUST试验，这些试验主要应用于梅毒的筛查和疗效观察。另一类为梅毒螺旋体抗原血清试验，包括TPHA.试验、TPPA试验、FTA-ABS试验、ELISA试验等。这些试验主要用于确证试验，不用于疗效观察。A.2.1非梅毒螺旋体抗原血清试验A.2.1.1原理梅毒螺旋体一旦感染人体，人体迅速对被损害的宿主细胞以及梅毒螺旋体细胞表面所释放的类脂物质作出免疫应答，在3〜4周产生抗类脂抗原的抗体（反应素）。这些抗体主要是IgG和IgM型混合抗体。非梅毒螺旋体抗原试验是使用心磷脂、卵磷脂及胆固醇作为抗原的絮状凝集试验。反应素与心磷脂形成抗原抗体反应，卵磷脂可加强心磷脂的抗原性，胆固醇可增强抗原的敏感性。心磷脂、卵磷脂遇水形成胶体溶液，胆固醇遇水形成结晶。当抗原与抗体（反应素）混合发生反应时，后者即粘附胶体微粒的周围，形成疏水性薄膜。由于摇动、碰撞，使颗粒与颗粒互相粘附而形成肉眼可见的颗粒凝集和沉淀，即为阳性反应。如遇到非梅毒血清，因体液中的白蛋白多于球蛋白，而白蛋白对胶体颗粒有保护作用，形成亲水性薄膜，即使同样摇动、碰撞，由于抗原颗粒周围没有粘附免疫球蛋白的作用，不能形成较大颗粒，无肉眼可见的凝集和沉淀，因此为阴性反应。VDRL、USR、RPR和TRUST等试验均为此类试验，它们所采用的抗原成分相同，敏感性和特异性基本相似。A.2.1.2VDRL玻片试验A.2.1.2.1材料a.VDRL试剂盒：含VDRL抗原（0.5mL）；VDRL缓冲液，pH6.0±0.1,其配方为中性福尔马林0.5mL,Na2HPO40.037g,KH2PO40.17g,NaCl10.0g,蒸馏水1000mL；标准针头（60±1滴/mL）,直径14mm漆圈玻片；VDRL试验结果图片。b.其他：0.85%NaCl溶液（等渗盐水）；可调水平旋转器。2VDRL抗原配制方法：a.吸取0.3mLVDRL缓冲液置30mL小瓶；b.吸取0.3mLVDRL抗原迅速滴入小瓶内VDRL缓冲液中（约4s）,随后摇动10s,使之混匀；c.立即加2.4mLVDRL缓冲液，盖上瓶盖，来回颠倒摇动小瓶10s约30次，即为VDRL抗原，此抗原只能用1d。A.2.1.2.3定性试验a.血清标本需56℃灭活30min备用；b.吸取0.05mL血清放入玻片圈内，将血清涂开至整个圈内；c.用标准针头加入1滴抗原；d.将玻片置旋转器上摇动4min,180±5次/min,立即置10X10倍显微镜下观察。A.2.1.2.4定量试验经VDRL定性试验为阳性、弱阳性，可疑反应或阴性但临床怀疑为梅毒者，需做定量试验，前者需明确抗体滴度，后者为排除“前带现象”。a.在反应板1〜8孔各加等渗盐水0.05mL；b.吸取0.05mL血清标本（血清已灭活）置第1孔与等渗盐水混匀，吸取0.05mL稀释液至第2孔混匀，再吸取0.05mL至第3孔，如此连续稀释至第8孔，弃0.05mL稀释液。稀释度为原倍、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128,必要时可稀释至更高倍数。c.每个稀释度加入抗原1滴；d.旋转速度和时间同定性试验。A.2.1.2.5结果大或中等大小的絮状物，液体清亮:3+〜4+强阳性反应；絮状物较小，液体较清亮:2+阳性反应；絮状物较小，均匀分布，液体混浊1+弱阳性反应；抗原颗粒稍粗，无凝集土可疑；抗原颗粒均匀，针状细小:-阴性反应。A.2.1.3RPR环状卡片试验A.2.1.3.1原理RPR试验是VDRL试验的一种改良方法。该法是在抗原中加入活性炭颗粒作为指示物，加入了氯化胆碱，因此血清不需灭活。特制的白色纸卡替代了玻片。试验结果易于判断，肉眼即可观察。也可用血浆进行检测，试验结果可保存。抗原放TC冰箱可保存1年。A.2.1.3.2材料a.RPR试剂盒：含RPR抗原；直径为18mm圆圈的特制白色反应卡片；标准针头（60±1滴/mL）；RPR试验结果图片。b.其他：可调水平旋转器。A.2.1.3.3定性试验a.吸取0.05mL血清或血浆加于卡片圈内，并均匀地涂布在整个圈内（每张纸卡有10个或12个反应圈）；b.将抗原轻轻摇匀，用标准针头吸取抗原，每个标本加1滴抗原；c.将卡片置水平旋转器旋转8min,100±5转/min；d.立即在明亮光线下观察结果。A.2.1.3.4结果中到大的黑色絮状物，液体清亮3+-4+强阳性小到中的黑色絮状物，液体较清亮2+阳性小的黑色絮状物，液体混浊1+弱阳性仅见活性炭颗粒集于中央一点或均匀分散一阴性A.2.1.3.5定量试验RPR定量试验的指证与VDRL试验相同。a.在圈内加入0.05mL等渗盐水（一般作6〜8个稀释度），勿将盐水涂开；b.吸取0.05mL血清或血浆作系列稀释（1:2〜1:64）,当稀释到最后的第6孔时，弃去0.05mL稀释液。从第6孔起将血清稀释液涂布整个圈内，再涂布第5孔，依此向前到第1孔。c.滴加抗原，旋转时间、速度和观察结果同定性试验。A.2.1.4TRUST试验A.2.1.4.1原理TRUST试验原理与RPR试验原理相同。唯TRUST试验的抗原中加入甲苯胺红颗粒代替活性炭颗粒指示物，使阳性结果出现红色絮状现象，阴性结果见红色颗粒集于中央或均匀分散。A.2.1.4.2方法 TRUST试验方法及结果判断均与RPR试验相同。A.2.1.5注意事项A.2.1.5.1实验环境温度应为23〜29℃,抗原应保存于4c冰箱，试验前应恢复到室温。抗原应防止冻结，以免抗原被破坏。A.2.1.5.2校准针头，VDRL、RPR和TRUST等抗原为60±1滴/mL。A.2.1.5.3血液标本应防止污染，放置室温应在24h内完成。如血清56℃灭活或放4℃保存，在试验前应恢复试验温度后再开始试验。A.2.1.5.4试验完毕，应立即观察结果。A.2.1.6临床意义A.2.1.6.1非梅毒螺旋体抗原血清试验方法简便、快速，敏感性和特异性较好。对一期梅毒的敏感性为74%〜87%,二期梅毒达100%,三期梅毒34%〜94%。特异性96%〜99%。A.2.1.6.2非梅毒螺旋体抗原血清试验适用于各期梅毒的诊断。早期梅毒经治疗后血清滴度可下降或转阴，故可用于疗效观察、判愈、判定复发或再感染。也适用于人群的筛查、产前检查及健康体检等。A.2.1.6.3VDRL试验适用于神经梅毒的脑脊液检查，特异性高，但敏感性低。A.2.1.6.4非梅毒螺旋体抗原血清试验可在某些传染病及胶原病时出现假阳性反应，因此对阳性反应应结合临床进行鉴别，或作梅毒螺旋体抗原血清试验以进一步证实之。A.2.2梅毒螺旋体抗原血清试验采用梅毒螺旋体作抗原，为特异性抗原，检测血清中抗梅毒螺旋体IgG或IgM抗体，其敏感性和特异性均较高。A.2.2.1梅毒螺旋体明胶颗粒凝集试验（TPPA）A.2.2.1.1原理TPPA试验用梅毒螺旋体致敏明胶颗粒，此致敏颗粒与人血清中的抗梅毒螺旋体抗体结合，产生可见的凝集反应。明胶颗粒为玫瑰红色，便于肉眼观察结果。A.2.2.1.2材料a.TPPA试剂盒：含蒸馏水（标记A）,用于溶解致敏颗粒、未致敏颗粒和质控血清；标本稀释液（标记B）,用于稀释血清标本；致敏颗粒（标记C）,冷冻干燥品，用前30min按规定量加A液溶解并混匀；未致敏颗粒（标记D）,冷冻干燥品，用前30min按规定量加A液溶解并混匀；质控血清（标记E）,冷冻干燥品，用时按规定量加入A液。b.其他：U型微量反应板；微量加样器（25UL）；微量滴管（C和D管）；移液管（微量移液管和刻度滴管）；微量板振荡器。A.2.2.1.3定性试验试验前试剂应恢复到15℃〜30℃。a.B液加至微量反应板孔内，第1孔25口1,第2孔100UL,第3、4孔各25uL；b.取血清25uL加至第1孔，混匀后取25UL至第2孔，混匀后取25uL至第3孔，混匀后取25uL至第4孔，混匀后弃去25uL。c.第3孔加D液（未致敏颗粒）25uL,第4孔加C液（致敏颗粒）25uL；d,将反应板置振荡器振荡30s；e.置有盖湿盒，15〜25℃避光孵育4h后，或放4℃冰箱过夜观察结果。A.2.2.1.4定量试验a.加B液至微量反应板孔，第1孔〜第4孔与定性试验相同，第5孔〜第10孔各加25uL；b.取血清25uL加至第1孔，如定性试验稀释方法，从第2孔〜第10孔混匀，混匀后第10孔弃去25uL；c.第3孔加D液25uL,第4孔〜第10孔各加C液25uL；d.以后步骤同定性试验。结果以最高血清稀释度能产生阳性反应的稀释度为抗体滴度。A.2.2.1.5结果颗粒光滑覆盖整个孔底，有时边缘有折叠阳性4+颗粒光滑覆盖大部分孔底阳性3+颗粒光滑集聚覆盖孔底，周围有一颗粒环阳性2+颗粒光滑集聚覆盖孔底，周围有一明显颗粒环阳性1+颗粒沉集孔底，中央形成一小点可疑土颗粒紧密沉积孔底中央阴性-A.2.2.1.6报告方法a.阳性报告：定性试验，血清在1:80以上稀释度与致敏颗粒发生凝集反应（1+或更强），与未致敏颗粒（第3孔）不发生凝集反应。定量试验则应报告发生阳性反应的血清最高稀释度，为血清滴度。b.阴性报告：血清与致敏颗粒和未致敏颗粒均不发生凝集反应。A.2.2.1.7注意事项a.微量反应板要清洁干净，孔内无异物。b.加入血清后，使用微量板振荡器振荡反应板，而不可使用水平旋转仪。c.试剂盒不可置于0c以下，防止冻结。不同批号试剂不可混合使用。d.有些血清标本在血清低稀释度时可出现前带现象，此时可作定量试验；e.如未致敏颗粒出现凝集反应，应将血清进行吸收处理后再进行试验，或改用其他试验方法。A.2.2.1.8血清吸收处理a.取0.95mL已恢复体积的未致敏颗粒加入清洁的小试管内。b.试管内加入50uL血清标本并充分混匀，置15〜25℃20min或更长时间。c.离心2000rpm,5min,取25uL上清液（血清标本稀释1：20）置第3孔，注意不要混入颗粒。d.自第4孔〜第10孔各加25mLB液。e.自第3孔吸25mL至第4孔，混匀后吸25mL至第5孔……如此稀释至第10孔，弃去25mL。f.按定量试验法加入D液和C液，将反应板置微量板振荡器上振荡30秒钟，置湿盒内，15〜25℃孵育2小时观察结果。A.2.2.2荧光螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS）A.2.2.2.1原理FTA-ABS试验以完整形态的Nichol梅毒螺旋体作为抗原，加上经吸收剂（用Reiter株螺旋体制备而成）处理过的患者血清形成抗原抗体复合物，再加入荧光素（FITC）标记的抗人免疫球蛋白，与血清梅毒螺旋体抗体结合。在荧光显微镜下，螺旋体显示苹果绿色的荧光，即为阳性反应。A.2.2.2.2材料a.梅毒螺旋体抗原玻片，有直径0.5cm涂布梅毒螺旋体的圆圈，在高倍镜下每视野不少于30条螺旋体，丙酮固定。b.吸收剂（5ml冷冻干燥品），由体外培养的Reiter株螺旋体制备而成。使用前用无菌蒸馏水恢复原体积。c.荧光抗体，用荧光素标记羊或鼠抗人免疫球蛋白。d.血清稀释板。A.2.2.2.3方法a.将血清标本于56℃灭活30min，备用；b.吸收剂加入5mL无菌蒸馏水，用作血清的稀释；c.血清标本和吸收剂按1:5〜1:20稀释，混匀后置有盖湿盒内于35〜37℃孵育30min；d.将系列稀释的血清分别加到抗原片上（每孔不少于30UL）,放入有盖湿盒内，置35〜37℃孵育30min；e.用0.01mol/L的PBS冲洗抗原片，用磁力搅拌器低速以0.01mol/LPBS溶液洗涤抗原片，每5min更换PBS液1次，共3次。最后一次用蒸馏水冲洗一遍，冷风吹干备用；f.抗原片每个圈内加30UL荧光抗体（荧光抗体稀释为工作液），放湿盒35〜37℃孵育30min。重复步骤5的洗涤和吹干；g.抗原片加固封剂（甘油缓冲液）1滴，覆以盖玻片。在荧光显微镜下观察。h.试验对照：每批次试验包括下列对照。—4+阳性血清和1+阳性血清对照，血清用PBS液和吸收剂分别按1:5〜1:20稀释。一非特异血清对照。—染色对照：用0.01mol/LPBS和吸收剂分别替代荧光抗体。A.2.2.2.4结果梅毒螺旋体均匀地发出中等或高强度的苹果绿色荧光阳性梅毒螺旋体均匀地发出弱苹果绿色荧光弱阳性梅毒螺旋体呈微弱黄色光或观察不到荧光阴性A.2.2.3梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验（ELISA）A.2.2.3.1原理该试验是用经纯化及超声裂解处理的梅毒螺旋体为抗原包被固相板条，加上梅毒血清和辣根过氧化酶标记的抗人IgG抗体，利用酶免疫法检测患者血清中的抗梅毒螺旋体特异性抗体。采用特异的梅毒螺旋体重组蛋白作为抗原，使试验更加敏感、特异。A.2.2.3.2材料a.ELISA试剂盒：含包被梅毒螺旋体抗原的反应板（96孔）；标本稀释液；洗涤液，使用前按说明书要求稀释；酶结合物；底物液（A液和B液）；反应终止液；阳性对照血清；阴性对照血清。b.其他：酶标检测仪；洗扳机。A.2.2.3.3方法a.取标本稀释液100UL加到反应板孔内，再加入待检血清10UL,同时作阳性和阴性对照，置37℃孵育30min。b.洗涤液洗板5次，拍干；c.每孔加酶结合物100UL,置37℃孵育15min；d.洗涤液洗板5次，拍干；e.每孔加底物液A液、B液各1滴（各50UL）,37℃避光孵育15min；f..每孔加终止液1滴（50UL）终止反应；g.置酶标检测仪450nm波长测定光密度（OD值）。A.2.2.3.4结果判定临界值（cutoff）=0.10+阴性对照平均OD值（阴性对照OD值＜0.05时按0.05计算）。标本OD值＜临界值时，结果为阴性。标本三临界值，结果为阳性（或按各诊断试剂要求判定结果）。A.2.2.3.5注意事项a.试剂盒置4〜8℃保存；b.不同批号试剂不能混用；c.严格按试剂盒说明书要求操作；d.反应的温度和时间必须严格控制。A.2.2.4临床意义A.2.2.4.1梅毒螺旋体抗原血清试验的敏感性和特异性均高，一期梅毒的敏感性为70%〜100%,二期梅毒达100%,三期梅毒95%〜98%,特异性94%〜100%。A.2.2.4.2梅毒螺旋体抗原血清试验多用作证实试验，特别是隐性梅毒及一些非螺旋体抗原血清试验阴性而又怀疑为梅毒的患者。但不能用于观察疗效、判断复发及再感染。A.2.2.4.3梅毒螺旋体抗原血清试验偶可出现生物学假阳性反应。A.3梅毒的组织病理梅毒的基本病理变化：a.血管特别是小动脉内皮细胞肿胀与增生。b.血管周围大量淋巴细胞和浆细胞浸润。二期梅毒晚期和三期梅毒常见上皮样细胞和多核巨细胞等组成的肉芽肿性浸润。A.3.1一期梅毒硬下疳：a.损害边缘表皮棘层肥厚，海绵形成，淋巴细胞和中性粒细胞外渗。b.近中心表皮变薄，出现水肿及炎症细胞浸润。病损中央可出现表皮缺损。c.真皮乳头水肿，真皮血管特别是小动脉内皮细胞肿胀、增生、闭塞，周围有多量浆细胞与淋巴细胞浸润，常混有中性粒细胞。d.银染色在真皮血管周围和表皮中可见梅毒螺旋体。A.3.2二期梅毒斑疹、丘疹和丘疹鳞屑性皮损：a.表皮增生，海绵形成，基底层空泡改变，淋巴细胞外渗，海绵状脓疱，角化不全。b.真皮乳头水肿，真皮血管扩张，管壁增厚，内皮细胞肿胀，血管周围淋巴细胞、组织细胞和浆细胞浸润。浸润的炎症细胞围绕血管呈袖套状。c.银染色约1/3的病例可见梅毒螺旋体。扁平湿疣：除上述表现外，有明显的表皮增生，表皮内微脓肿形成，含大量梅毒螺旋体。A.3.3三期梅毒真皮由上皮样细胞、淋巴细胞及浆细胞等构成的肉芽肿性浸润，其中含血管较多，并常有多核巨细胞存在。结节型：浸润限于真皮，肉芽肿较小，干酪样坏死不广泛，甚或缺如。树胶肿型：浸润侵及真皮和皮下组织，有大量浆细胞、淋巴细胞、上皮样细胞和多核巨细胞，病损中央有大块凝固性坏死。病变处弹性纤维被破坏，炎症愈重破坏亦愈重。A.3.4内脏梅毒病理变化为树胶肿性及弥漫性间质性炎症。A.3.5胎传梅毒无一期梅毒硬下疳的局部病变，其余皮肤病变与获得性各期梅毒相同。其不同者为早期胎传梅毒可有水疱-大疱病变。a.其水疱顶部为1〜2层疏松幼稚表皮细胞。b.疱液内含多少不等单核及多形核白细胞及脱落表皮细胞。c.真皮呈弥漫性急性炎症浸润，浸润细胞为多形核白细胞及淋巴细胞，无浆细胞。d.银染色可在疏松的组织间隙中及疱液内可发现大量梅毒螺旋体。关爱皮肤健康尖锐湿疣诊断标准及处理原则1范围本标准规定了尖锐湿疣的诊断标准及处理原则。本标准适用于全国各级医疗保健机构、卫生防疫机构及性病防治机构。2诊断标准接触史有非婚性行为史或配偶感染史或间接感染史。临床表现症状和体征本病由人类乳头瘤病毒（HPV）感染引起，潜伏期3周〜8个月，平均3个月。男性多见于冠状沟、包皮、系带、龟头和肛周，其次是尿道口、阴茎体和阴囊；女性多见于大小阴唇、后联合、阴蒂、宫颈、阴道壁和肛周。生殖器和肛周以外的部位偶可发生，见于腋下、腹股沟、乳房下和口腔内。初发为淡红色、淡褐色或深褐色细小丘疹，针头至绿豆大小。以后向上突起，逐渐增大增多，表面粗糙不平，向周围扩散，蔓延。根据疣体的形态分成丘疹型、乳头型、菜花型、鸡冠型和蕈样型，少数呈乳头瘤样增殖的巨大型尖锐湿疣，即Buscke-loewenstein巨大型尖锐湿疣。疣体呈白色、红色或污灰色。一般无感觉，部分患者有异物感、痒感或压迫感，或因磨擦而破溃、浸渍或糜烂，性交易出血，感染而渗出。女性患者常可有伴阴道炎。临床上尖锐湿疣需要与阴茎珍珠状丘疹，绒毛状小阴唇（假性湿疣），扁平湿疣、鲍温样丘疹病和鳞状细胞癌等鉴别。醋酸白试验（见附录A）用5%醋酸溶液涂抹皮损处,3min〜5min后皮损表面变白，此为一种辅助性的诊断方法。组织病理检查典型病理表现呈角化过度伴角化不全，棘层肥厚，钉突延长，假性上皮瘤样增长，棘细胞层有特征性的凹空细胞，该细胞核大小不一，核深染而固缩，核周围胞浆空泡化，真皮水肿，血管扩张和炎性细胞浸润（见附录B）病例分类临床诊断病例具备2.1和2.2指标。确诊病例除了具备2.1和2.2指标外，还具备2.4指标。3治疗原则有多种治疗尖锐湿疣的方法，应根据疣体分布的部位、大小、数目、形态、治疗费用、患者的依从性、副作用等选择相应的治疗方案（见附案C）。患者被诊断尖锐湿疣后应立即治疗。同时动员其配偶及性伴接受检查和治疗，治疗期间应禁止性生活，避免再感染或传染给新性伴。治疗结束后应进行随访。4临床治愈判断标准是肉眼可见之疣体被消除。从治疗后产生创面至上皮增生结痂愈合，一般需2周〜3周。治疗后3个月内，在治疗部位无新生疣体判为基本治愈。5管理及预防发现尖锐湿疣患者后，应及时向患者提供合理的治疗，促进其康复。通知配偶和性伴来诊所检查和治疗。对首诊的患者根据临床诊断和（或）确诊结果要向防疫部门报告疫情。治疗期和创面完全长好之前停止性生活。临床治愈后停止性生活3个月（必要时可使用避孕套）。注意个人卫生，不要使用公用的毛巾、浴盆、马桶等用具。规劝患者痊愈后要洁身自爱，不要发生婚外性行为。附录A（规范性附录）醋酸白试验A.1方法A.1.1将5%醋酸溶液用棉拭子涂布于皮损表面，或用浸过5%醋酸溶液的纱布敷于皮损上进行湿敷。A.1.2一般湿敷5min左右即可进行观察，肛周皮损则需要10min〜15min。A.1.3多说结果可直接用肉眼观察，阴道内皮损、细小的皮损借助阴道镜或放大镜观察则更清楚。A.2结果人类乳头瘤病毒感染部位显现白色改变，为均匀一致的白色，临床可疑损害或临床未见皮损的部位均可出现白色改变，直径数毫米至数厘米，形态规则或者不规则，边界清楚，也可不十分清楚。A.3临床意义该方法简便、经济、快速使用方便，敏感性较高，对于临床非典型皮损和亚临床感染的诊断有一定帮助，在治疗前使用以确定治疗范围，为防止或减少治疗后复发有一定帮助。但该方法的特异性不高，有些慢性炎症，例如念珠菌性阴道炎、生殖器部位的外伤以及非特异性炎症引起的粘膜上皮增厚等均可出现假阳性结果。附录B（规范性附录）尖锐湿疣的组织病理检查标本病理切片制作取材：可采用钻孔、手术或剪除法取材。固定：活检组织置10%中性福尔马林液中固定。脱水：组织置70%、80%、95%至100%乙醇中脱水，各45min〜1h。透明：再置入二甲苯中透明。浸蜡：将已透明的组织置石蜡中透蜡2h〜3h。包埋：热石蜡注入盒中，待底面石蜡稍凝固，将组织按一定方向置盒中央，待凝固。切片：切片贴于玻片上，烤片。标本的染色切片在二甲苯中脱蜡10min〜15min。移入100%、95%、80%梯度乙醇中脱水各1min〜2min再水洗。入苏木素液中染色10min〜15min。经自来水洗冲15min以上，水流不易过大，勿直接冲在切片上。入盐酸中分化5min〜10min,水洗。入5%伊红染色1min〜3min,染胞浆。置95%乙醇洗去多余红色，再入100%乙醇中3min〜5min。放入二甲苯乙醇混合液中浸3min〜5min,然后再分别入二杯纯二甲苯液中各浸3min〜5min。取出后擦掉多余二甲苯，滴树胶封片B.3读片结果HE染色切片细胞核呈现蓝色，胞浆红色，HPV染色的组织中可见角化过度、伴有角化不全、表皮棘层肥厚、乳头瘤样或疣状增生、基底细胞增生、层次增加、真皮浅层血管扩张，并有淋巴细胞为主的炎细胞浸润。特征性的改变是在颗粒层及棘细胞层上部出现空泡细胞（凹空细胞），该细胞较大，胞核常深染，形态不规则，核周可见程度不同的空泡化改变，轻者核周仅有空泡化的晕，重者整个胞浆均发生空泡化改变，胞浆内可有丝网状或絮状改变。这些空泡细胞可呈现灶状、片状或散在分布，是组织学诊断HPV感染的重要依据。附录C（资料性附录）尖锐湿疣推荐治疗方案C.1局部药物治疗C.1.10.5%足叶草毒素酊又名0.5%鬼臼毒素酊，疣体上外涂，每日2次，连用3d,停药4d,为1个疗程，其间观察疣体脱落的情况。疣体用药总面积不应超过10cm2,每日用药总量不应该超过0.5ml。如有残存之疣体，可再用1个疗程，可用1〜3个疗程。该药可由患者带回家自己使用。C.1.210%〜25%足叶草酯酊疣体局部外用，每周一次，每次用药面积不应超过10cm2,药液量不应超过0.5ml,涂药后2h〜4h应用清水洗去用药部位残留药液，用药时应注意保护疣体周围正常皮肤或粘膜，用药6次，仍未痊愈，改用其他治疗方法。C.1.350%三氯醋酸溶液疣体局部外用，每周一次，通过对上皮细胞蛋白的化学凝固作用而达到破坏疣体的目的，用药6次，仍未痊愈，改用其他治疗方法。C.1.45%5-氟脲嘧啶（5-Fu）软膏局部外用，每日1次，涂药时注意保护疣体周五正常皮肤和粘膜。C.1.55%咪喹莫特（imiquimod）霜局部外用，在晚间入睡前，涂药于疣体上，每周3次，最多用药16周，用药6h〜10h后，用中性肥皂水清洗用药部位，多数患者在用药8周〜10周或者更早时疣体即可脱落。本药为外用免疫调节剂，通过刺激局部产生干扰素及其他细胞因子而起作用。C.2物理疗法C.2.1激光治疗采用二氧化碳激光治疗，一次就诊即可去除疣体，适用于多发性疣和尿道内疣。C.2.2冷冻治疗采用液氮冷冻通过低温使细胞融解，从而破坏疣体，适用于尿道口疣及其他部位较小的疣体。C.2.3手术切除治疗可一次性去除疣体，适用于单发及巨大型尖锐湿疣。C.3补充说明C.3.1上述各种治疗方案并非按选择次序排列，治疗方案的选择应根据患者疣体分布部位、数目、大小、形态、治疗费用、患者依从性、副作用等而定。C.3.2 0.5%足叶草毒素酊、10%〜25%足叶草酯酊和5%5-氟脲嘧啶软膏有致畸作用，孕妇禁用；5%咪喹莫特霜对孕妇的安全性尚未确定。孕妇尖锐湿疣患者可选用50%三氯醋酸溶液外用、激光治疗、冷冻治疗或者手术治疗的方案；尖锐湿疣不是终止妊娠的指征，只有当尖锐湿疣疣体较大以至阻塞产道或者导致严重出血时，才考虑剖腹产。C.3.30.5%足叶草毒素酊、5%氟脲嘧啶软膏和0.5%咪喹莫特霜一般使用较为安全，患者可带回家总自己使用，如有可能，在诊所由医生示范首次治疗，教会患者掌握正确用药方法，对于提高治疗效果，较少不良反应的发生很有裨益。C.3.4 10%〜25%足叶草酯酊和50%三氯醋酸溶液外用以及所有物理疗法均需要医生操作施治，需要有熟练的操作技术。或者具备一定的设备条件。C.3.5 无论何种方案治疗，一旦疣体被除掉，如有感染，应局部外用抗生素软膏，必要时可口服抗生素，以防继发细菌感染。C.3.6 男性包皮过长者是冠状沟、包皮、龟头、尿道口尖锐湿疣的诱发和复发因素，有报告认为尖锐湿疣愈后作包皮环切术能预防复发。C.3.7 部分患者会发生复发，一般复发出现在治疗后初3个月内，再次治疗或改用其他方案仍会有效，要求患者性伴检查和治疗，可以减少复发。生殖器疱疹诊断标准及处理原则1范围本标准规定了生殖器疱疹的诊断标准及处理原则。本标准适用于全国各级性病防治机构、医疗保健机构和卫生防疫机构。2诊断标准接触史有非婚性接触史或配偶感染史。临床表现主要分为原发性和复发性两种临床类型。原发性生殖器疱疹潜伏期2d〜20d（平均6d）。外生殖器或肛门周围有集簇的或散在的小水疱，2d〜4d后破溃形成糜烂或溃疡，自觉疼痛。腹股沟淋巴结肿大，有压痛。常常伴有发热、头痛、乏力等全身症状。病程约2周〜3周。以往从无类似发作史。复发性生殖器疱疹原发皮损消退后，皮疹可反复发作。与原发性生殖器疱疹相比，复发性生殖器疱疹的局部症状和皮损轻微，腹股沟淋巴结肿大少见，全身症状少见，病程较短。起皮疹前，局部有烧灼感、针刺感或感觉异常等前驱症状。外生殖器或肛门周围有集簇的小水疱，很快破溃形成糜烂或浅表溃疡，自觉症状较轻。病程约1周〜2周。以往曾有过类似发作史。实验室检查细胞学检查（Tzanck涂片）以玻片在水疱或溃疡基底部作印片，瑞特染色或姬姆萨染色，显微镜下可见到具有特征性的多核巨细胞或核内病毒包涵体。病毒抗原检测从皮损处取标本，以单克隆抗体免疫荧光试验（1FA）或酶联免疫吸附试验（ELISA）检测单纯疱疹病毒抗原。病毒培养从皮损处取标本作病毒分离培养，发现有单纯疱疹病毒引起的特征性细胞病变。病例分类临床诊断病例具备2.1和2.2指标。确诊病例除了具备2.1和2.2指标外，还具备2.3指标中的任何一项。3处理原则治疗原则及时足量使用抗病毒药物，以减轻症状、缩短病程和控制疾病的传染与复发。临床治愈标准生殖器疱疹是一种不可治愈的病毒性疾病。治疗后，患处皮损完全消退，疼痛、感觉异常及淋巴结肿痛消失，即为临床治愈。管理与预防管理首次诊断的生殖器疱疹病例应报告。预防虽然生殖器疱疹的预防与其他性病有相似之处，但有自身的特点。目前尚无可临床应用的疫苗，因此生殖器疱疹的预防主要包括咨询和健康教育两个方面。咨询包括以下内容：a）告诉患者此病的自然病程，强调其复发生、无症状排毒，无症状期间也可发生单纯疱疹病毒的性传播；b）告诉患者此病的常见复发诱因，避免心理紧张、郁抑或焦虑等不良情绪，通过避免复发诱因可减少复发；c）向所有育龄患者（包括男性患者）请清胎儿和新生儿疱疹感染的危险性；d）告诉原发性感染的患者，抗病毒治疗可缩短疾病复发的病程，抗病毒抑制疗法可减少或预防复发。健康教育对患者和高危人群应加强健康教育，促进其改变性行为，避免非婚性接触，提倡使用安全套。附录A（规范性附录）生殖器单纯疱疹病毒感染的实验室诊断A.1标本的采集A.1.1标本采集部位生殖器疱疹的病损发生于生殖器、肛门及其周围。男性患者常见受累部位为包皮、冠状沟、龟头、阴茎干，少见部位为阴囊、肛周、阴阜、腹股沟、股臀部。女性患者常见受累部位为大阴唇、小阴唇、会阴、肛周、阴道口、宫颈，少见部位为阴阜、腹股沟、股臀部。在男性同性恋者中，常见肛门、直肠受累。原发性生殖器疱疹的病程为2周〜3周，病毒排放的持续时间平均为12d。复发性生殖器疱疹的病程为1周〜2周，病毒排放的持续时间平均为4d。取材时，应尽可能取疱液和溃疡，以提高检查的阳性率。取材后，将标本放入装有1ml〜2ml病毒运送液或Hank's液的小瓶中送检（病毒培养），或直接涂片作细胞学检查或病毒的直接免疫荧光检查。A.1.2标本采集方法A.1.2.1疱液取材用结核菌素注射器和25号（0.5mm口径）针头从成熟水疱或脓疱中抽取疱液，注入到装有1ml〜2ml病毒运送液或者Hank's液的小瓶中，或者刺破水疱后用棉拭子或涤纶拭子取样。A.1.2.2溃疡取材先将溃疡表面痂皮或污物去除，再用棉拭子或涤纶拭子用力擦拭或刮取溃疡基底部和未愈合部位，尤其时溃疡边缘部位的组织液或渗出液。A.1.2.3其他病损标本的采集采集除水疱及溃疡外的其他皮损标本时，先用一棉拭子清除局部污物，再用另一棉拭子反复擦拭红斑丘疹部位取皮肤粘膜上皮细胞，或取痂皮及痂下组织液。采集男性尿道内标本时，将男用尿道拭子伸入尿道内2cm〜4cm,捻转数圈停留10s后取出。采集女性宫颈管标本时，先用一棉拭子擦去宫颈表面粘液，再用另一棉拭子插入宫颈管1cm〜2cm,捻转数圈，停留10s后取出。A.1.3标本运送取材后，若不能立即进行检查，应尽可能将标本洗入病毒运送液中，弃去拭子，置冰浴或4℃送检。A.1.4标本保存用于病毒培养的标本，如在取材当天（24h内）接种，可暂时置4c冰箱保存；如不能当天接种，应置-70℃低温冰箱保存。A.2细胞学检查A.2.1原理HSV感染细胞后，可使细胞产生特征性细胞病变。取细胞作涂片，用显微镜观察细胞的变化，同时观察病毒包涵体形态，有助于诊断。A.2.2方法A.2.2.1涂片用棉拭子或手术刀或刮刀在水疱或溃疡基底部取含有细胞的组织液，直接轻轻涂布于玻片上，制成涂片，室温干燥。A.2.2.2固定皮肤粘膜标本，用甲醛固定5min；宫颈标本，用95%乙醇固定15min〜60min。A.2.2.3染色标本固定后，对皮肤粘膜标本，用Tzanck涂片染色法检查，即用姬姆萨染液或瑞特-姬姆萨（Wright-Giemsa）染液染色15min〜30min。对宫颈标本，用巴氏（Papanicolaou）染色法染色。A.2.3结果标本染色后，在光镜（油镜）下观察结果。感染细胞呈气球样变或出现胞浆空泡，感染细胞可相互融合成多核巨细胞，有时见核内包涵体。A.2.4注意事项原发性生殖器疱疹时，细胞学检查容易成功，皮损早期取材效果较好。具有特征性细胞病变的HSV感染细胞在水疱或溃疡基底数量最多，随着皮损的愈合其数量减少。A.2.5临床意义检查到细胞有特征性病变或见到病毒包涵体，有助于诊断。但这种检查的敏感性为抗原检测法、DNA检测法或病毒培养法的50%〜70%,而且不具有特异性，其他疱疹病毒（如水痘-带状疱疹病毒）感染也可以引起类似的细胞病变。A.3抗原检测A.3.1总述用免疫学方法检测HSV抗原是目前最常用的快速诊断方法。这些方法以抗HSV抗体（单克隆抗体或多克隆抗体，常用单克隆抗体）为基础，包括直接免疫荧光法、免疫酶染色和酶联免疫吸附试验（ELISA）。其中直接以免疫荧光法应用较多，现以之为例作一阐述。A.3.2原理先将异硫氰酸（FITC）和罗丹明等荧光素与特异性抗HSV抗体结合，在一定条件下，再与标本中的相应HSV抗原结合，形成有荧光的抗原-抗体复合物，通过荧光显微镜观察，可看到复合物发出的荧光，即表示标本中存在HSV抗原。A.3.3方法A.3.3.1涂片方法与细胞学检查法相同。A.3.3.2固定用丙酮或甲醛固定标本10min。A.3.3.3漂洗用PBS（pH7.2）漂洗3次，每次1min。A.3.3.4干燥37℃或自然干燥。A.3.3.5染色滴加异硫氰酸（FITC）标记HSV荧光单克隆抗体工作液，置37℃湿盒中，结合30min〜1h。A.3.3.6漂洗用PBS（pH7.2）漂洗3次，每次5min,再用双蒸水洗1次。A.3.3.7干燥37℃或自然干燥。A.3.3.8封片用封片液（由90%甘油和10%的PBS组成）1滴封片。A.3.3.9结果观察在透射或落射荧光显微镜下（紫外线波长495nm）观察结果。结果记录方法：一为无荧光；土为极弱可疑荧光；十为荧光较弱，但清晰可见；++为荧光明亮；+++〜++++为荧闪亮，且范围广泛。A.3.4结果HSV抗原阳性时，上皮细胞的细胞浆和细胞核内可见亮绿荧光；而阴性时，上皮细胞则复染成橙红或暗红色，无亮绿色荧光。A.3.5注意事项A.3.5.1由于组织细胞中存在自然荧光，易出现非特异性结果，每次试验均应设置已知阳性和阴性标本对照。A.3.5.2要选择特异性好、质量可靠的抗体，最好选用单克隆抗体。A.3.6临床意义免疫荧光法的敏感性是病毒分离培养法的70%〜90%、由于方法简单、敏感性和特异性好等优点，免疫荧光试验是目前临床HSV检测的常用方法。A.4病毒培养A.4.1原理通过组织培养法分离培养HSV,每天观察病毒对敏感细胞的细胞病变（cytopathiceffect,CPE）,初步确定病毒的存在。CPE通常是HSV感染的特征性改变，但其他疱疹病毒如水痘-带状疱疹病毒（VZV）、巨细胞病毒（CMV）感染也可引起类似的CPE,因此需要通过免疫学方法（如免疫荧光法、免疫酶法、酶联免疫吸附试验等）和分子生物学方法（如DNA限制性内切酶图谱、DNA探针分子杂交技术）来鉴定和证实病毒的存在，并进行病毒的分型。A.4.2材料A.4.2.1细胞多采用贴壁生长的细胞系或原代细胞，如非洲绿猴肾细胞（Vero）、宫颈癌细胞（Hela）、人胚肺纤维细胞（MRC-5）、乳地鼠肾细胞（BHK）、原代兔肾细胞（PRK）、人胚包皮细胞（HFF）等。各实验室可根据自己的条件和习惯来选择合适的敏感细胞系。A.4.2.2细胞生长培养基含10%小牛血清的RPMI1640培养基。成分:RPMI164016.4g,庆大霉素50U/ml,二性霉素B2ug/ml,新生牛血清10%,万古霉素25Ug/ml,HEPES0.025X10-3mol/L,碳酸氢钠3.0g,L-谷氨酰胺2X10-4mol/L。配制时，双蒸水加至1000ml,用碳酸氢钠调节pH至7.2,正压过滤除菌，4c或-20℃保存备用。A.4.2.3细胞维持培养基含2%小牛血清的RPMI1640培养基。配制时，在细胞生长培养基的基础上，将胎牛血清的浓度由10%改为2%。A.4.3方法A.4.3.1标准的病毒分离培养法A.4.3.1.1单层细胞的准备将冷存的细胞从液氮中取出，置37℃水浴中迅速融化后，将其加入已含有细胞生长培养基的培养瓶中，置37℃孵育8h,待细胞贴壁后换新鲜生长培养基，继续培养2d〜3d。细胞融合成单层后，弃培养基，用适量胰蛋白酶溶液于37℃消化细胞单层4min〜5min,让细胞完全离散后加入生长培养基，用吸管吹打细胞使之均匀混悬。用血球计数器计数细胞，再以生长培养基作稀释，使其达到所需细胞浓度（大约105/ml）。然后分装于24孔培养板中，每孔加入0.5ml细胞悬液。在5%二氧化碳（CO2）、37℃及湿润空气环境下培养1d〜2d,待细胞基本长成单层（约80%的细胞汇合）后，即可用于标本接种。A.4.3.1.2标本接种将临床标本在漩涡振荡器上振荡混匀，如果是冷存标本，则从70℃取出后立即置37℃水浴迅速融化，然后混匀。将细胞单层的培养基吸去，每孔加入标本0.2ml〜0.5ml,每份标本接种1孔〜2孔。在5%二氧化碳（CO2）、