分解纤维素的微生物的分离

分解纤维素的微生物的分离JLSSYBYH㈠纤维素与纤维素酶1.纤维素

纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。一、基础知识

植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素。其中棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。土壤中某些微生物能够产生纤维素酶,把纤维素分解为葡萄糖，后再利用。纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中40%-60%能被土壤中能产生纤维素酶的微生物所利用，不会大量积累。在草食性动物等的消化道内，也共生有分解纤维素的微生物，其原理也是产生纤维素酶而分解纤维素，而人没有分解纤维素的能力。人类可应用分解纤维素的微生物将秸秆等废弃物转变成酒精，用纤维素酶处理服装面料等。2.纤维素酶

纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶(外切酶)、CX酶(内切酶)和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维二糖C1酶、Cx酶葡萄糖苷酶葡萄糖纤维素①取二支20mL的试管实验：纤维素酶分解纤维素的实验②各加入一张滤纸条③各加入pH4.8，物质量为0.1mol/L的醋酸－醋酸钠缓冲液11ml和10ml甲乙④在乙试管中加入1mL纤维素酶⑤两支试管固定在锥形瓶中，放在140r/min的摇床上振荡1h⑥结果：乙试管的滤纸条消失

讨论：乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是什么？提示：本实验的自变量是纤维素酶的有无，自变量的操纵方法是：在一支试管中添加适量（1mL）的纤维素酶溶液，在另一支试管不添加纤维素酶，但需加入等量的缓冲液，不能加入蒸馏水，否则会影响溶液的pH。实验分析：P27的小实验是如何构成对照的？刚果红染色法

刚果红能与纤维素形成红色复合物，而不与水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。

（二）纤维素分解菌的筛选

当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红-纤维素的复合物就无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，这样我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。二、实验设计

请你根据实验流程图和提供的三个资料以及“操作提示”，在思考有关问题的基础上，设计出一个详细的实验方案。土壤取样选择培养梯度稀释将样品涂布在鉴别纤维素分解菌的培养基上筛选产生透明圈的菌落①分分布布环环境境1、、土土壤壤取取样样：：富含含纤纤维维素素的的环环境境中中操作作步步骤骤生物物与与环环境境的的互互相相依依存存关关系系，，在在富富含含纤纤维维素素的的环环境境中中纤纤维维素素分分解解菌菌的的含含量量相相对对提提高高，，因因此此从从这这种种土土壤壤中中获获得得目目的的微微生生物物的的几几率率要要高高于于普普通通环环境境。。②原因③实例：：树林中中多年落落叶形成成的腐殖殖土，多多年积累累的枯枝枝败叶等等。④讨论:如果找找不到合合适的环环境，可可以将滤滤纸埋在在土壤中中，将滤滤纸埋在在土壤中中有什么么作用？？你认为为滤纸应应该埋在在土壤中中多深？？将滤纸埋埋在土壤壤中能使使纤维素素分解菌菌相对集集中，实实际上是是人工设设置纤维维素分解解菌生存存的适宜宜环境。。一般应应将滤纸纸埋于深深约10cm左左右的土土壤中。。2、选择择培养增加纤维维素分解解菌的浓浓度，以确保保能够从从样品中中分离所所需要的的微生物物。①目的：：②制备选择择培养基基：③操作：：将土样加加入装有有30ml选择择培养基基的锥形形瓶中，，将锥形形瓶固定定在摇床床上，在在一定温温度下震震荡培养养1～2天，直直至培养养液变浑浑浊。也也可重复复选择培培养。培养基成成分分析析培养基组成提供主要的营养物质纤维素粉5g碳源（能源）NaNO31g氮源、无机盐KCl0.5gNa2HPO4·7H2O1.2gKH2PO40.9gMgSO4·7H2O0.5g无机盐酵母膏0.5g生长因子、碳源、氮源水解酵素0.5g氮素、生长因子溶解后，蒸馏水定容至1000mL水提示：自自变量为为培养基基的种类类，即普普通培养养基和选选择培养养基。可可用牛肉肉膏蛋白白胨培养养基与之之对照,或者将将纤维素素改为葡葡萄糖。。A、旁栏栏中的配配方是液液体培养养基还是是固体培培养基？？为什么么？是液体培培养基，，原因是是配方中中无凝固固剂（琼琼脂）B、这个个培养基基对微生生物是否否具有选选择作用用？如果果具有，，是如何何进行选选择的？？有选择作用用，本配方方中纤维素素作为主要要碳源，只只有能分解解纤维素的的微生物可可以大量繁繁殖。C、你能否否设计一个个对照实验验，说明选选择培养基基的作用说明：分析“纤维维素分解菌菌的选择培培养基配方方”可知，该配配方中的酵酵母膏也能能够提供少少量的碳源源，因此其其他微生物物也能在该该培养基中中生长繁殖殖。只不过过，由于酵酵母膏的含含量极少，，因此，只只有以纤维维素为碳源源的微生物物才能大量量繁殖。在选择培养养的条件下下，可以使使那些能够够适应这种营养条条件的微生生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条条件的微生生物的繁殖殖被抑制，因此可以以起到“浓浓缩”的作作用。为什么选择择培养能够够“浓缩””所需的微微生物？比较项目分解尿素的细菌纤维素分解菌选择培养基原理培养基类型目的鉴定培养基原理现象方法将细菌涂布布在只有尿素做氮源源的选择培养基上将细菌涂布布在只有纤维素粉做做碳源的选择培养基基上固体培养基基液体培养基基筛选菌株选择培养思考：本实实验的流程程与课题2中的实验验流程有哪哪些异同？？本实验流程程与课题2的流程的的区别如下下。课题2是将土样样制成的菌菌悬液直接接涂布在以尿素为唯唯一氮源的的选择性培培养基上，，直接分离离得到菌落。。本课题通通过选择培养，，使纤维素素分解菌得得到增殖后后，再将菌液涂涂布在选择择培养基上上。其他步步骤基本一一致。按照课题1的稀释操操作方法，，将选择培培养后的培培养基进行行等比稀释释101～107倍。3.梯度稀稀释1011021031041051064.将样品品涂布到鉴别纤维素素分解菌的培养基上（1）制备备鉴别培养养基:（2）涂布布平板：将稀释度为为104～106的菌悬液各各取0.1ml涂布布到平板培培养基上，，30℃倒倒置培养。。培养基组成提供的主要营养物质CMC-Na5~10g碳源酵母膏1g碳源、氮源、生长因子KH2PO40.25g无机盐土豆汁100mL碳源、生长因子琼脂15g凝固剂上述物质溶解后，加蒸馏水定容至1000mL氢元素、氧元素鉴别纤维素素分解菌的的培养基(水溶性羧羧甲基纤维维素钠)方法一：先先，再加入刚刚果红进行行颜色反应应。方法二：在在时就加入刚刚果红。培养微生物物倒平板5.刚果红红染色法挑选产生透透明圈的菌菌落，一般般即为分解解纤维素的的菌落。这两种方法法各有哪些些优点与不不足？染色法优点缺点方法一方法二颜色反应基基本上是纤纤维素分解解菌的作用用操作繁琐刚果红会使使菌落之间间发生混杂杂操作简便不不存在菌落落混杂问题题1.产生淀淀粉酶的微微生物也产产生模糊透透明圈2.有些微微生物能降降解色素，，形成明显显的透明圈圈。比较项目分解尿素的细菌纤维素分解菌选择培养原理培养基类型目的鉴定培养基原理现象方法在细菌分解解尿素的化化学反应中，细菌合合成的脲酶酶将尿素分解成了氨氨，氨会使使培养基的碱性增强强，pH升升高。在培培养基中加入入酚红指示示剂，如果pH升高高指示剂会会变红刚果红可以以与纤维素素形成红色复合物物，当纤维维素被纤维素酶催催化分解后后红色复合物无法法形成，培培养基上就会出现现以纤维素素分解菌为中心的的透明圈观察菌落周周围是否有有着色的环带出现来来鉴定尿素素分解菌观察菌落周周围是否出出现透明圈来筛筛选纤维素素分解菌脲酶检测法法刚果红染色色法方法一中NaCl溶溶液的作用用？思考：漂洗作用，洗去与纤纤维素结合合不牢的刚刚果红，以以免出现的的透明圈不不够清晰。。用这方法法可以判断断酶活力的的大小，实实际上刚果果红是结合合到培养基基的多糖底底物，但分分解纤维素素的细菌可可以产生纤纤维素酶，，能分解这这个多糖底底物成为单单糖，这样样刚果红就就不能结合合上去了，，氯化钠溶溶液就可以以使结合不不牢的刚果果红洗去，，这样就留留下大大小小小的透明明圈，大的的透明圈当当然分解纤纤维素的能能就强！在产生明显的的透明圈的菌落，挑挑取并接种种到纤维素素分解菌的的选择培养养基上，在在300C－370C培养，可可获得纯化培养。6、纯化培培养四、结果分分析与评价价1.培养基基的制作是是否合格以以及选择培培养基是否否筛选出菌菌落对照的培养养基在培养养过程中没没有菌落生生长则说明明培养基制制作合格。。如果观察到到产生透明明圈的菌落落，则说明明可能获得得了分解纤纤维素的微微生物。2.分离的的结果是否否一致由于在土壤壤中细菌的的数量远远远高于真菌菌和放线菌菌的数量，，因此最容容易分离得得到的是细细菌。但由由于所取土土样的环境境不同，不不同同学也也可能得到到真菌和放放线菌等不不同的分离离结果。为了确定分分离得到的的是纤维素素分解菌，，还需要进进行_____________实验验，纤维素素酶的发酵酵方法有______发酵酵和______发发酵。纤纤维素酶测测定方法是是对纤维素素酶分解滤滤纸等纤维维素所产生生的________含量量进行定量量测定。发酵产纤维维素酶液体固体葡萄糖五、课题延延伸分解纤维素的微