药物定量分析与分析方法验证

第四章药物的含量测定方法与验证2022/12/7第一页，共八十一页。定量分析方法的分类与特点

1样品分析的前处理方法2药品质量标准分析方法验证32022/12/7第二页，共八十一页。第一节

定量分析方法的分类与特点

一、容量分析法二、光谱分析法三、色谱分析法2022/12/7第三页，共八十一页。一、容量分析法(一)特点与适用范围(1)方法简便易行(2)方法耐用性高(3)测定结果准确(4)方法专属性差适用于原料药含量测定(二)有关计算:1.滴定度与滴定度计算2.含量计算

(1)直接滴定法

(2)间接滴定法生成物滴定法剩余量滴定法

将已知浓度滴定液滴加至被测药物溶液中,至滴定终点,根据滴定液的浓度,体积和滴定度,计算含量.2022/12/7第四页，共八十一页。结果计算1、滴定度的计算aA+bB=cC+dD;cC+eE=fF+gG;

滴定反应fF+hH=iI+lLaAhH

m:滴定剂摩尔浓度；M被测物摩尔质量；a/h:反应摩尔比2022/12/7第五页，共八十一页。2.含量测定直接滴定法

生成物滴定法剩余量滴定法(1)(2)(3)2022/12/7第六页，共八十一页。(1)直接滴定法注意掌握滴定反应的原理,药物与滴定剂在反应中的摩尔比正确计算滴定度和百分含量2022/12/7第七页，共八十一页。(2)生成物滴定法注意摩尔比的替换药物与A作用生成B,用滴定液滴定B百分含量计算方法与直接滴定法相同2022/12/7第八页，共八十一页。（3）回滴定（剩余滴定）（a）不做空白试验时百分含量计算（b）做空白试验时百分含量计算

2022/12/7第九页，共八十一页。

司可巴比妥钠含量测定:本品约0.1g,加水10ml溶解,精密加溴滴定液(0.05mol/L)25ml,再加盐酸5ml,放置15分钟,加碘化钾试液10ml,用硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)滴定,滴定的结果用空白试验校正W=0.1022g;硫代硫酸钠滴定液F=1.038;供试品消耗硫代硫酸钠滴定液15.73ml;空白23.21ml2022/12/7第十页，共八十一页。滴定度司可巴比妥钠M=260.27,与溴摩尔比为1:12022/12/7第十一页，共八十一页。二、光谱分析法定义分类

UV-Vis利用物质的光谱进行定性、定量和结构分析的方法——光谱分析法

IR

AA

FluorFP(flamephotometry)2022/12/7第十二页，共八十一页。三、色谱分析法特点与应用分类

依据分离原理：(1)高灵敏度:ng-µg/ml(2)高专属性:选择性检测(3)高效能与高速度吸附;分配;离子交换;分子排阻色谱法

复方制剂含量测定的首选方法依据分离方式：纸色谱;薄层色谱;柱色谱;气相色谱;高效液相色谱法

2022/12/7第十三页，共八十一页。第二节样品分析的前处理方法一、不经有机破坏的前处理方法二、经有机破坏的前处理方法(一)水解法;(二)还原法(一)干法破坏;(二)湿法破坏2022/12/7第十四页，共八十一页。

进行药物定量分析之前，一般都需要对样品进行前处理。根据待测元素在药物分子中结合的牢固程度，前处理方法各异。在分析含金属或含卤素、氮、硫、磷等元素的有机药物前，需进行适当的样品前处理。2022/12/7第十五页，共八十一页。含卤素有机药物系指药物分子结构中所含卤素直接与芳环或脂肪链相连者，而不包括某些有机药物的卤酸盐或氢卤酸盐。2022/12/7第十六页，共八十一页。一、不经有机破坏的方法

1.酸水解法水难溶性含金属有机药物与矿酸(盐酸)共热:

回流有机结合的待测元素原子离解,转化为无机盐(离子)2.碱水解法含卤素有机药物(脂肪碳链)与氢氧化钠溶液回流:适用于:结合不牢固的含金属或含卤素有机药物(一)水解法2022/12/7第十七页，共八十一页。碘他拉酸测定:氢氧化钠试液与锌粉回流后,用硝酸银滴定回流碱性溶液中加锌粉回流,使碳-碘键还原转化为无机碘化物碘番酸胆影酸胆影葡胺注射液泛影酸泛影酸钠泛影葡胺注射液

适用于:结合牢固的含碘有机药物

(直接与芳环连接)

(二)还原法2022/12/7第十八页，共八十一页。常见的含卤素有机药物三氯叔丁醇六氯对二甲苯2022/12/7第十九页，共八十一页。泛影酸2022/12/7第二十页，共八十一页。胆影酸2022/12/7第二十一页，共八十一页。碘他拉酸2022/12/7第二十二页，共八十一页。碘番酸2022/12/7第二十三页，共八十一页。I碘苯酯盐酸胺碘酮2022/12/7第二十四页，共八十一页。诺氟沙星2022/12/7第二十五页，共八十一页。醋酸氟轻松2022/12/7第二十六页，共八十一页。磺溴酞钠2022/12/7第二十七页，共八十一页。含卤素有机药物的分析直接回流后测定法碱性或酸性还原后测定法氧瓶燃烧分解后测定法2022/12/7第二十八页，共八十一页。

有机金属药物：金属原子直接与碳原子以共价键相连，结合比较牢固如卡巴胂、醋酸苯汞、汞撒利2022/12/7第二十九页，共八十一页。酒石酸锑钾2022/12/7第三十页，共八十一页。硬脂酸镁富马酸亚铁2022/12/7第三十一页，共八十一页。葡萄糖酸锑钠2022/12/7第三十二页，共八十一页。卡巴胂醋酸苯汞2022/12/7第三十三页，共八十一页。汞撒利2022/12/7第三十四页，共八十一页。二、经有机破坏的方法(一)湿法破坏

适用于含氮有机药物分析的前处理

硫酸作为分解剂,氧化剂(硝酸,高氯酸)辅助分解剂

凯氏定氮法

(二)干法破坏高温炽灼法用于含卤素药物的鉴别无水碳酸钠,硝酸镁,氢氧化钙,氧化锌等辅助灰化

2.氧瓶燃烧法适用于:

含金属,卤素,氮,硫,磷等有机药物

(待测原子与碳原子结合牢固者)2022/12/7第三十五页，共八十一页。1.高温炽灼法高温灼烧灰化用于含卤素药物的鉴别2.氧瓶燃烧法2022/12/7第三十六页，共八十一页。

（1）

氧瓶燃烧法原理

氧瓶燃烧法：将有机药物放入充满氧气的密闭燃烧瓶中进行燃烧，并将燃烧所产生的欲测物质吸收于适当的吸收液中，然后根据欲测物质的性质，采用适宜的分析方法进行鉴别、检查或含量测定。2022/12/7第三十七页，共八十一页。适用于含卤素、硫、氮、硒等有机药物的分析。本法特点是简便、快速、破坏完全，尤其适用于微量样品的分析。2022/12/7第三十八页，共八十一页。（2）仪器与材料

①仪器装置

燃烧瓶为500、1000或2000ml无色、磨口、厚壁、硬质玻璃锥型瓶；瓶塞空心，底部熔封铂丝一根，下端呈螺旋状或网状2022/12/7第三十九页，共八十一页。②称样用材料及称样A.固体样品无灰滤纸B.液体样品纸袋C.软膏类样品：将适量样品置不含被测成分的蜡油纸中包裹严密，外层再用无灰滤纸包裹2022/12/7第四十页，共八十一页。③氧气④吸收液A.作用：吸收液的作用是将样品经燃烧分解所产生的各种价态的卤素、硫、氮、硒等，定量地吸收并转变为一定的便于测定的价态2022/12/7第四十一页，共八十一页。B.吸收液的选择氟水氯

NaOH溶液溴

H2O2-NaOHNaOH-硫酸肼饱和溶液碘

NaOH－硫酸肼饱和溶液硫

NaOH或H2O2

硒硝酸溶液2022/12/7第四十二页，共八十一页。（3）操作方法①燃烧瓶燃烧前的准备用洗液洗净后，按各药品项下的规定加入吸收液，将瓶口用水湿润，小心急速地通入氧气1min，立即用表面皿覆盖瓶口。②样品的准备取样品适量，精密称定后按规定方法包裹，固定于铂丝下端的网内或螺旋处。2022/12/7第四十三页，共八十一页。③样品的燃烧点燃包有供试品的滤纸尾部，迅速放入燃烧瓶中，按紧瓶塞，加水少量封闭瓶口，待燃烧完毕（应无黑色碎片），充分振摇，使生成的烟雾完全吸入吸收液中，放置15min，用水少量冲洗瓶塞及铂丝，合并洗液及吸收液，同法另做空白试验。然后按各药品项下规定的方法进行鉴别、检查或含量测定。2022/12/7第四十四页，共八十一页。①根据被燃烧分解的样品量选用适宜大小的燃烧瓶。ChP（2005）规定的燃烧瓶体积为500、1000或2000ml三种，采用常量或半微量分析注意事项：2022/12/7第四十五页，共八十一页。待分解样品量燃烧瓶的体积

3~5mg（微量分析）

150~250ml

20~30mg（半微量分析）

300~500ml

50~60mg

1000ml

0.6~0.7g或更多

2000ml或特殊结构的燃烧瓶2022/12/7第四十六页，共八十一页。

正确选用燃烧瓶的目的在于：样品能在足够的氧气中燃烧分解完全；有利于将燃烧分解产物较快地吸收到吸收液中；防止爆炸的可能性。2022/12/7第四十七页，共八十一页。②测定含氟有机药物时，用石英制燃烧瓶③铂丝燃烧时起催化作用④应同时做空白试验⑤燃烧时要注意防爆⑥燃烧要完全⑦燃烧产生的烟雾完全被吸收2022/12/7第四十八页，共八十一页。应用例磺溴酞钠的含量测定ChP(2005)2022/12/7第四十九页，共八十一页。燃烧分解O2HBr+S2-+SO4+…

HBr+S2-NaBr+Na2SO4

+H2O

NaOH,H2O22022/12/7第五十页，共八十一页。含金属的有机药物：金属原子不与碳原子直接相连，通常为有机酸及酚的金属盐或配位化合物如酒石酸锑钾、葡萄糖酸锑钠、富马酸亚铁2022/12/7第五十一页，共八十一页。需验证的项目验证的内容准确度定量限防腐剂溶出度,释放度鉴别试验杂质检查含量测定第三节药品质量标准分析方法验证

精密度专属性检测限线性范围耐用性重复性中间精密度重现性2022/12/7第五十二页，共八十一页。一、准确度（accuracy）：测量值与真实值接近的程度表示:回收率测定方法：回收试验加样回收试验2022/12/7第五十三页，共八十一页。（一）含量测定方法的准确度1、原料药回收试验：

空白+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M2022/12/7第五十四页，共八十一页。加样回收试验：已准确测定药物含量P的真实样品+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M。2022/12/7第五十五页，共八十一页。

原料药

（1）可用已知纯度的对照品或样品进行测定（2）用本法所得结果与已建立准确度的另一方法测定的结果进行比较。

2022/12/7第五十六页，共八十一页。

2、制剂（1）用含己知量被测物的各组分混合物进行测定，即采用在空白辅料中加入原料药对照品的方法。（2）如不能得到制剂的全部组分，可向制剂中加入已知量的被测物进行测定。（3）另一个已建立准确度的方法比较结果。2022/12/7第五十七页，共八十一页。2022/12/7第五十八页，共八十一页。

中药

分析的准确度一般用加样回收试验衡量。中药回收率一般要求在95～105%范围内，有些方法操作步骤繁多时，可要求在90～110%范围内。RSD一般在3%以内。2022/12/7第五十九页，共八十一页。（二）杂质定量测定的准确度（1）可向原料药或制剂中加入已知量杂质进行测定。（2）如果不能得到杂质或降解产物，可用本法测定结果与另一成熟的方法进行比较。2022/12/7第六十页，共八十一页。（三）数据要求规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如制备三个不同浓度样品各测三次。2022/12/7第六十一页，共八十一页。二、精密度1.重复性同一分析人员连续测定所得结果的精密度;也称批内精密度或日内精密度2.中间精密度不同时间不同分析人员用不同设备测定结果之间的精密度批/日间精密度

3.重现性

在不同实验室不同人员测定结果之间的精密度

法定标准采用的分析方法进行

同一均匀供试品多次取样测定所得结果之间的接近程度标准偏差(s,SD);相对标准偏差(RSD)数据要求同“准确度”定义2022/12/7第六十二页，共八十一页。偏差（d）：测量值与平均值之差标准（偏）差（SD或S）:2022/12/7第六十三页，共八十一页。三、专属性（specificity）:指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性)。2022/12/7第六十四页，共八十一页。(一)鉴别反应空白,结构相似物或有关物质呈负反应(二)含量与杂质测定含杂质或降解产物的试样中各峰能获得分离在其他成分(杂质,降解产物,辅料等)可能存在下,方法能正确测定出被测物的特性鉴别,杂质检查和含量测定方法

定义与应用2022/12/7第六十五页，共八十一页。四、检测限（limitofdetection，LOD）：药物能被检出的最低浓度(µg/ml)

测定:信噪比法(S:N=3:1)2022/12/7第六十六页，共八十一页。适用于可用目视法直接评价结果的分析方法,非仪器分析法鉴别的显色法;杂质检查的TLC适用于能直观显示信号与基线噪声水平的分析方法,如HPLC法

信噪比S/N=3(2)时的相应浓度或量适用于不能直观比较信噪比的仪器分析方法,如UV-Vis法

常用方法

1.目视法

2.信噪比法

3.标准偏差法

2022/12/7第六十七页，共八十一页。五、定量限杂质和降解产物用定量方法研究时,应确定LOQLOQ的测定方法与LOD相同相应的系数(倍数)不同,如信噪比S/N=10定量限(limitofquantitation,LOQ

)是指试样中被测物能被定量测定的最低量;2022/12/7第六十八页，共八十一页。六、线性范围系指方法适用的高低限浓度或量的区间在试验研究开始前确定验证的范围和方法在范围内应能达到一定精密度,准确度和线性线性系指在设计的“范围”内,响应值(y)与被测物浓度(x)直接呈正比关系的程度y=ax+b系列(n≥5)供试样品测定,以响应信号作为被测物浓度的函数作图用最小二乘法进行线性回归;或经数学转换后再进行线性回归2022/12/7第六十九页，共八十一页。七、范围原料药/制剂含量测定:80%~120%制剂含量均匀度检查:70%~130%溶出度或释放度检查:下限-20%~上限+20%特殊元素含量测定:下限-20%~上限+20%杂质测定: 限度±20%

涉及定量测定的项目均需对范围进行验证 如:含量测定,含量均匀度,溶出度或释放度,特殊元素或特殊杂质的定量检查2022/12/7第七十页，共八十一页。八、耐用性耐用性系指在测定条件有小的变动时,测定结果不受影响的承受程度;体现测定条件的允许变动范围HPLC法典型因素有:流动相的组成和pH值及流速,不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱,柱温等GC法典型因素有:不同厂牌或批号的色谱柱,固定相,不同类型的担体,柱温,进样口和检测器温度等2022/12/7第七十一页，共八十一页。九、验证内容的选择

验证内容选择的一般原则:非定量分析方法

如鉴别,杂质的限度检查法:

验证“专属性”,“检测限”和“耐用性”定量分析方法

如原料药或制剂的含量测定及含量均匀度,溶出度或释放度的测定方法:

除“检测限”和“定量限”外,其余均验证微量定量分析方法

如杂质的定量测定方法:

除“检测限”视情况而定外,其余均验证2022/12/7第七十二页，共八十一页。检验项目和验证内容：项目内容鉴别杂质测定含量测定及溶出量测定定量限度准确度＋＋精密度－＋重复性＋＋中间精密度＋①＋①专属性②＋＋＋＋检测限－③＋－定量限＋－线性＋＋范围＋＋耐用性＋＋＋①已有重现性验证，不需验证中间精密度②如一种方法不够专属，可用其他分析方法予以补充③视具体情况予以验证2022/12/7第七十三页，共八十一页。各种含量测定方法对效能指标的要求

1.容量分析法：用原料药精制品(含量>99.5％)或对照品考察方法的精密度，相对标准差一般应不大于0.2％；进行回收率试验。回收率一般在99.7～100.3％之间。

2022/12/7第七十四页，共八十一页。

2.UV法：用适当浓度的精制品进行测定，其RSD一般不大于1％。制剂的测定，回收率一般应在98％～102％之间。2022/12/7第七十五页，共八十一页。线性：吸光度A一般在0.2～0.7，浓度点n＝5。用浓度c对A作线性回归处理，得一直线方程，R应大于0.999(n＝5)，方程的截距应近于零。2022/12/7第七十六页，共八十一页。

3.HPLC法：要求RSD<2％，回收率98％～102％之间。线性范围：用精制品配制一系列标准溶液，浓度点n应为5～7，用浓度c对峰高h或被测物的响应值之比进行回归处理，建立回归方