体内药物方法的建立与验证

第四章

体内药物分析

方法的建立与验证12/7/20221体内药物分析分析方法的设计依据分析方法建立的一般步骤分析方法验证的内容与要求体内药物分析应用示例本章内容提要第四章分析方法的建立与验证12/7/20222体内药物分析第一节

分析方法的设计依据建立分析检测方法的主要依据待测药物的理化性质及在生物体内的存在状况分析测定的目的与要求生物样品的类型与预处理方法实验室条件第四章分析方法的建立与验证12/7/20223体内药物分析一、待测药物的理化性质及体内存在状况准确测定生物样品中的药物或其特定代谢物 ——预处理——待测物从结合物或缀合物中释放选择样品预处理方法——首先应考虑 ——待测药物的理化性质 ——药物在生物体内的存在状况 ——药物在生物体内的生物转化(代谢)途径第四章分析方法的建立与验证第一节分析方法的设计依据12/7/20224体内药物分析(一)待测药物的理化性质 药物的pKa值、亲脂性、溶解度、分配系数等——预处理及检测方法 具有亲脂性——在适当的pH值下用溶剂萃取 具有强极性或亲水性——沉淀蛋白、固相萃取、离子对萃取或衍生化后萃取等 具有挥发性——GC测定法 具有光谱或电化学特性——分析检测方法 药物的稳定性——萃取浓缩技术 对酸碱不稳定——避免使用强酸或强碱性溶剂 对热不稳定——避免高温蒸发溶剂第四章分析方法的建立与验证第一节分析方法的设计依据12/7/20225体内药物分析(二)待测药物的体内存在状态与血浆蛋白结合的强弱及结合率的高低 ——分离萃取方法

蛋白结合较强——不宜直接采用溶剂萃取体内浓度高低、代谢过程及其代谢产物 ——分析检测技术

浓度较低（尤其有代谢产物共存） ——代谢产物的干扰与特定代谢产物的同时测定 ——采用LC-MS、EIA等分析检测技术第四章分析方法的建立与验证第一节分析方法的设计依据12/7/20226体内药物分析二、分析测定的目的与要求

体内药物分析的目的——影响分析方法的应用

药代动力学——研究药物在体内吸收、分布、代谢和排泄过程 ——血浆浓度随时间的变化过程；代谢途径及代谢产物

要求 ——同时测定原形药物和代谢产物

检测 ——宽线性范围(Cmax～Cmax的1/20)、高灵敏度(10-9g/ml)和高专属 性(分离能力)(原形药物及其代谢产物的分离)

方法 ——不必强调方法的简便、快速； ——大多采用色谱及其脱线或在线联用技术，如HPLC、LC-MS第四章分析方法的建立与验证第一节分析方法的设计依据12/7/20227体内药物分析二、分析测定的目的与要求

临床治疗药物监测

有效治疗浓度范围内药物浓度

方法——尽量简便、易行；适用于长期、批量样品的测定 ——大多采用UV、RIA或EIA等

中毒患者的临床抢救

药物浓度极高

方法——不必强调方法的灵敏度，强调方法的特异性和分析速度 ——大多采用色谱及其联用技术GC、GC-MS、RIA或EIA第四章分析方法的建立与验证第一节分析方法的设计依据12/7/20228体内药物分析三、生物样品的类型与预处理方法

生物样品的类型与预处理方法——决定分析方法的应用

以血浆或血清为分析样品

采用蛋白沉淀-溶剂萃取预处理技术 ——分析样品较为“干净”，可用HPLC检测

用RIA分析 ——样品的预处理方法可较为粗放 ——经过简单的蛋白沉淀或不经任何预处理直接测定第四章分析方法的建立与验证第一节分析方法的设计依据12/7/20229体内药物分析四、实验室条件 在设计体内药物分析方法时，还应充分考虑到实验室现有的或有可能在其它实验室使用的仪器装备，合理选择可行的分析方法。第四章分析方法的建立与验证第一节分析方法的设计依据12/7/202210体内药物分析第二节节分析方方法建建立的的一般般步骤骤一、分分析方方法的的选择择二、分分析方方法的的建立立(一)检检测测条件件的筛筛选(二)分分离条条件的的筛选选第四章章分分析析方法法的建建立与与验证证12/6/202211体内药物分分析一、分析方方法的选择择体内药物分分析方法的的设计生物样品中中的药物浓度——决定分分析方法的的首要因素生物样品中中药物或其其特定代谢谢产物的浓度低、样样品量少——难以通通过增加取样量量提高方法灵灵敏度——通过选择适当的的分析方法法适应样品分分析需求体内药物分分析中常用用分析方法法——特点点见表4-1第四章分分析方法法的建立与与验证第二节分分析方法法的建立步步骤12/6/202212体内药物分分析二、分析方方法的建立立分析方法建建立之前查阅文献资资料——充充分了解药药物在体内内的动力学过程程，使所拟定的的分析方法法——避免受到代代谢产物的的干扰适用用于实际生生物样品测测定第四章分分析方法法的建立与与验证第二节分分析方法法的建立步步骤12/6/202213体内内药药物物分分析析二、、分分析析方方法法的的建建立立初步步拟拟定定分分析析方方法法后后进行行一一系系列列试试验验工工作作————选择择最最佳佳分分析析条条件件同时时验证证分分析析方方法法的的可可行行性性————确认认是是否否适适用用于于实实际际生生物物样样品品分析析方方法法的的建立立和验证证过程程————是是不不可可截截然然划划分分的的———为为便便于于讨讨论论而而分分别别叙叙述述分析析方方法法的的建建立立步步骤骤第一一步步：：检检测测条条件件的的筛筛选选第二二步步：：分分离离条条件件的的筛筛选选第四四章章分分析析方方法法的的建建立立与与验验证证第二二节节分分析析方方法法的的建建立立步步骤骤12/6/202214体内药物分析析(一)检测条条件的筛选标准物质——照拟定定的分析方法法(不包括生物基基质的预处理理)测定——确定最佳分析析检测条件(如色谱条件)和检测灵敏度HPLC——调整检测器(类型、条件)色谱柱(型号、牌号、、填料性状与与粒经、柱长长度)流动相(组分及其配比比)及其流速柱温、进样量、内标物质的浓度及其加加入量等——使各物物质具有足够的方法灵敏度(LOQ)良好的色谱参数(n、R、T)适当的保留时间(tR)第四章分分析方法的建建立与验证第二节分分析方法的建建立步骤12/6/202215体内药物分析析(二)分离条条件的筛选在进行分离条条件筛选时，，应考察生物物基质中的内内源性物质及及代谢产物对对分离与检测测的干扰，步步骤如下：1．空白溶剂试验验——溶剂(方法特异性)2．空白生物基质质试验——endogenouscompounds(方法特异性)3．模拟生物样品品试验——方法效能指标标4．实际生物样品品测试——代谢产物(方法特异性)第四章分分析方法的建建立与验证第二节分分析方法的建建立步骤12/6/202216体内药物分析析1．空白溶剂剂试验待测药物的非生物基质溶溶液（通常为水溶溶液）——采用拟定的分析方方法进行衍生化反应、、萃取分离等等样品预处理（反应试剂、、衍生化试剂剂、萃取溶剂剂等）——测定响应信号（如HPLC峰面积或峰高高）考察目标——方法的特异性——空白值应尽可可能小，并能能有效校正第四章分分析方法的建建立与验证第二节分分析方法的建建立步骤12/6/202217体内药药物分分析色谱分分析法法——可可通过过改变反反应条条件、、萃取取方法法或萃萃取条条件（萃取取溶剂剂的极极性、、混合合溶剂剂的配配比，，固相相萃取取填料料性质质、冲冲洗剂剂与洗洗脱剂剂及其其用量量等）），甚甚至检测器器类型型——空空白试试剂信信号应应不干扰扰药物物的测测定（如R＞1.5）本步骤骤主要要考察察——需经化化学反反应的预处处理过过程，若预预处理理过程程仅为为生物物样品品的提提取分分离，，则可可不进进行该该步骤骤，直直接进进行空空白生生物基基质试试验第四章章分分析析方法法的建建立与与验证证第二节节分分析析方法法的建建立步步骤12/6/202218体内药物分分析2.空白白生物基质质试验空白生物基基质(blankbiologicalmatrix)——如空白血浆——照“1.空白溶剂试试验”项下方方法操作考察目标——生物基基质中内源性物质质对测定的干干扰（方法特异异性）——在待测测药物(或或特定的活活性代谢物物、内标物物质等)的的“信号窗”（信号附附近的有限限范围）内内不应出现现内源性物质质信号第四章分分析方法法的建立与与验证第二节分分析方法法的建立步步骤12/6/202219体内药物分分析3.模拟拟生物样品品试验模拟生物样样品(质量量控制,QC样品)——空白白生物基基质中加加入待测测药物——照“1.空白溶剂剂试验”项下下方法操操作考察目标标——方法法的线性范围围、精密度与与准确度度、灵敏度药物的萃取回收收率等各项技技术指标标——同时时进一步检验生物物基质中中内源性性物质以以及可能能共同使使用的其其他药物物对测定定的干扰扰程度，，即方法特异异性第四章分分析析方法的的建立与与验证第二节分分析析方法的的建立步步骤12/6/202220体内药物物分析色谱分析析法——进一一步考察察待测药药物(或或内标物物)与内内源性物物质(或或其它药药物)的的分离情况况——色谱谱峰的tR、n和T是否与水水溶液的的一致色谱峰是是否为单一成分分标准曲线线的截距距是否显显著偏离零点点等——内源性物物质是否对待待测药物物或内标标物质构成干扰扰第四章分分析析方法的的建立与与验证第二节分分析析方法的的建立步步骤12/6/202221体内药物分析析4.实际生生物样品的测测试空白生物基质质和模拟生物物样品试验———确定的分分析方法及其其条件——不能完全全确认是否适适合于实际生生物样品的测测定——药物在体体内可能与内内源性物质结结合(如血浆蛋白结合合物)或代谢生成数数个代谢产物及其进一步的的结合物(或缀合物)实际生物样品品——确立分析方法法后，尚需进行实际际生物样品的的测试考察目标——代谢产物对药物、内标标物质的干扰情况——进一步验证方法的可可行性第四章分分析方法的建建立与验证第二节分分析方法的建建立步骤12/6/202222体内药物分析析第三节分析方法验验证的的内容与要求求用于实际生物物样品分析之之前——验证(validation)分析方法的可行性与可靠性方法验证时应应考虑影响分分析方法——所有可变变因素(采样样,样品制备备,色谱分离离,检测与数数据评价等)使用的技术指标——效能指标使用的样品——通常采用用模拟生物样品品和用药后的实际生物样品品第四章分分析方法的建建立与验证12/6/202223体内药物分析析验证步骤首先为分析方法的验证——特异性、精密密度与准确度度、回收率定量限与检测测限、溶液稳稳定性其次为生物基质中待测药物稳定性的验证——室温放置、冷冷冻（或冷藏藏）、冻-融融循环第四章分分析方法的建建立与验证第三节分分析方法的验验证与要求12/6/202224体内内药药物物分分析析验证证的的效效能能指指标标与与基基本本要要求求1．．特特异异性性————避避免免干干扰扰2．．标标准准曲曲线线与与线线性性范范围围————覆盖盖所所有有浓浓度度范范围围3．．准准确确度度————与与实实际际状状况况相相符符4．．精精密密度度————结结果果可可重重现现5．．定定量量限限————达达到到峰峰浓浓度度的的1/10～～1/206．．稳稳定定性性————确确保保所所有有样样品品准准确确测测定定7．．提提取取回回收收率率————确确保保准准确确度度第四四章章分分析析方方法法的的建建立立与与验验证证第三三节节分分析析方方法法的的验验证证与与要要求求12/6/202225体内内药药物物分分析析一、、方方法法特特异异性性(专专属属性性或或选选择择性性)方法的的特异异性(specificity)——又又称专专属性性或专专一性性，通通常与与选择择性(selectivity)互用——系指当当有内内源性性物质质存在在时，，方法法准确确测定定待测测物质质的能能力专属性性———表示示所检检测的的信号(响应应)系系属于于待测药药物所所特有有的选择性性———系指指将待待测物物质与与其代代谢物物及同同服的的其它它药物物加以以区分(分离离)的的能力力特异性性——函函盖二二者，，以验证所测定定的物物质与与待测测药物物的同一性性考察一一个分分析方方法是是否具具有特特异性性，应应着重重考虑虑以下下几点点：第四章章分分析析方法法的建建立与与验证证第三节节分分析析方法法的验验证与与要求求12/6/202226体内药药物分分析1.内内源源性物物质的的干扰扰比较———待测药药物或或其活活性代代谢产产物检测信信号对照品品（或或标准准品））空白生生物基基质模拟生生物样样品（（空白白生物物基质质中添添加对对照品品）——如如HPLC色谱谱峰的的tR、n和T是否一一致及与内内源性性物质质色谱谱峰的的R确证———内源性性物质质对分分析方方法有有无干扰第四章章分分析析方法法的建建立与与验证证第三节节分分析析方法法的验验证与与要求求12/6/202227体内药药物分分析2.代代谢谢产物物的干干扰比较——模模拟生生物样样品和和用药药后的的实际际生物物样品品的检测信信号与代谢产产物(在在实际样样品中tR随时间延长长而增加加)的R如HPLC色谱谱峰的tR、n和T〔或改变变色谱条条件(色色谱柱)再比较较〕确证——其它它代谢产产物对分分析方法法有无干扰结构已知知的特定定活性代代谢物的的测定——必要要时通过过HPLC-DAD和和LC-MS确确证色谱谱峰的单单纯性和和同一性性对于结构构未知的的代谢产产物的测测定——可采采用LC-LC-NMR进行行结构的的初步推推测后，，考察其其干扰情情况第四章分分析析方法的的建立与与验证第三节分分析析方法的的验证与与要求12/6/202228体内药物物分析3.伍伍用药物物的干扰扰TDM时——还要要考虑患患者可能能同时服服用药物物(通常常为数有有限)的的干扰比较——待测测药物及及可能同同时服用用药物的的模拟生生物样品品的检测信号号——如HPLC色谱峰峰的tR、n和T是否一致致确证——同时时服用药药物对分分析方法法的干扰情况况第四章分分析析方法的的建立与与验证第三节分分析析方法的的验证与与要求12/6/202229体内药物物分析4.与与参比方方法的相相关性除上述方方法外，，有时还还可使用用参比方法法对照参比方法法一般选用用特异性性强、准准确度高高、线性性关系良良好的色色谱法——如在在TDM中使用用UV(或RIA)时时,可可以HPLC(或GC)为参参比参比方法法测定结结果为横横坐标(X);拟定方方法结果为纵纵坐标(Y)用最小二乘法法计算回归方方程Y＝a＋bX(坐标标度相相等)相关系数(r)——表示两种方法法测得结果的的一致性——若r≠1，表示拟定方法法为非线性，如RIA中抗血清清滴度选择不不当第四章分分析方法的建建立与验证第三节分分析方法的验验证与要求12/6/202230体内药物分析析4.与参比比方法的相关关性Y＝a＋bX截距(a)——表示拟定定方法受到恒定干扰的程度——内内源性物质(UV)斜率(b)——表示拟定定方法受到比例干扰的程度——标标记抗原不纯纯(RIA)与参比方法的的相关性比较较——除显示分分析方法的特特异性外——斜率b表示两两种方法测得得结果的一致致性若参比方法准准确度良好——若截距a≈0,则拟定定方法的准确度(回收收率)为100b(%)第四章分分析方法的建建立与验证第三节分分析方法的验验证与要求12/6/202231体内药物分析析二、标准曲线线与线性范围围标准曲线（standardcurve））——calibrationcurveorworkingcurve——生物样品品中所测定药药物浓度与响响应的相关性（比例的程度度）——通常用回回归分析方法法所得的回归方程来评价——除少数方方法（免疫分分析法）外，，标准曲线通通常为线性模式——回归分析析法为最小二乘法（leastsquares）或加权最小二乘乘法（weightedleastsquares）线性范围（linearrang）——标标准曲线的最高与最低浓度的区间——模拟生物物样品的测定定结果应达到到试验要求的的精密度和准准确度第四章分分析方法的建建立与验证第三节分分析方法的验验证与要求12/6/202232体内药物分分析二、标准曲曲线与线性性范围(续续)标准曲线———用模拟生物样样品建立——线性范范围(不包包括零点)应能覆盖全部生生物样品中的药物浓浓度——不能使使用外推的方法法求算未知生生物样品中中的药物浓浓度建立标准曲曲线所使用用的模拟生生物样品——应使用用与待测的的含药生物物样品相同的生物物基质制备第四章分分析方法法的建立与与验证第三节分分析方法法的验证与与要求12/6/202233体内药物分分析标准曲线的的一般建立立方法1.标准系列溶溶液(非生物基基质溶液)的制备溶剂——水或甲醇（或其他适适当溶剂））浓度——标标准模拟生生物样品中中药物浓度度的50倍以上上加入量为生生物样品总总体积的2%以下避免免标标准准模模拟拟生生物物样样品品与与实实际际样样品品存存在在较较大大差差异异浓度度较较低低———应应除去去溶溶剂剂后再再加加入入生生物物基基质质否则则,在在实实际际样样品品测测定定时时应应加入入等等体体积积的的溶溶剂剂并涡涡旋旋混混匀匀第四四章章分分析析方方法法的的建建立立与与验验证证第三三节节分分析析方方法法的的验验证证与与要要求求12/6/202234体内药物分析析2.标准系列溶液液的浓度范围围至少含5～8个浓度点(不包括零点点,即空白)——可覆盖全部待测测生物样品中中的药物浓度度如：1、2、、5、10、、20、50、100(等比梯度模模式—比例常常数约为2)若体内平均达达峰浓度为50，其1/20为2.5设定最高浓度度为100，，最低浓度为为1(个体体差异)实际制备时：：500、250、100、50、、20、10……第四章分分析方法的建建立与验证第三节分分析方法的验验证与要求12/6/202235体内药物分析析3.标准系列模拟拟生物样品的的制备空白生物基质质(如血浆)——加入标标准系列溶液液适量，涡旋旋混匀为防止在标准准溶液加入及及涡旋混合时时造成的损失失——①先加入入标准溶液③③②再加入空白白生物基质③涡旋混匀①①②②第四章章分分析析方法法的建建立与与验证证第三节节分分析析方法法的验验证与与要求求12/6/202236体内药药物分分析4.标准曲曲线的的绘制制以待测测药物物的检检测响响应(如色色谱峰峰面积积或峰峰高)或或与内内标物物质的的检测测响应应的比比值(内标标法)(因因变量量,y)对模模拟血血药浓浓度(自自变量量,x)——求求得回回归方方程(y＝a＋＋bx)及其其相关关系数数()在一组组由至至少7个浓浓度(不包包括零零点)构成成的标标准曲曲线中中，至多可可有2个浓浓度点点数据据，可可予剔剔除。。但应有有确切切原因因，如如：——样样品处处理有有损失失、色色谱图图有问问题，，或——显显著偏偏离标标准曲曲线〔〔该数数据参参与标标准曲曲线回回归后后，计计算QC样品或或返算算该点点浓度度时显显著偏偏离其其标称称浓度度(配配制浓浓度)〕——其余应有至至少5个浓浓度点点在标标准曲曲线上上第四章分分析方法法的建立与与验证第三节分分析方法法的验证与与要求12/6/202237体内药物分分析5.加权最小二二乘法最小二乘法法——每个浓浓度点绝对误差(yi－yi’)赋予同同等的重要要性标准曲线上上的高低浓浓度相差悬悬殊(范围围达102)——低浓度度区的计算算值相对误误差过大，，难以满足足规定要求求加权最小二二乘法——回归计计算时增加加一个权重因子(w)——各浓度度的响应值值与回归值值的相对离离差平方和和达到最小小式中，wi为标准曲线线上第i个个浓度点的的权重因子子第四章分分析方法法的建立与与验证第三节分分析方法法的验证与与要求12/6/202238体内药物物分析1）回归归方程(y=a+bx)参数的的计算第四章分分析析方法的的建立与与验证第三节分分析析方法的的验证与与要求12/6/202239体内药物物分析2）权重重因子的的选择加权——赋予予低浓度度点以更更大的权权重在实际工工作中的的一般方方法——当wi=1/(yi’)2时，则——而yi与xi成正比——所以以，令wi=1/(bxi)2=k/xi2(通常取wi=1/C2)当高浓度点测量值的准确确度下降过大——低浓度点点权重过大，，降低低浓度点的权重，wi=k/xi第四章分分析方法的建建立与验证第三节分分析方法的验验证与要求12/6/202240体内药药物分分析标准曲曲线的的限度要要求药代动动力学学或生生物利利用度度研究究——标准曲曲线至至少包包括5个浓浓度(通常常为5～8个浓浓度,不包包括零零点)——最最高浓浓度应应高于于达峰峰浓度度(Cmax)；最最低浓浓度应应低于于Cmax的10%～～5%，并并应为为方法法的LOQ(非LOD)——回归方方程的的截距距应接接近于于零——相关系系数要要求≥0.99(色色谱法法)或或≥0.98(生物物学方方法)——若非线线性，，可分分为高高低两个浓浓度区区间(每个个区间间不少少于5个浓浓度)，分分别加加权回回归———如如1、、2、、5、、10、20和和10、20、、50、100、200第四章章分分析析方法法的建建立与与验证证第三节节分分析析方法法的验验证与与要求求12/6/202241体内药药物分分析三、准准确度度方法准准确度度(accuracy)——系系指用用该方方法测得的的生物物样品品中待待测药药物的的浓度度与其其真实实浓度度的接接近程程度——应应使用用实际际生物物样品品测定定，但但实际际生物物样品品的浓浓度是是未知知的所所以，，通常常使用用模拟拟生物物样品品测定定——一一般用用相对回回收率率(relativerecovery，，RR)或或相对误误差(relativeerror，RE)表示示第四章章分分析析方法法的建建立与与验证证第三节节分分析析方法法的验验证与与要求求12/6/202242体内内药药物物分分析析1.测定定法法取空空白白生生物物基基质质（（如如血血浆浆））数数份份，，照照标标准准曲曲线线项项下下方方法法操操作作，，用用标标准准曲曲线线计计算算在标准曲曲线范围围内制备备质控(qualitycontrol，QC)样品——高(接近上上限)、、中、低低(接近近LOQ)3个个浓度——每一一浓度至至少5个个样本——与随随行的标标准曲线线同法测测定、计计算，每每个样品品分析测测定1次次第四章分分析析方法的的建立与与验证第三节分分析析方法的的验证与与要求12/6/202243体内药物物分析2.结果计算算与限度度要求计算——测定定值M(measured)平均值值与理论论浓度(加入值值)A(added)比值相对回收收率相对误差差限度要求求——相对对回收率率应在85%～～115%(LOQ附近80%～120%)——RE在±15%(LOQ附近为±±20%)第四章分分析析方法的的建立与与验证第三节分分析析方法的的验证与与要求12/6/202244体内药物物分析四、精密密度方法精密密度(precision)——系指指每次测测定结果果与多次次测定的的平均值值的偏离程度度——表示示该分析析方法的的可重复性性(reproducibility)——反映映分析方方法的可操作性，是方方法验证证的基本本要点之之一实际生物物样品的的量有限限(如血血浆，一一般为0.5～～2ml)——使用用模拟生生物样品品测定第四章分分析析方法的的建立与与验证第三节分分析析方法的的验证与与要求12/6/202245体内药物物分析1.表表示方法法方法精密密度一般般用标准准偏差(standarddeviation，SD)或相对标准准偏差(relativestandarddeviation，RSD)表示SD=RSD==——包括括批内(within-run或intra-assay)RSD——日内(within-day)和批间(between-run或或inter-assay)RSD——日间(between-day，day-to-day)第四章分分析析方法的的建立与与验证第三节分分析析方法的的验证与与要求12/6/202246体内药物物分析2.测测定法———分别测定定法(ⅠⅠ)照准确度度项下方方法，取取空白生生物基质质(如血血浆)数数份，分分别在同同一批内内和不同同批间制制备高、、中、低低3个个浓度的的QC样品，，并分分析测测定批内RSD——每每一浓浓度5～6个样样品，，每个个样品品测定定1次次，用用随行行标准准曲线线分别别计算算3个个浓度度及每每1浓浓度的的RSD批间RSD——每每1分分析批批内每每一浓浓度制制备1个样样品，，每个个样品品测定定1次次；用用随行行标准准曲线线计算算3个个浓度度(每每一浓浓度5～6个分分析批批数据据)的的RSD第四章章分分析析方法法的建建立与与验证证第三节节分分析析方法法的验验证与与要求求12/6/202247体内药药物分分析2.测测定定法———连续测测定法法(ⅡⅡ)若实际际样品品测定定所用用的分分析批批次少少于5批，，也可可进行行3个个批次次的连连续分分析(每1浓度度的每每1批批次为为5～～6个个样本本)———方差分分析法法批间RSD=批内RSD==第四章章分分析析方法法的建建立与与验证证第三节节分分析析方法法的验验证与与要求求12/6/202248体内药物分分析3.限度要求在药代动力力学和生物物利用度研研究中对g/ml级级水平的RSD一般应≤10%ng/ml级水平的的RSD一般应≤15%在LOQ附近RSD应≤20%。第四章分分析方法法的建立与与验证第三节分分析方法法的验证与与要求12/6/202249体内药物分分析五、定量限限方法定量限限(limitofquantitation，LOQ)——系指在在保证具有有一定可靠靠性(准确确度与精密密度符合要要求)的前前提下，能能测定出生生物样品中中药物的最最低浓度——又称为为方法灵敏敏度(sensitivity)——标准曲曲线上的最最低浓度点点(最低浓浓度点≥LOQ)要求——应能满满足测定3～5个消消除半衰期期后生物样样品中的药药物浓度——准确度度在80%～120%(或RE在±20%的范围内内)——RSD＜20%第四章分分析方法法的建立与与验证第三节分分析方法法的验证与与要求12/6/202250体内药物分分析六、稳定性性与质量控控制稳定性———包括方法法稳定性和和样品稳定定性方法稳定性性——方法的的耐用性样品稳定性性——生物样样品的存放放条件和时时间、冻-融循环测定法——QC样品穿插于于实际样品品测定全过过程——模拟(或实际)生物样品品及其预处处理后的待待测溶液进进行考察要求——准确度度85%～～115%(RE在±15%范围内)，RSD＜15%第四章分分析方法法的建立与与验证第三节分分析方法法的验证与与要求12/6/202251体内药物分分析七、萃取回回收率生物样品的的预处理方方法——重点考考虑方法准确度度(或相对回收率率)，操作简简便、快速速——萃取回回收率(绝绝对回收率率，absoluterecovery)，，≥70%萃取回收率率与相对回回收率的意意义不同萃取回收率率——考察察生物样品品预处理过过程造成的的药物的程程度损失相对回收率率——采用用标准曲线线可准确计计算生物样样品中药物物浓度第四章分分析方法法的建立与与验证第三节分分析方法法的验证与与要求12/6/202252体内药物分析析1.测定法取空白生物基基质(如血浆浆)，照准确确度项下方法法，制备高、、中、低3个个浓度的QC样品(每一浓浓度至少5个个样品)，每每个样品分析析测定1次另取等量的相相同3个浓度度的标准溶液液，用溶解模模拟生物样品品经提取处理理后的残渣的的溶剂稀释至至同体积，同同法测定AT——经萃取后后的QC样品的检测信信号或比值(内标法)AS——未经萃取取的标准溶液液的检测信号号或比值(内内标法)第四章分分析方法的建建立与验证第三节分分析方法的验验证与要求12/6/202253体内药物分析析2.限度要求萃取回收率一一般应≥50%高、中浓度的的RSD应≤15%低浓度的RSD应≤20%。。第四章分分析方法的建建立与验证第三节分分析方法的验验证与要求12/6/202254体内药物分析析第四节体内药物分析析方法应应用用示例第三代喹诺酮酮类广谱抗菌菌药盐酸环丙沙星星片人体生物物等效性研究一、文献调研研性质——在水中溶解，，在甲醇中微微溶，在乙醇醇中极微溶解解，在氯仿中中几乎不溶，，在氢氧化钠钠试液中易溶溶；环丙沙星星游离体在水水中不溶，在在乙醇、二氯氯甲烷中极微微溶解，在稀稀醋酸中溶解解。第四章分分析方法的建建立与验证12/6/202255体内药物分析析药动学参数吸收过程——空腹口服服后吸收迅速速、人体生物物利用度约为为49%～70%Cmax——口服500mg后平平均Cmax为2.4～2.6mg/LTmax——1～2hT1/2——血中T1/2约为4h，肾肾功能减退时时稍有延长至至6h蛋白结合率——20%～～40%代谢——口服给药药24h内，，40%～50%原形、、15%代谢谢物经肾排出出第四章分分析方法的建建立与验证第三节分分析方法的验验证与要求12/6/202256体内内药药物物分分析析体内内分分析析方方法法RP-HPLC色谱谱柱柱————ODS色色谱谱柱柱流动动相相————甲甲醇醇(乙乙腈腈)-磷磷酸酸(枸枸橼橼酸酸)缓缓冲冲液液(三三乙乙胺胺调调节节pH2.3～～3.5)，，或或离子子对对色色谱谱:溴溴化化十十六六烷烷基基三三甲甲基基铵铵(氢氢氧氧化化四四丁丁基基铵铵)检测测————紫紫外外或或荧荧光光检检测测生物物样样品品预预处处理理蛋白白沉沉淀淀法法————甲甲醇醇、、乙乙腈腈或或高高氯氯酸酸沉沉淀淀蛋蛋白白后后直直接接进进样样溶剂剂萃萃取取法法————二二氯氯甲甲烷烷-异异丙丙醇醇、、氯氯仿仿-异异丙丙醇醇混混合合溶溶剂剂蛋白白沉沉淀淀-溶溶剂剂萃萃取取————乙乙腈腈沉沉淀淀蛋蛋白白后后二二氯氯甲甲烷烷-异异丙丙醇醇提提取取第四四章章分分析析方方法法的的建建立立与与验验证证第三三节节分分析析方方法法的的验验证证与与要要求求12/6/202257体内药物物分析二、分析析方法设设计1．分析析方法血浆蛋白白结合率率低(20%～～40%)、以以原形从从肾排泄泄生物等效效性研究究——测测定血浆浆中环丙丙沙星原原形药物物的浓度度-时间间曲线。。初步拟定定：采用RP-HPLC法2．检测测方法紫外———灵敏度度＜1ng，若若取血浆浆0.5ml，，采用3倍量乙乙腈沉淀淀蛋白，，取上清清液100l进样，，则要求求血浆中中环丙沙沙星浓度度在50ng/ml以以上，当当Cmax在2g/ml以上(口服500mg)时时基本可满满足生物等效效性研究究要求荧光———灵敏度度＜0.1ng，能满足本试验要要求第四章分分析析方法的的建立与与验证第三节分分析析方法的的验证与与要求12/6/202258体内药药物分分析二、分分析方方法设设计（（续））3．样样品制制备方方法初步拟拟定———采采用简简便、、快速速的乙乙腈沉沉淀蛋蛋白后后取上上清液液直接接进样样分析析预试———含含75%乙乙腈的的提取取液100l进样样后，，色谱谱峰理理论板板数、、对称称性下下降(前沿沿峰)，进进而导导致检检测灵灵敏度度降低低(峰峰高降降低)经进一一步试试验，，确定为为：血浆0.5ml→乙乙腈1ml沉淀淀蛋白白→二二氯甲甲烷-异丙丙醇(95:5)5ml萃取取→60℃氮氮气流流吹干干→流流动相相200l溶解解→20l进样样灵敏度度可达达2ng/ml(血血浆浓浓度)，符符合要要求(Cmax＞2g/ml)第四章章分分析析方法法的建建立与与验证证第三节节分分析析方法法的验验证与与要求求12/6/202259体内药物分分析三、实验方方案1．给药方方案20名受试试者随机分分为两组，，每组10人第1次试验验——第一一组口服受受试制剂(相当于环环丙沙星500mg)，第二二组口服相相同剂量的的参比制剂剂第2次试验验——第1次服药后后第7天开开始，两组组交换给药药第四章分分析方法法的建立与与验证第三节分分析方法法的验证与与要求12/6/202260体内药物物分析三、实验验方案（（续）2．血样样的采集集与处理理分别口服服给药前前和给药药后0.25、、0.5、1.0、、1.5(tmax)、2.0、3.0、4.0、6.0、、8.0、12.0和和24.0(5~7个t1/2)小时由肘正中中静脉取取血4ml立即移入入经肝素素处理的的离心试试管中，，静置5分钟后后，离心心15分分钟(3000rpm)，分分离血浆浆-20℃℃冰箱中中保存待待测第四章分分析析方法的的建立与与验证第三节分分析析方法的的验证与与要求12/6/202261体内药物物分析三、实验验方案（（续）3．血样样分析法法色谱条件件——高效效液相色色谱仪(包括LC-10ATvp泵，RF-530荧光光检测器器)；色色谱柱为为KromasilODS-AP(200mm×4.6mm，5m)——流动动相为乙乙腈-0.025mol/L磷酸溶溶液(86:14)，，流速1.0ml/min——检测测波长为为ex=277nm，，em=445nm——柱温温为40℃。第四章分分析析方法的的建立与与验证第三节分分析析方法的的验证与与要求12/6/202262体内药物物分析三、实验验方案（（续）3．血样样分析法法血浆样品品的预处处理取血浆0.5ml，加加内标溶溶液(10g/ml诺氟沙沙星甲醇醇溶液））50l、乙腈腈1.0ml，，涡旋混混合30s，离离心5min，，取上清清液1ml，加加二氯甲甲烷-异异丙醇(95:5)混合合溶剂5ml，，涡旋振振荡1min，，离心5min，弃去去上层水水相，吸吸取下层层有机相相，60℃下氮氮气流吹吹干，残残渣加流流动相200l，涡旋旋溶解30s，，离心5min，取上上清液20l进样第四章分分析析方法的的建立与与验证第三节分分析方法的验验证与要求12/6/202263体内药物分析析四、分析方法法验证1．方法特异异性环丙沙星峰tR=12.4min，诺氟氟沙星(内标标物质)tR=10.9min，各峰峰均获得完全全分离，内源源性物质峰(与空白血浆浆样品一致)tR=8.6min对测定无无干扰志愿者用药后的血浆样样品色谱图中环丙丙沙星与内标标物质峰与模拟血浆样品品中环丙沙星与与内标物质峰峰的tR、T、n和R均一致，峰形相同。故不认为代代谢物有干扰扰第四章分分析方法的建建立与验证第三节分分析方法的验验证与要求12/6/202264体内药物分析析四、分析方法法验证(续)2．标准曲线线标准系列溶液液——取盐酸酸环丙沙星，，加水制成1、2、5、、10、20和50g/ml的标标准系列溶液液，冰箱保存存标准系列模拟拟血浆样品———取空白血血浆0.5ml，加环丙丙沙星标准系系列溶液各50l，配制成相相当于浓度为为0.1，0.2、0.5、1.0、2.0、、5.0g/ml的QC样品，冰冰冻(-20℃)测定法——取取QC样品，，照“血浆样样品的预处理理”项下方法法操作，以环环丙沙星浓度度C为横坐标，环环丙沙星与内内标物质的峰峰面积比值Y为纵坐标，用用加权最小二二乘法经Excel运算算，求得的直直线回归方程程为：Y=1.33··C-0.02583，，R2=0.9951(C=0.1～5.0g/ml)第四章章分分析析方法法的建建立与与验证证第三节节分分析析方法法的验验证与与要求求12/6/202265体内内药药物物分分析析四、、分分析析方方法法验验证证(续续)3．．方方法法精精密密度度与与准准确确度度QC样样品品————浓浓度度为为0.1、、0.5和和2.0g/ml分析析批批次次————3批批，，每每批批5样样品品测得得浓浓度度————0.0988、、0.4537和和2.128g/ml准确确度度RE(%)————-1.2%、、-9.3%和和6.4%精密度批内(%)———6.7%、、4.6%和和3.9%批间(%)———8.9%、、9.6%和和12.3%第四章分分析析方法的的建立与与验证第三节分分析析方法的的验证与与要求表4-2血浆中环丙沙星HPLC测定法的准确度与精密度考察结果分析批次加入量（ng/ml）100.0500.020001100.8457.12179.695.7451.02212.1105.4438.02084.9105.1447.12129.3104.3449.02190.1106.4469.42135.2296.9465.72168.198.5497.92192.695.7468.12207.1105.9487.82251.395.8456.82252.286.3456.82240.9397.6450.71911.6103.8446.91993.099.5436.62115.7105.3427.51990.582.4416.21847.193.7443.72203.6N181818（ng/ml）98.8453.72128.0SD6.819.7118.7RE（%）-1.2-9.36.4批内RSD（%）6.74.63.9批间RSD（%）8.99.612.3表4-2血浆中环丙沙星HPLC测定法的准确度与精密度考察结果分析批次加入量（ng/ml）100.0500.020001100.8457.12179.695.7451.02212.1105.4438.02084.9105.1447.12129.3104.3449.02190.1106.4469.42135.2296.9465.72168.198.5497.92192.695.7468.12207.1105.9487.82251.395.8456.82252.286.3456.82240.9397.6450.71911.6103.8446.91993.099.5436.62115.7105.3427.51990.582.4416.21847.193.7443.72203.6N181818（ng/ml）98.8453.72128.0SD6.819.7118.7RE（%）-1.2-9.36.4批内RSD（%）6.74.63.9批间RSD（%）8.99.612.312/6/202266体内药物物分析四、分析析方法验验证(续续)4．方法法定量限限受试制剂剂和参比比制剂的的Cmax分别为——3.2020.496和和3.3000.730g/ml方法的LOQ为0.1g/ml＜0.16g/ml(Cmax的1/20)——准确确度和精精密度均均符合要要求：RE为-1.2%日内RSD为6.7%日间RSD为8.9%第四章分分析析方法的的建立与与验证第三节分分析析方法的的验证与与要求表4-2血浆中环丙沙星HPLC测定法的准确度与精密度考察结果分析批次加入量（ng/ml）100.0500.020001100.8457.12179.695.7451.02212.1105.4438.02084.9105.1447.12129.3104.3449.02190.1106.4469.42135.2296.9465.72168.198.5497.92192.695.7468.12207.1105.9487.82251.395.8456.82252.286.3456.82240.9397.6450.71911.6103.8446.91993.099.5436.62115.7105.3427.51990.582.4416.21847.193.7443.72203.6N181818（ng/ml）98.8453.72128.0SD6.819.7118.7RE（%）-1.2-9.36.4批内RSD（%）6.74.63.9批间RSD（%）8.99.612.3表4-2血浆中环丙沙星HPLC测定法的准确度与精密度考察结果分析批次加入量（ng/ml）100.0500.020001100.8457.12179.695.7451.02212.1105.4438.02084.9105.1447.12129.3104.3449.02190.1106.4469.42135.2296.9465.72168.198.5497.92192.695.7468.12207.1105.9487.82251.395.8456.82252.286.3456.82240.9397.6450.71911.6103.8446.91993.099.5436.62115.7105.3427.51990.582.4416.21847.193.7443.72203.6N181818（ng/ml）98.8453.72128.0SD6.819.7118.7RE（%）-1.2-9.36.4批内RSD（%）6.74.63.9批间RSD（%）8.99.612.312/6/202267体内药物物分析四、分析析方法验验证(续续)第四章分分析析方法的的建立与与验证第三节分分析析方法的的验证与与要求表4-2血浆中环丙沙星HPLC测定法的准确度与精密度考察结果分析批次加入量（ng/ml）100.0500.020001100.8457.12179.695.7451.02212.1105.4438.02084.9105.1447.12129.3104.3449.02190.1106.4469.42135.2296.9465.72168.198.5497.92192.695.7468.12207.1105.9487.82251.395.8456.82252.286.3456.82240.9397.6450.71911.6103.8446.91993.099.5436.62115.7105.3427.51990.582.4416.21847.193.7443.72203.6N181818（ng/ml）98.8453.72128.0SD6.819.7118.7RE（%）-1.2-9.36.4批内RSD（%）6.74.63.9批间RSD（%）8.99.612.3表4-2血浆中环丙沙星HPLC测定法的准确度与精密度考察结果分析批次加入量（ng/ml）100.0500.020001100.8457.12179.695.7451.02212.1105.4438.02084.9105.1447.12129.3104.3449.02190.1106.4469.42135.2296.9465.72168.198.5497.92192.695.7468.12207.1105.