江南大学氨基酸的代谢控制与发酵 - 副本课件

第六章

氨基酸代谢与调控

生命科学学院

胡庆森6.1天冬氨酸族氨基酸的合成途径6.2天冬氨酸族氨基酸的调控机制6.3微生物发酵法生产赖氨酸的育种技术6.4微生物发酵法生产苏氨酸的育种技术6.1.1天冬氨酸族氨基酸主要种类

6.1天冬氨酸族氨基酸的合成途径2022/12/56.1.2天冬氨酸族氨基酸的生物合成途径葡萄糖EMP磷酸烯醇式丙酮酸草酰乙酸天冬氨酸CO2转氨酶

CO2乙酰CoATCA丙酮酸α-酮戊二酸

谷氨酸2022/12/56.2.1天冬氨酸族氨基酸生物合成的代谢调控机制

大肠杆菌与谷氨酸棒状杆菌和黄色短杆菌代谢调节机制不同，本课程以谷氨酸棒状杆菌和黄色短杆菌为例讲解。2022/12/5天冬氨酸天冬氨酰磷酸二氢吡啶-2,6-二羧酸L-赖氨酸L-高丝氨酸L-苏氨酸L-异亮氨酸O-琥珀酰-高丝氨酸L-蛋氨酸天冬氨酸半醛①关键酶②优先合成③代谢互锁④平衡合成⑤Asp与Glu之间调节机制Leu✄代谢调控机制2022/12/5葡萄糖PEP丙酮酸乙酰CoA草酰乙酸天冬氨酰磷酸Asp乙酰CoACO2Ala,Val,LeuTCA循环CO2ATP脂肪酸ThrLysLeu激活反馈抑制阻遏α-酮戊二酸谷氨酸2022/12/5天冬氨酸天冬氨酰磷酸二氢吡啶-2,6-二羧酸L-赖氨酸L-高丝氨酸L-苏氨酸L-异亮氨酸O-琥珀酰-高丝氨酸L-蛋氨酸天冬氨酸半醛✟✟✟6.2.2赖氨酸高产菌株选育模式简图2022/12/5Corynebacteriumglutamicum2022/12/51、切断或削弱支路代谢

选育营养缺陷型：①Hom-

：培养基中限量添加高丝氨酸（或Met+Thr)可解除苏氨酸、赖氨酸对天冬氨酸激酶的协同反馈抑制使赖氨酸得以积累。②Thr-（或Met-）：培养基中限量添加Thr（或Met）第一种方法最直接，最常用2022/12/5天冬氨酸天冬氨酰磷酸天冬氨酸半醛高丝氨酸苏氨酸蛋氨酸二氨基庚二酸赖氨酸○○○α-酮丁酸异亮氨酸Hom-协同反馈抑制2022/12/52、解除反馈调节解除代谢产物对关键酶的关键抑制和阻遏。从葡萄糖到合成Lys过程中，有三个关键的酶起限速反应，要设法解除这些关键酶对Lys的消极影响。2022/12/5天冬氨酸天冬氨酰磷酸天冬氨酸半醛高丝氨酸苏氨酸蛋氨酸二轻吡啶二羧酸赖氨酸○○○α-酮丁酸异亮氨酸Hom-协同反馈抑制AKACPS磷酸烯醇式丙酮酸葡萄糖亮氨酸代谢互锁反馈抑制AC:磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶；AK:天冬氨酸激酶；PS:二轻吡啶二羧酸合成酶2022/12/5⑴天冬氨酸激酶反馈调节的解除选育Thr或Lys的结构类似物抗性突变株

Lys的结构类似物：

S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸(AEC)Thr的结构类似物：α-氨基-β-羟基戊酸(AHV)2022/12/5⑵磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的激活葡萄糖PEP丙酮酸乙酰CoA草酰乙酸天冬氨酰磷酸Asp乙酰CoACO2Ala,Val,LeuTCA循环CO2ATP脂肪酸ThrLys✄α-酮戊二酸谷氨酸✄PDHPC2022/12/5④适量VH激活磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶此处生物素有两个功能(利用优先合成和激活)⑤琥珀酸生长旺盛的突变株⑥谷氨酸敏感型菌株⑦基因工程菌构建柠檬酸合成酶活力低或丙酮酸激酶缺陷的菌株①-⑦都是为了增加PC的活力或切断代谢之路，以积累生成Lys的前体物质，为提高赖氨酸产量做准备。2022/12/53、解除代谢互锁葡萄糖PEP丙酮酸乙酰CoA草酰乙酸天冬氨酰磷酸Asp乙酰CoACO2Ala,Val,LeuTCA循环CO2ATP脂肪酸ThrLysLeu激活反馈抑制阻遏α-酮戊二酸DDP合成酶2022/12/5⑶选育Leu温度敏感突变株⑷选育对苯醌或喹啉衍生物敏感的菌株

实际上是筛选Leu渗漏突变株6’-(S)-羧基-3’-硫-7-氮-2,3-环庚酸萘-4,4-苯醌（PX）PX是生物合成Leu酶系抑制剂AJ11091（AECr+CCLr+Ala-+PXs）47g/LAJ11097（AECr+Ala-+PXs）42g/LCCL:α-氯已内酰胺⑸筛选萘乙酸(生长素)缺陷突变株Cl

CCL2022/12/54、改变细胞膜的通透性乳糖发酵短杆菌（AECr）发酵产生的Lys是通过主动运输系统排出细胞内的产物。当外界环境出现高浓度Lys时（5倍），乳糖发酵短杆菌还能排出产物，比酵母菌和大肠杆菌具有发酵Lys的优势。2022/12/5天冬氨酸天冬氨酰磷酸天冬氨酸半醛高丝氨酸苏氨酸异亮氨酸蛋氨酸赖氨酸激酶协同反馈抑制二氨基庚二酸（DAP）α-酮丁酸丙氨酸协同反馈抑制丙酮酸葡萄糖L-氨基酸α-酮酸丙酮酸✄Ala-✄Ala-EMP2022/12/5葡萄糖PEP丙酮酸乙酰CoA草酰乙酸天冬氨酰磷酸AspCO2Ala,Val,LeuTCA循环CO2ATP脂肪酸ThrLysα-酮戊二酸①②✟✟✟柠檬酸2022/12/5使两条路径的代谢流达到平衡，以实现Lys的高产的措施：①氟丙酮酸敏感突变株：丙酮酸激酶活力低②异柠檬酸合成酶活力较低的突变株③添加过量生物素和增加谷氨酸的反馈调节通过PEP羧化反应：1molglucose-------------1molLys通过TCA途径：2molglucose-------------1molLys2022/12/57、选育脲酶回复突变株谷氨酸棒状杆菌A11（Hom-+AECr+Urase-）Au111-2（Hom-+AECr+Urase+）Lys产量增加25%，糖转化率提高15%N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍诱变

2022/12/58利用基因工程技术构建赖氨酸工程菌株①谷氨酸棒状杆菌的二氢吡啶二羧酸合成酶（DDP合成酶）在大肠杆菌中表达(12.2g/LLys)。②法国巴黎大学Richamd等人将参与生成Lys的基因分别在高拷贝数的质粒pBR322上克隆，利用重组质粒转化大肠杆菌TOCR21,另外通过突变处理，改变了天冬氨酸激酶，该功能工程菌产量提高5倍。2022/12/5天冬氨酸天冬氨酸磷酸天冬氨酸半醛高丝氨酸苏氨酸异亮氨酸蛋氨酸赖氨酸二氨基庚二酸（DAP）α-酮丁酸2022/12/56.3.2选育苏氨酸生产菌的方法1、切断支路代谢选育营养缺陷型突变株（或营养渗漏缺陷型，营养缺陷型回复突变株）是积累苏氨酸的有效措施。2022/12/5◎DAP-+Met-E.coli(4g/L)◎Met-E.coliAS1.358K1-73(3.5g/L)◎AHVrE.coliLR-1458(1g/L)◎AHVr+Met-E.coliLRA-96(3.5g/L)◎DAP-+Met-+Ile-E.coliKY8280(13.8g/L)2022/12/5Leu阻遏PSPS:(二氢吡啶二羧酸合成酶)乳酸发酵短杆菌AECr+AHVrBrevibacteriumlactofermentumLys+Thr13g/L培养基中添加Leu（大于1g/L）Thr进一步增加M-15（Metsr）Thr:Lys=17.4g/L：8.6g/L2022/12/52、解除反馈调节协同反馈抑制协同反馈抑制AKHD反馈抑制解决协同反馈抑制和反馈抑制这两个主要问题，才能大量积累苏氨酸2022/12/5黄色短杆菌Brevibacteriumflavum◎AHVr:14g/L工业上最早应用结构类似物抗性突变株的实例

◎

AHVr+Met-+Lys-:注意培养基中要添加适量Met和LysAHVr+Met-:注意培养基中添加过量Met（10g/L）,合成18g/LThr.优先机制运用2022/12/5谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)

CorynebacteriumglutamicumKY10440Met-+AHVr+AECr10%的葡萄糖培养基,产量14g/LThr2022/12/5Asp产生菌No.70BK29DK330HDrPS-50μg/mLNTG处理100μg/mLNTG处理12g/LAHV平板5g/LDAP12g/L(14g/L)AHV平板8.6g/LDB185DB12216.5g/L16.6g/L2022/12/53、增加前体物天冬氨酸的合成（1）选育天冬氨酸结构类似物抗性突变株PC:磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶天冬氨酸氧肟酸盐抗性突变株AspSulfonamides

2022/12/5(2)选育丙氨酸营养缺陷型突变株日本味之素（味の素）株式会社是世界上最大的氨基酸供应商之一，味之素不但生产赖氨酸，而且苏氨酸、色氨酸的生产量在世界上都是最大的。目前味之素已在全球22个国家设有生产基地，产品销售覆盖130多个国家。乳糖发酵短杆菌AJ11180AHVr+Ala-:11g/L原菌株仅仅为7.2g/L2022/12/5天冬氨酸天冬氨酰磷酸天冬氨酸半醛高丝氨酸苏氨酸异亮氨酸蛋氨酸赖氨酸激酶协同反馈抑制二氨基庚二酸（DAP）α-酮丁酸丙氨酸协同反馈抑制丙酮酸葡萄糖L-氨基酸α-酮酸丙酮酸✄Ala-✄Ala-EMP2022/12/5(3)强化从丙酮酸到苏氨酸的代谢流①选育氟丙酮酸FPs突变株丙酮酸激酶活力低，便于积累磷酸烯醇式丙酮酸②选育以琥珀酸为唯一碳源生长良好的菌株固定CO2能力强③利用基因工程削弱或消除丙酮酸激酶和柠檬酸合成酶的酶活④培养基中添加适量生物素（0.02-5g/L）激活磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶2022/12/5乙酰CoA柠檬酸草酰乙酸琥珀酸α-酮戊二酸异柠檬酸苹果酸乙醛酸

①①柠檬酸合成酶②磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶③丙酮酸羧化酶④丙酮酸激酶延胡索酸②磷酸烯醇式丙酮酸

丙酮酸

乙酰CoA葡萄糖

CO2③④⑥Asp2022/12/5(4)谷氨酸合成的优先转化选育谷氨酸结构类似物敏感突变株◎谷氨酸氧肟酸盐敏感突变株◎供给过量的生物素◎青霉素抗性突变株PC:磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶黄色短杆菌2022/12/5（5）利用平衡合成乙醇乙酸黄色短杆菌B.flavumBBM-21(AHVr+Met-)◎主要碳源葡萄糖：18g/L◎主要碳源醋酸：27g/L磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶2022/12/5（6）选育维生素P抗性突变株Vp对Vp有抗性的短杆菌和棒杆菌也能提高苏氨酸产量，可能与改变细胞膜透性有关。实例：菌株：B.flavumAJ11584培养基：15%葡萄糖；0.3%KH2PO4;1%(NH4)2SO4;微量Mg2+,Mn2+,Fe2+;大豆蛋白水解液；VB1(TPP);VH(激活);Leu（抑制）培养基32oC发酵，Thr得率20g/L.2022/12/54、切断苏氨酸的进一步代谢途径◎选育Ile-营养缺陷型突变株◎选育IleL缺陷型突变株◎选育Ile-营养缺陷型回复突变株✄E.coliATCC21151(DAP-+Ile-):10.2g/LProteusrettgeri埃氏变形杆菌(Ile-):16g/L2022/12/55、运用现代生物技术选育苏氨酸生产菌（1）利用转导和原生质体转化法选育苏氨酸生产菌野生菌D60（TDH-+TD-）D60+羟缬氨酸抗性hnrB2HNr59AKI,HDI阻遏解除AKI,HDI去阻遏AECr174AKIII解除反馈调节Thr-Thr-N-11E-60T693(25g/L)AKI,HDII阻遏解除Etr-1T1026(40g/L)四重标记六重标记2022/12/5（2）利用原生质体融合技术选育苏氨酸生产菌乳糖发酵杆菌AJ11786黄色短杆菌AJ11784AECr+AHVs+Leu-+Ile+AECs+AHVr+Leu++Ile-Thr+LysThr乳糖发酵杆菌AJ11787不产乳酸Lys-17.4g/L18g/LAECr+AHVr+Leu-+Ile-2022/12/5(3)利用基因工程技术构建苏氨酸工程菌A1A2BC天冬氨酸激酶I高丝氨酸脱氢酶I高丝氨酸激酶苏氨酸合成酶调节区天冬氨酸天冬氨酰磷酸天冬氨酸半醛高丝氨酸高丝氨酰磷酸苏氨酸thrA1A2BC0苏氨酸衰减子调控机制（翻译水平上调控）前导肽可以配对序列：A-A;B-B(衰减子);C-C前导肽含有Thr和Ile残基AKHD2022/12/5提高Thr最根本的方法就是将合成途径中起限制作用的限速酶HD和AK基因链接在多拷贝的载体质粒上并克隆表达，解除合成途径的瓶颈效应，提高苏氨酸产量。IF=9.667

2022/12/5OverallsystemsmetabolicengineeringstrategiesemployedforthedevelopmentofageneticallydefinedThr-overproducing

E.colistrain.CentralmetabolicpathwaysthatleadtobiosynthesisofThrtogetherwiththeregulatorycircuitsandcompetingpathwaysareshown.Theshadedboxesrepresentthetargetedmutationsintroducedintothegenome.ThegrayXsindicatethatthegenesareknockedoutortheinhibition/repressionisremoved.Thickredarrowsindicatetheincreasedfluxoractivitybydirectlyoverexpressingthecorrespondinggenes.Dashedlineindicatesrepressionregulation.Dottedlinesindicatefeedbackinhibition.2022/12/52022/12/5

◎FeedbackinhibitionsofaspartokinaseIandIIIwereremovedbyreplacingthe1034thbaseCwithT(Ser345-Phe)inthethrAgeneandthe1055thbaseCwithT(Thr342-Ile)inthelysCgene.◎TranscriptionalattenuationwasremovedbyreplacingthenativepromoterofthethrABCoperonwiththetacpromoter,whichallowsconstitutiveexpressioninlacI-mutantstrain.◎Next,thepathwaysthatcompetewithThrformationanddegradeThrwereremovedbydeletingthelysA(encodingdiaminopimelatedecarboxylase),metA(encodinghomo