氨基酸的代谢与控制2课件

第七章氨基酸的代谢与控制第二节赖氨酸的发酵1氨基酸的生产概况氨基酸的生产方法有提取法、化学合成法和微生物法。微生物法又分直接发酵法和酶法氨基酸发酵属于典型的代谢控制发酵，氨基酸生物合成受到严格的反馈调节，要积累氨基酸必须采取人为手段打破微生物原有调节。除了胱氨酸和半胱氨酸外，几乎所有氨基酸都能用微生物法生产。2采用微生物法生产氨基酸现状：野生型细菌生产：Glu，Ala突变株生产：Lys，Thr，Val，Arg，Trp，Phe，Tyr，His添加前体：Thr，Ile，Trp酶法：Asp，Ala，Cys应用基因工程、蛋白质工程和代谢工程，或者它们相结合的方法育成的菌株生产：羟脯氨酸3二生物合成途径及代谢调节5L-天冬氨酸天冬氨酰磷酸天冬氨酰半醛二氢吡啶-2，6-二羧酸L-赖氨酸L-高丝氨酸L-苏氨酸L-异亮氨酸O-琥珀酰-高丝氨酸L-蛋氨酸①②③④⑥⑤⑦⑧①天冬氨酸激酶②高丝氨酸脱氢酶③二氢吡啶-2，6-二羧酸还原酶④高丝氨酸激酶⑤琥珀酰高丝氨酸转琥珀酰酶⑥半胱氨酸脱硫化氢酶⑦苏氨酸脱氨酶⑧天冬氨酰半醛脱氢酶⑨二氢吡啶-2,6-二羧酸合成酶⑨天冬氨酸族氨基酸的生物合成途径二氨基庚二酸6三赖氨酸高产菌育种思路：PEPPCAspAKASALysPSHDHomThrTDIleMet野生型Lys高产菌PCAspAKASALysPSHDHomThrTDIleMetPEPPEP：磷酸烯醇式丙酮酸PC：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶AK：天冬氨酸激酶PS：二氢吡啶-2.6-二羧酸合酶HD：高丝氨酸脱氢酶TD：苏氨酸脱氨酶Hom：高丝氨酸ASA：天冬氨酸半醛优先合成反馈控制切断或减弱支路代谢加强的代谢流7育种思路：1.切断或减弱支路代谢2.解除反馈调节3.解除代谢互锁4.改善膜的通透性5.增加前体物的合成6.选育温度敏感型突变株7.选育脲酶回复突变株8.基因工程技术构建赖氨酸工程菌株8谷氨酸棒杆菌高丝氨酸缺陷型的赖氨酸发酵葡萄糖天冬氨酸天冬氨酰磷酸天冬氨酸半醛高丝氨酸蛋氨酸苏氨酸异亮氨酸二氨基庚二酸（DAP）赖氨酸协同反馈抑制Hom-丧失高丝氨酸脱氢酶50g/L黄色短杆菌Thr一或Met一34g/L10除了Hom缺陷外，也可选育Thr-，Ile-，Met-，但不如Hom-更直接有效。Hom-单缺陷菌株容易发生生产不稳定，易回复突变的缺点，可选育Hom-+Thr-或Hom-＋Met-双缺陷菌株，使稳定性提高选育高丝氨酸渗漏突变株（HomL），由优先合成Hom转变为Lys。12赖氨酸高产菌育种思路：PEPPCAspAKASALysPSHDHomThrTDIleMet野生型Lys高产菌PCAspAKASALysPSHDHomThrTDIleMetPEPPEP：磷酸烯醇式丙酮酸PC：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶AK：天冬氨酸激酶PS：二氢吡啶-2.6-二羧酸合酶HD：高丝氨酸脱氢酶TD：苏氨酸脱氢酶Hom：高丝氨酸ASA：天冬氨酸半醛优先合成反馈控制切断或减弱支路代谢加强的代谢流Leu142.1天冬氨酸激酶反馈调节的解除(AK脱敏)在黄色短杆菌，谷氨酸棒杆菌和乳糖发酵短杆菌中，AK只受Thr和Lys的反馈抑制，可选育二者的结构类似物抗性突变株。如：S-（2-氨基乙基）-L-半胱氨酸(AEC)抗性、γ-甲基赖氨酸（ML）抗性，邻甲基苏氨酸（OMT）抗性，α-氨基-β-羟基戊酸（AHV）抗性，α-氟己内酰胺（FCL)抗性突变株等选育组合型突变株：营养缺陷型与结构类似物抗性结合。15AEC162.2磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的脱敏与激活为了增加赖氨酸的前体天冬氨酸的量就必须切断生成丙酮酸的支路，同时解除Asp对PC的反馈抑制。17乳糖发酵短杆菌中赖氨酸及其前体物生物合成的调节葡萄糖PEPPyr乙酰CoAADPATPAla，Val，LeuCO2脂肪酸TCA循环OAAASPCO2乙酰CoAASALysThrPyrLeu①PEP羧化酶②丙酮酸羧化酶③丙酮酸激酶④丙酮酸脱氢酶复合体①②③④激活反馈抑制阻遏Pyr：丙酮酸OAA：草酰乙酸ASA：天冬氨酸半醛18生物素激活PC：生物素在赖氨酸生产中的作用：确保谷氨酸不排出细胞外，从而产生足够的反馈抑制，使代谢流转向Lys的合成；生物素激活PC的活性，促使PEP生成OAA，再生成Asp磷酸烯醇式丙酮酸草酰乙酸柠檬酸α-酮戊二酸谷氨酸天冬氨酸TCA循环反馈控制优先合成PCGD丙酮酸羧化酶谷氨酸脱氢酶20生物素对乳糖发酵短杆菌积累Lys的影响

200300400500生物素（ug/L)0333537394143赖氨酸盐酸盐（g/L)200～500ug/L213.解除代谢互锁赖氨酸生物合成分支途径的第一个酶：DDP合成酶受Leu的反馈阻遏，在此情况下，副产物Ala，Val生产量增加，这是因为DDP合成酶的合成受阻遏，使丙酮酸转向合成Ala，Val。23乳糖发酵短杆菌中赖氨酸及其前体物生物合成的调节葡萄糖PEPPyr乙酰CoAADPATPAla，Val，LeuCO2脂肪酸TCA循环OAAASPCO2乙酰CoAASALysThrPyrLeu①PEP羧化酶②丙酮酸羧化酶③丙酮酸激酶④丙酮酸脱氢酶复合体①②③④激活反馈抑制阻遏Pyr：丙酮酸OAA：草酰乙酸ASA：天冬氨酸半醛24选育亮氨酸温度敏感型突变株选育对苯醌或喹啉衍生物敏感突变株选育苯醌或喹啉衍生物敏感突变株是寻找亮氨酸渗漏突变株的方法。苯醌或喹啉衍生物可以抑制亮氨酸生物合成酶系264，改善膜的通透性乳糖发酵短杆菌AECr突变株的赖氨酸的排出是通过主动运输系统来进行的，而且培养基中赖氨酸的浓度相当于细胞内浓度的5倍时，赖氨酸仍能排出。这说明乳糖发酵短杆菌作为赖氨酸生产育种的出发菌株比酵母菌和大肠杆菌优越的多。275.增加前体物的合成

通过增加代谢途径中的前体物可使碳源尽可能多的流向赖氨酸。增加前体物的合成可采用以下方法：

选育丙氨酸缺陷型选育抗天冬氨酸结构类似物突变株选育适宜的CO2固定酶/TCA循环酶活性比突变株28选育丙氨酸缺陷型，切断丙酮酸合成丙氨酸的代谢流，丙酮酸就能充分的合成天冬氨酸，增加Lys的产量。如:乳糖发酵短杆菌的AEC抗性突变株诱变得到丙氨酸缺陷型，在限量补加Ala时，产赖氨酸盐酸盐39g/L，亲株仅为17g/L。30选育抗天冬氨酸结构类似物突变株黄色短杆菌中，天冬氨酸对磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶有反馈抑制作用，这种抑制作用因为α–酮戊二酸的存在而加强，为了解除天冬氨酸对磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶有反馈抑制，可选育抗天冬氨酸结构类似物突变株。如：谷氨酸棒杆菌的抗天冬氨酸氧肟酸盐突变株Lys产量33g/L,亲本为25g/L。31选育适宜的CO2固定酶/TCA循环酶活性比突变株

草酰乙酸是赖氨酸合成的前体物，其生成可由TCA循环和磷酸烯醇式丙酮酸或丙酮酸经CO2固定反应生成。草酰乙酸的合成方式不同，赖氨酸对糖的收率有很大差异。aTCA循环产生：葡萄糖丙酮酸草酰乙酸天冬氨酸赖氨酸b磷酸烯醇式丙酮酸羧化产生：葡萄糖磷酸烯醇式丙酮酸草酰乙酸天冬氨酸赖氨酸丙酮酸32乳糖发酵短杆菌中赖氨酸及其前体物生物合成的调节葡萄糖PEPPyr乙酰CoAADPATPAla，Val，LeuCO2脂肪酸TCA循环OAAASPCO2乙酰CoAASALysThrPyrLeu①PEP羧化酶②丙酮酸羧化酶③丙酮酸激酶④丙酮酸脱氢酶复合体①②③④激活反馈抑制阻遏Pyr：丙酮酸OAA：草酰乙酸ASA：天冬氨酸半醛33a:2C6H12O6+2NH3+1.5O2+7NAD+2ADP→C6H14O2N2+H2O+6CO2+2ATP+7NADH2b:

C6H12O6+2NH3+2ATP+2NADH2→C6H14O2N2+4H2O+2NAD+2ADP

a途径：2mol葡萄糖生成1molLys；b途径：1mol葡萄糖生成1molLys。a产能，b需能，如以b为主，a为辅，具有合适的b/a比，Lys产量就可大大增加。34措施：氟丙酮酸敏感突变株：柠檬酸合成酶活力低的菌株增加谷氨酸的反馈调节及添加过量的生物素356.选育温度敏感型突变株如突变位置在亮氨酸合成酶系编码的基因中，高温条件下就不能合成亮氨酸，即成为亮氨酸缺陷型。如乳糖发酵短杆菌温度敏感突变株AJ1103（AECr+CCLr+Ala－）和AJ1099（AECr+Ala－）发酵前期29～33℃培养，24～48h提高温度至34℃以上，此时抑制菌体繁殖，并解除leu对DDP合成酶的阻遏，产量为45g/L和39g/L。367.选育脲酶回复突变株据报道，以lys生产菌A11（Hom－+AECr+Urase－）为出发菌株，经MNNG诱变得到Au111-2（Hom－+AECr+Urase+），对糖的转化率比原菌株提高15％。378.基因工程技术构建赖氨酸工程菌株据报道，把谷氨酸棒杆菌JS231的dapA基因（L-2，3-二氢吡啶二羧酸合成酶基因）克隆到大肠杆菌上，工程菌