液相色谱质谱分析课件

液相色谱质谱分析一、液相色谱概述二、HPLC仪器构成三、高效液相色谱法的类型及分离机理四、色谱分离方法的选择五、质谱仪主要内容一、概述1）高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色谱配备了高压输液设备，流速最高可达10cm3·min-1.2）气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20％。对于占有机物总数近80％的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析。高效液相色谱的优点3）气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生相互作用力，仅起运载作用。而高效液相色谱法中流动相可选用不同极性的液体，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因此，流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便。

4）气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。高效液相色谱的优点2、液相色谱仪器

（highperformanceliquidchromatograph）液相色谱仪（1）液相色谱仪（2）液相色谱仪（4）LCQDecaXPMAX液相色谱质谱联用仪2、

HPLC仪器组成：高压输液装置→进样系统→分离系统→

检测系统

流动相过滤与脱气装置流动相过滤装置分为在线过滤和真空过滤流动相脱气装置分为在线真空脱气和超声波脱气泵体材料耐腐蚀泵腔的体积要小，以便快速更换溶剂能在高压下连续工作,耐压40-50MPa.cm2压力平稳，无脉冲高压输液泵输出流量稳定，重复性高,输出流量范围宽(2)高压输液泵

梯度淋洗装置

(内梯度)(外梯度)梯度淋洗装置等度洗脱与梯度洗脱梯度洗脱的特点改善分离,加快分析速度；改善峰形,减少拖尾;可能引起基线漂移分配比变化范围宽的复杂样品应采取梯度洗脱方式分离(2)

进样系统进样针六通阀

准备状态进样状态六通阀进样装置(3)分离系统柱体为直型不锈钢管，内径1～6mm，柱长5～40cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。色谱柱1．使用预柱保护分析柱(硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度)。2．大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2－7.5，尽量不超过该色谱柱的pH范围。3．避免流动相组成及极性的剧烈变化。4．流动相使用前必须经脱气和过滤处理。5．如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱子冲洗干净，并保存大乙腈中。6．压力升高是需要更换预柱的信号。色谱柱的使用和维护a.紫外检测器

应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：

灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小（1mm×10mm，容积8μL）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。b.光电二极管阵列检测器

紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。两种检测器的色谱图(a)：可变波长紫外检测器；(b)：二极管阵列检测器类型主要分离机理主要分析对象或应用领域吸附色谱吸附能，氢键异构体分离、族分离，制备分配色谱疏水分配作用各种有机化合物的分离、分析与制备凝胶色谱溶质分子大小高分子分离，分子量及其分布的测定离子交换色谱库仑力无机离子、有机离子分析离子排斥色谱Donnan膜平衡有机酸、氨基酸、醇、醛分析离子对色谱疏水分配作用离子性物质分析疏水作用色谱疏水分配作用蛋白质分离与纯化手性色谱立体效应手性异构体分离，药物纯化亲和色谱生化特异亲和力蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析三、高效液相色谱法的类型及分离机理2.分配色谱（液－液分配色谱）（1）原理

根据各待测物在互不相溶的两溶液中的溶解度不同，因而具不同的分配系数。在色谱柱中，随着流动相的移动，这种分配平衡需进行多次，造成各待测物的迁移速率不同，从而实现分离的过程。分离原理K不仅与固定相的种类有关，也与流动相的种类有关固定相极性>流动相极性正相分配色谱组分极性越大，保留时间越长反相分配色谱固定相极性<流动相极性组分极性越小，保留时间越长（2）分类四、色谱分离方法的选择五、质谱仪1.质谱分析法2.质谱仪的结构及工作原理3.质谱图及离子峰的主要类型

质谱分析法（MassSpectrometry,MS）是在高真空系统中测定样品的分子离子及碎片离子质量，以确定样品相对分子质量及分子结构的方法。化合物分子受到电子流冲击后，形成的带正电荷分子离子及碎片离子，按照其质量m和电荷z的比值m/z（质荷比）大小依次排列而被记录下来的图谱，称为质谱。1.质谱分析法根据质谱峰的质荷比测定化合物的分子量，推测分子式及结构式根据峰强度进行定量分析2.质谱仪的结构（1）进样系统作用：将样品分子引入到离子源中。蠕动泵连续进样六通阀直接进样色谱进样系统方式：(2)离子源作用：

1.将导入质谱仪系统的样品去溶剂化2.将离子源处的大气压与质谱仪系统一级真空阻隔开3.被分析物离子化或将溶剂中的离子转化成气相4.去除中性物质和带反极性电荷离子，否则会对分析产生干扰电喷雾电离源(ESI)多电荷离子测定的样品分子量大(3)质量分析器a单聚焦型磁分析器作用:是将不同碎片按质荷比m/z分开。质量分析器类型：磁分析器、飞行时间、四极杆、离子捕获、离子回旋等。b四级杆分析器(4)检测器电子倍增器示意图质谱仪常用的检测器有法拉第杯(FaradayCup)、电子倍增器及闪烁计数器、照相底片等。阴极放大105-108倍特点：实现高灵敏度、快速测定.(5)真空系统作用：

1)消减离子的不必要碰撞，避免离子损失；2)避免离子－分子反应改变裂解模式，使质谱复杂化；3)减小本底。离子源质量分析器真空度要求：}<10-4Pa机械泵扩散泵真空泵{3.质谱图及离子峰的主要类型（1）质谱图质谱图是以质荷比(m/z)为横坐标、相对强度为纵坐标构成，将原始质谱图上最强的离子峰定为基峰并定为相对强度100％，其他离子峰以对基峰的相对百分值表示。丙酮的质谱图（2）离子峰的主要类型分子在离子源中可产生各种电离，即同一分子可产生多种离子峰：分子离子峰、同位素离子峰、碎片离子峰、重排离子峰、亚稳离子峰等。设有机化合物由A，B，C和D组成，当蒸汽分子进入离子源，受到电子轰击可能发生下列过程而形成各种类型的离子：分子离子碎片离子重排裂解碰撞裂解（3）分子离子峰的特点

一般质谱图上质荷比最大的峰为分子离子峰；有例外。形成分子离子需要的能量最低，一般约１０电子伏特。

质谱图上质荷比最大的峰一定为分子离子峰吗？如何确定分子离子峰？4.质谱结构解析（1）分子量确定根据分子离子峰质荷比可确定分子量，通常分子离子峰位于质谱图最右边，由于分子离子的稳定性及重排等，质谱图上质荷比最大的峰并不一定是分子子峰。那么，如何辩认分子离子峰呢？a、利用化学结构来判断分子离子峰强度。——各类化合物分子离子峰稳定性顺序为：芳香环（芳香、杂环）>脂环>硫醚、硫酮>共轭烯烃>直链烷烃>酰胺>酮>醛>胺>脂>醚>羧酸>支链烃>腈>伯醇>叔醇>缩醛c、分子离子峰与邻近峰的质量差是否合理。

有机分子失去碎片大小是有规律的：如失去H、CH3、H2O、C2H5…，因而质谱图中可看到M-1，M-15，M-18，M-28等峰，而不可能出现M-3，M-14，M-24等峰，如出现这样的峰，则该峰一定不是分子离子峰。质量差为(4-13)、19-25、37、38、50-53、65-66…的不是分子离子峰，当差值为14=CH2时应小心，这表明可能有待测物的同系物存在。b、利用经验规律：——分子离子峰应符合“氮律”在C、H、O组成的化合物中，分子离子峰的质量数一定是偶数；在含C、H、O、N化合物中，含偶数个N的分子量为偶数，含奇数个N的分子量为奇数——不符合上述规律者必不是分子离子峰。通过改变仪器实验条件来检验：

1）采用化学电离源、场离子或场解吸源等电离方法；2）制备易挥发的衍生物，如通过甲基化、乙酰基化、甲酯化、氧化或还原等方法将样品制备成适当的衍生物后再测定。3、结构鉴定a)根据质谱图，找出分子离子峰、碎片离子峰、亚稳离子峰、m/z、相对峰高等质谱信息，根据各类化合物的裂解规律，重组整个分子结构。b)采用与标准谱库对照的方法。

由质谱数据推导有物机分子结构的过程，形象地说，如同用弹弓击碎一个瓷花瓶，再由一堆碎片来拼凑复原花瓶的过程。蜂胶素被誉为“紫色黄金”，集动植物之精华,具有复杂而独特的化学组成。富含黄酮类和萜烯类物质。黄酮是人体必需营养成份之一，体内不能合成，但对调节生理功能，提高生命运动质量有重要意义。而蜂胶中含有多种黄酮类物质，因此对蜂胶产品的开发和使用有重要的社会意义。53实验HLPC分离蜂胶中的黄酮类物质仪器与试剂SURVEYOR液相色谱质谱联用仪(美国菲尼根公司)甲醇（色谱纯）;水（高纯水）;芦丁,槲皮素,木犀草素,染料木素,高良姜素,姜黄素标样（分析纯）