菌种的保藏和培养(第一讲)课件

第一讲

微生物菌种保藏和培养

微生物菌种保藏技术

一、保藏原理保藏原理：根据菌株生理生化特性，创造条件(低温、干燥、真空等)使菌体代谢活动处于休眠状态。目的要求：经长期保藏后菌种存活健在；保证菌种不改变表型和基因型，特别是不改变菌种代谢产物生产能力；不被杂菌污染。注意事项：防止变异；要保藏休眠体；培养基宜贫乏，碳源少；尽量减少对细胞的损伤。目的要求：保藏菌种的方法都必须是长期可靠地保持菌种的优良性状不变。保藏时应定期检测菌种活力，以确定保藏培养物的保藏期限，遗传稳定性，保藏方法的可靠性。测定指标：包括在保藏6个月、1年或更长时间后存活百分率(或存活单位)；细胞群体的形态学特征或一些特别的生化特征(如代谢产物的产生、酶活力、遗传特征及生化指标)应在菌种保藏前后保持同一性；以及实验室中、中试车间中和生产发酵中产品的稳定性，后者极为重要。二、保藏菌种的质量控制三、保藏方法斜面低温保藏法液体石蜡覆盖保藏法液氮超低温保藏法沙土管保藏法冷冻干燥保藏法普通冷冻保藏法1、斜面低温保藏法(传代保藏)保藏方法：将菌种定期在新鲜琼脂斜面、穿刺、疱肉（厌氧细菌用）基本培养基上传代，4℃左右保藏保藏期限：一般1～3月注意事项：此法简单经济，可用于实验室中多数菌种的保藏；但易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变，应加以防治。不适宜作生产菌种的长期保藏方法2、液体石蜡覆盖保藏法保藏方法：将琼脂斜面或液体培养菌种物浸入液体石蜡(事先灭菌)中，4℃左右保藏保藏期限：一般为1～10年注意事项：对菌株应预先作石蜡培养试验，保藏株2～3年也应做一次存活试验。此方法简便有效，可用于霉菌、酵母、放线菌和好氧细菌的保藏3、载体保藏保藏方法：是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。保藏期限：一般为1～10年。注意事项：以沙土保存和滤约保存为主。5、普通冷冻保藏法保藏方法：将菌悬液或斜面培养物细胞将菌种加入菌种保护剂，密封于试管或EP管内，贮藏于冰箱的冷藏室或普通冰箱(-20℃)中保藏期限：一般1～2年注意事项：经过解冻的菌株不宜二次保藏；保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管应严格密封；不适宜微生物的长期保藏安瓿管四、细菌常用的几种保存方法1、细菌穿刺培养：一般细菌保存于穿刺培养物可以维持两年。具体方法如下：用灭菌接种针挑取分散良好的单菌落，针缓慢穿过琼脂到达瓶底，连续几次，盖上瓶盖拧紧，做好标记。室温下存放于暗处。（最好一点可以将瓶盖放松，在适当温度下培养过夜，再拧紧瓶盖并加封Parafilm膜，室温或最好在4度避光保存）。2、细菌甘油保存（1）：在液体培养基中生长的细菌培养物：取0.85ml细菌培养物，加入0.15ml高压灭菌甘油，振荡培养物使甘油分布均匀，然后转移到标记好的保存管内，密封，在乙醇－干冰或液氮中冻结后再转至－70度长期保存。在复苏时，用灭菌接种针刮取冻结的培养物表面，然后立即把黏附于接种针上的细菌划于含适当抗生素的LB琼脂平板表面，于37度过夜。2、细菌甘油保存（2）：在琼脂平板上生长的细菌培养物：从琼脂平板表面刮下细菌放入装有2mlLB的无菌试管内，再加入等量的含有30％灭菌甘油的LB培养基，振荡使甘油完全分布均匀后，分装于无菌保存管内，密封，再按前述方法冰冻保存。这一方法的优点在于可用于保存在质粒载体上建立的cDNA文库。四、菌种的退化与复壮1、菌种的退化：菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。2、菌种的复壮：纯使衰退的菌种恢复原来优良性状。狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从生产中选种

五、接种、分离纯化与培养接种方法斜面接种（基础，无菌操作）液体接种（固液、液液、液固）穿刺接种（半固体培养基）点植接种（霉菌菌落形态观察）平板划线接种（最常用）