重组DNA导入受体细胞

关于重组DNA导入受体细胞第1页，共25页，2022年，5月20日，11点42分，星期六转化转染转导接合转移1.重组体导入细菌细胞（1）大肠杆菌重组质粒DNA分子进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称之为转化（transformation)。转化不仅适合于大肠杆菌受体细胞，而且适合于枯草杆菌和蓝藻等其他原核生物以及酵母等低等真核生物受体细胞。

化学诱导感受态法电转化感受态细胞（competencecell）是指处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态的细胞。★★第2页，共25页，2022年，5月20日，11点42分，星期六I.化学诱导感受态法

原理：E.coli细胞处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，细胞膨胀成球形，细胞膜形成液晶结构，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，液晶结构被扰动而使细胞膜出现间隙，促使DNA复合物进入细胞，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。第3页，共25页，2022年，5月20日，11点42分，星期六Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到106～108转化子/gDNA。化学法简单、快速、稳定、重复性好，感受态细菌可以在-70℃保存，但转化DNA大小有限制，不同物种需要不同的诱导方法。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。第4页，共25页，2022年，5月20日，11点42分，星期六培养大肠杆菌OD600至Onice5-10min4℃离心收集菌用冰冷的60mMCaCl2重悬4℃离心收集菌4℃离心收集菌分装、-70℃冻存用冰冷的60mMCaCl2重悬Onice30min用冰冷的60mMCaCl2重悬感受态细胞制备

制备感受态菌必须使用对数生长期的菌，且必须在冰冷的条件下制备。CaCl2处理充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。

储存感受态菌要在-70℃以下，使用感受态菌时必须迅速融化，融化后一般不能再次冻存使用第5页，共25页，2022年，5月20日，11点42分，星期六10ng质粒DNA100L感受态菌冰上混合，静置10分钟42ºC1分钟冰浴2min，加入1mLLB培养基37℃摇1小时10-100L转化液涂含抗菌素的平板吸附DNA摄入DNA转化过程第6页，共25页，2022年，5月20日，11点42分，星期六II.电转化

可以转化大分子DNA（>50Kb)，胞壁较厚的物种需要制备原生质体后电转化电穿孔转化法最早用于将DNA导入真核细胞，1988年，Dower等人成功地应用该法进行了大肠杆菌的转化。原理:利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔(electroporation),形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的有效吸收。电穿孔转化法的效率受电场强度、电脉冲时间和外源DNA浓度等参数的影响，通过优化这些参数，每微克DNA可以得到109～1010转化子。电压增高或电脉冲时间延长时，转化效率将会提高，但受体细胞存活率会降低。研究表明，当电场强度和脉冲时间的组合方式导致50%～70%细菌死亡时，转化效率达到最高。★第7页，共25页，2022年，5月20日，11点42分，星期六LB培养受体菌至OD600冰浴15分钟，4℃离心集菌冰冷的水重悬菌体4℃离心集菌冰冷的水重悬菌体4℃离心收集菌体少量冰冷的水重悬细胞分装成50L电转仪调为2.5kV,25F脉冲控制器200-4000.5g质粒DNA混合、冰浴加入1mLSOC培养液37°C中速震荡60分钟涂布转化细胞制备：电转化：第8页，共25页，2022年，5月20日，11点42分，星期六用于电穿孔转化法的细胞处理要比感受态细胞的制备要容易，当细菌生长到对数中期后予以冷却、离心，然后用低盐缓冲液充分清洗降低细胞悬浮液的离子强度，并用10%甘油重悬细胞，使其细胞浓度为3×1010个／ml，分装，在干冰上速冻后置于-70℃贮存。每小份细胞融解后即可用于转化，有效期达6个月以上一般电穿孔转化须在低温下（0～4℃）进行，转化效率要比在室温下操作提高约100倍。由于细菌细胞相对较小，因此与DNA导入真核细胞时相比，大肠杆菌的电转化要求有更高的场强，而反应体积则相对要小，以20～40μl为宜。第9页，共25页，2022年，5月20日，11点42分，星期六第10页，共25页，2022年，5月20日，11点42分，星期六第11页，共25页，2022年，5月20日，11点42分，星期六（2）枯草芽孢杆菌Spizzen感受态转化原生质体转化电转化枯草芽孢杆菌可以形成自然感受态，在对数生长后期由信息素激发一种二元信号传导系统的调节，激活一系列感受态相关基因的表达。Spizzen在1958年发现这一现象并发展了感受态转化的方法.基本步骤：细胞在较为丰富的培养基中培养至对数生长后期，然后转接到营养贫瘠的培养基中，可使其形成感受态（一般非常短暂）I.Spizzen感受态转化★第12页，共25页，2022年，5月20日，11点42分，星期六在枯草芽孢杆菌中，转化的过程包括外源DNA的吸附、断裂、吸收降解和重组（或形成独立的复制单元，如质粒）几个阶段：吸附：这一过程发生在感受态细胞的表面，是一个非共价结合的过程。在枯草芽孢杆菌的感受态细胞表面平均约有50个DNA吸附位点，这些位点对双链DNA有非常大的亲和力双链DNA的断裂：在吸附发生后的30秒内，DNA被核酸酶随机断裂，其平均长度约为7kb。DNA的降解和吸收：在断裂发生之后，双链DNA的一条链被完全降解，另一条链穿过细胞壁和细胞膜后进入胞内。合成双链并环化：变成双链后依靠同源区环化。自身无同源区段（重复序列）的DNA，转化效率极低。对于质粒单体，需要体外酶切、连接成质粒多聚体才能高效转化。103~105个/gDNA缺点：对于生长差别较大的菌株需要重新确定转接培养时间；酶切后质粒无法转化。由于需要借助同源重组来重新环化质粒，对于recA缺陷菌株转化效率非常低★第13页，共25页，2022年，5月20日，11点42分，星期六

原理：用溶菌酶等处理消化部分细胞壁，制备原生质体，在PEP(聚乙二醇）等促溶剂作用下使细胞膜形成小孔，胞外DNA通过小孔进入胞内,然后在再生培养基上筛选转化子。II.原生质体转化

优点：不需要质粒有自身同源区，因此对于单体质粒的转化效率也很高（106个/微克DNA

）缺点：转化效率随质粒分子量变大而减小；部分抗生素在再生培养基失去筛选作用（例如卡那霉素在DM3培养基中无效）不适用于革兰氏阴性菌III.电转化

原理、步骤和大肠杆菌电转化一样，但转化效率很低(<106个/微克DNA)

★第14页，共25页，2022年，5月20日，11点42分，星期六2.酵母菌的转化方法（1）原生质体转化法早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质球转化法。在Ca2+和PEG的存在下，转化细胞可达存活的原生质球总数的1%-5%。但是操作周期长（再生需4~6天），而且转化效率受到原生质再生率的严重制约。酵母原生质转化法一个显著特点是，一个受体细胞可同时接纳多个质粒分子，而且这种共转化的原生质占转化子总数的25%-33%。

酵母原生质体感受态酶去壁CaCl2、PEG插入外源基因的酵母载体PEG（聚乙二醇）CaCl2使细胞壁具有通透性，允许DNA进入。转化★第15页，共25页，2022年，5月20日，11点42分，星期六（2）碱金属离子介导的酵母菌转化酿酒酵母经碱金属离子（如Li+等）、PEG热休克处理后，也可高效吸收质粒DNA，而且具有以下特性：吸收线性DNA的能力明显大于环状DNA，二者相差80倍,共转化现象较为罕见。（3）电转化法酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒DNA，但在此过程中应避免使用PEG，它对受电击的细胞具有较大的负作用。其优势在于不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件，适用范围广，而且转化率高达105转化子/μgDNA。

酵母0.1mol/LLiCl处理插入外源基因的酵母载体感受态40%PEG4000★★第16页，共25页，2022年，5月20日，11点42分，星期六其他导入技术：接合转移在质粒转移过程中，利用供体细胞可与受体细胞发生接合作用而将质粒导入受体细胞的方法，供体细胞和受体细胞可以为不同微生物：例如大肠杆菌和链霉菌供体细胞含有辅助质粒，辅助质粒为可转移的接合型质粒，含有与接合转移有关的基因（tra），这类质粒一般也是广宿主质粒。而重组质粒一般不含tra基因，但有bom基因，可以被诱动转移；一般是穿梭载体，保证在供体菌（E.coli）和受体菌（例如根瘤菌或链霉菌）中均能复制。将含辅助质粒的细胞、含重组质粒的供体细胞与受体细胞三者共同培养，便可实现重组质粒导入受体细胞，称为三亲杂交接合转移★第17页，共25页，2022年，5月20日，11点42分，星期六三亲杂交接合转移重组质粒从大肠杆菌转移到土壤农杆菌★第18页，共25页，2022年，5月20日，11点42分，星期六叶盘消毒切取土壤农杆菌浸泡看护培养基愈伤组织分化幼苗3.导入植物细胞（1）叶盘法（leafdisk)★第19页，共25页，2022年，5月20日，11点42分，星期六植物细胞原生质体纤维素酶和果胶酶DNA混合入电击缓冲液1-2kV,3-25F电击愈伤组织幼苗分化（2）.电击法（electroporation)☆第20页，共25页，2022年，5月20日，11点42分，星期六又称高速微型子弹射击法（High-velocitymicroprojectiles)以冷压缩气体为动力将吸附DNA的金属微粒打入细胞内，完成基因转移，适合各种细胞（微生物、动植物）。快速、简便、安全、高效。还可以导入细胞（如内生菌）、蛋白、细胞器、细胞核等。DNA1.2m钨弹头吸附特制手枪射击植物装入（3）.基因枪法（genegun）☆第21页，共25页，2022年，5月20日，11点42分，星期六原理（略）4.导入动物细胞（1）.磷酸钙沉淀法在磷酸钙-DNA沉淀物中，两种物理上毫无联系的DNA分子混合物往往能侵染同一个细胞该方法经常用于两种DNA同时转化一个宿主细胞的过程(也称为共转化）。在基因工程实验中,时常需要用没有选择表型的质粒作转化,然后在宿主菌中筛选出这种质粒。这时可采用有选择标记的另一质粒与之共转化,通过后者进行筛选。这项技术常用于哺乳类细胞的实验，效率高达15%。★第22页，共25页，2022年，5月20日，11点42分，星期六脂质体有商业试剂盒（如LifeTechnologies）。（2）.脂质体（lipofectin）载体法利用脂类包埋DNA，通过脂类和细胞膜的融