重组人胰岛素 信息资料

CN1177928A［中文］发明名称一生产人胰岛素出】主n申请号CN94195231申请日1994.12.29公开（公告）号CN1177928A公开（公告）日1998.04.01IPC分类号A61K38/28;C12N15/17申请（专利权）人生物技术通用公司；发明人J・R•哈特曼;S・口德罗维茨;M•戈雷基；优先权号优先权日申请人地址美国新泽西州；摘要［支持框选翻译］简体中文->英文英文->简体中文其他语种提供了改进且有效的通过折叠胰岛素原杂交多肽来生产重组人胰岛素的方法。摘要附图发明名称--Generationofhumaninsulin出】主n申请号CN94195231申请日1994.12.29公开（公告）号CN1177928A公开（公告）日1998.04.01IPC分类号A61K38/28;C12N15/17;C12N15/16

申请(专利权)人BIOTECHNOLOGYGENERALCORP;发明人HARTMANJR;MENDELOVITZS;GORECKIM;优先权号CN94195231优先权日1994.12.29摘要［支持框选翻译］申请(专利权)人BIOTECHNOLOGYGENERALCORP;发明人HARTMANJR;MENDELOVITZS;GORECKIM;优先权号CN94195231优先权日1994.12.29Animprovedandefficientprocessfortheproductionofrecombinanthumaninsulinbyfoldingofaproinsulinhybridpolypeptideisprovided.摘要附图生产胰岛素的方法包括：在允许形成正确二硫键的条件下，折叠含胰岛素原的杂种多肽；使折叠的、二硫键键合的杂种多肽经酶促裂解以产生胰岛素；纯化胰岛素。根据权利要求1的方法，其中步骤(a)还包括在约pH8.5-12.0,约4-37^将杂种多肽保温约1-30小时。根据权利要求2的方法，其中在存在抗坏血酸的条件下进行保温。根据权利要求2的方法，其中pH为11.0-11.25。根据权利要求3的方法，其中pH为11.0-11.25。根据权利要求3的方法，其中在折叠混合物中，抗坏血酸的浓度为每摩尔SH基约2摩尔抗坏血酸。根据权利要求2的方法，其中所述保温时间为约5小时。根据权利要求3的方法，其中所述保温时间为约5小时。根据权利要求1的方法，其中步骤(b)还包括：(I)将pH调到约8.8-9.0；和(ii)在16-37^用胰蛋白酶和羧肽酶B裂解杂种多肽30分钟-16小时。根据权利要求1的方法，其中步骤(c)还包括用DEAE-Sepharose层析和RP-HPLC纯化。根据权利要求1的方法，其中步骤(c)还包括用超滤和CM-Sepharose层析纯化。根据权利要求1的方法，其中步骤(c)还包括用DEAE-Sepharose层析和苯基-Sepharose层析。根据权利要求1的方法，其中用ATCC保藏号为69361的质粒pDBAST-LAT表达胰岛素原杂种多肽。根据权利要求1的方法，其中用ATCC保藏号为69363的质粒p入BAST-LAT表达胰岛素原杂种多肽。根据权利要求1的方法，其中用ATCC保藏号为69362的质粒pBAST-LAT表达胰岛素原杂种多肽。根据权利要求1的方法，其中通过处理含编码杂种多肽之DNA的细菌细胞，以便DNA指导所述多肽的表达，从而得到步骤(a)的杂种多肽。根据权利要求16的方法，其中从所述细胞中回收杂种多肽。根据权利要求16的方法，其中所述处理包括存在葡萄糖，甘油或半乳糖的条件下发酵。根据权利要求17的方法，其中所述回收包括：(I)破坏所述细菌细胞的细胞壁或其片段以产生溶胞产物；通过离心从溶胞产物中分离细胞内沉淀物；和增溶所述沉淀物。含有胰岛素原和与所述胰岛素原的N-末端相连的前导肽的多肽，其中所述多肽被折叠并含有正确的二硫键。根据权利要求20的多肽，其中所述前导肽衍生于CuZnSOD的N-末端。根据权利要求21的多肽，其中所述前导肽含有62个氨基酸，其前为氨基酸Met，其后为Arg残基。根据权利要求20的多肽，其中所述胰岛素原含有通过单Arg残基与胰岛素A链共价相连的胰岛素B链。根据权利要求20的多肽，其中所述胰岛素原含有通过二肽Lys-Arg残基与胰岛素A链共价相连的胰岛素B链。根据权利要求20的多肽，其中前导肽的Cys残基已经被Ser残基所取代。说明书生产人胰岛素这是美国系列申请08/175298，1993年12月29日申请的接续申请。发明背景在本发明说明书中，用括号内的阿拉伯数字列出了各种文献。在说明书后，权利要求前可以找到这些参考文献的所有引述。将这些文献公开的所有内容均引入本说明书作为参考以便更全面地描述本发明所涉及的现有技术的状态。胰岛素是控制葡萄糖代谢所必需的多肽激素，每天施用给患糖尿病的患者，糖尿病是胰岛素供应不足而引起的代谢紊乱。体内，首先将该激素合成成长前体分子，随后加工成由A和B链组成的其生物活性形式。更详细地说，在内分泌胰腺的8细胞内，将前原胰岛素的基因转录成mRNA前体，然后剪接生产成熟mRNA。将所述mRNA翻译成前原胰岛素(NH2-前区-B链-C肽-A链-COOH)，接着再加工成胰岛素原并最终加工成胰岛素。该过程的第一步就是蛋白水解除去前区，该区是通过内质网的微粒体膜来转移新链的疏水信号序列。在人前原胰岛素中，前区的长度是24个氨基酸。在胰岛素原中，将变成成熟胰岛素的多肽链的两个区，B-和A链通过C肽(或C-链)彼此相连，所述C肽在N和C末端含有两对碱性氨基酸。在大多数C肽中，这些配对是Arg-Arg和Lys-Arg。人C肽，包括两个侧对的碱性氨基酸，含有35个氨基酸。C肽与所述多肽的两个部分相连以便有助于在B和A片段之间形成二硫键。因此，C肽的作用很大程度上不依赖其结构。事实上，用较短的合成桥键代替仍能适当地折叠胰岛素原分子(1，2)。胰岛素原折叠，同时发生两个链间二硫键和一个A链二硫键的氧化。在成熟化的最后阶段，蛋白水解酶在碱性氨基酸处裂解以释放C肽并形成成熟胰岛素(3)。在人胰岛素中，A链有21个氨基酸，B链有30个氨基酸。世界上每年胰岛素的需求超过数吨，而且严重供不应求。传统上，胰岛素是从有限的动物源中生产的，主要是牛和猪胰腺制品，它们不同于人胰岛素，因此会引发有害的免疫反应。在六十年代完成的研究表明，可以体外生产胰岛素。通过用其S-磺化形式(4)将A和B链结合或通过自发再氧化还原的胰岛素原(5)来合成胰岛素。后一种方法由于在氧化混合物中蛋白质浓度很低，不能用于大规模生产胰岛素。在用胰蛋白酶和羧肽酶B处理后(6)，可以回收胰岛素。最近半合成和生物合成的(重组)人胰岛素也可以得到。半合成的人胰岛素是通过胰蛋白酶催化B链30位的Ala换成Thr(是猪胰岛素和人胰岛素之间的唯一不同)而从猪胰岛素生产的。在大肠杆菌或酵母中生产的重组人胰岛素最终将取代所有其它生产途径。现在通过两种途径制备半合成重组人胰岛素：在大肠杆菌中分开生产A和B链，然后将其结合在一起(7,8)，或酶促转变在大肠杆菌(1，8)或酵母(2,9冲表达的胰岛素原等多肽。在大多数情况下，胰岛素原是作为杂种蛋白质而生产的，以细胞内沉淀蛋白质的形式积累。正常纯化所述杂交物，然后用CNBr裂解以释放胰岛素原多肽。后者再通过氧化亚硫酸水解(sulfitolysis)修饰得到胰岛素原S-磺酸盐。然后在还原条件下纯化并折叠胰岛素原S-磺酸盐，得到胰岛素原(8)。通过胰蛋白酶和羧肽酶B(6)的联合作用将胰岛素原转变成胰岛素。专利公开EP195691(NovoNordiskA/B)描述了分子式为B-Lys-Arg-A的胰岛素原以及其用于在酵母中制备胰岛素的用途。专利公开EP196056B1(ChironCorp.，)描述了用酵母生产的hSOD-胰岛素原蛋白质。在折叠前，使hSOD-胰岛素原蛋白质经漠化氰裂解和亚硫酸水解。Hoechst在EPO379162中描述了可以将’胰岛素前体的错重组体“(即，有不正确或部分不正确分子间二硫键的重组胰岛素产物)不通过亚硫酸水解，而是在有机氧化还原系统的存在的条件下，在含水介质中通过将错重组体与过量硫醇反应而转变成正确的胰岛素产物。在氨基酸或肽基从融合多肽裂解后(化学或酶促)(发生在宿主细胞溶解后)进行源(original)亚硫酸水解(sulfitolysis)步骤，因为然后要将胰岛素前体的6个半胱氨酸转变成其S-磺酸盐。在随后的复性步骤中，通过形成三个正确的二硫键而从所述胰岛素原S-磺酸盐生产天然胰岛素原。在该复性步骤，产生了所谓“错重组体”。Hoechst在PCTWO91/03550中还公开了制备含所需蛋白质(如胰岛素原)和“平衡组分”的方法。亚硫酸水解在折叠前完成，而在折叠后，与胰岛素原的C-链同时裂解掉“平衡组分”。另外，Hoechst在EP347781B1中描述了“小胰岛素原”(B-Arg-A)和其用于致病单-Arg胰岛素和胰岛素的用途。他们还描述了含有B-Arg-A和“平衡组分”的融合蛋白质。在折叠多肽前，用漠化氰裂解“平衡组分”并完成亚硫酸水解。本发明公开了用改进并有效的方法生产重组人胰岛素。在大肠杆菌中合成含有前导序列的重组胰岛素原杂种多肽。部分纯化后，在可以进行之前折叠的条件下，将其折叠，但仍连接着前导肽。然后通过用胰蛋白酶和羧肽酶B结合处理而产生有生物活性的人胰岛素，其中这些酶同时裂解掉了前导肽和C链。因此生产的纯化人胰岛素与天然产生的人胰岛素相同。在杂种多肽的CNBr裂解和用于保护丰富SH基团的亚硫酸水解中所涉及的有害和麻烦的过程在所述新方法中除去了，因为可以将完整的胰岛素原杂种多肽有效折叠成其天然结构，甚至是在存在前导肽和未保护的半胱氨酸的情况下。通过酶促裂解释放活性重组人胰岛素，然后将其纯化。附图的简要描述在附图3-5中所列三个质粒的限制图谱中，并未鉴定出在这些质粒上的所有限制位点。但是，列出了完全理解本发明所必需的那些限制位点。图1：通过酶促裂解表达质粒pBAST-R而产生的折叠的、二硫键结合的胰岛素原杂种多肽，从而得到人胰岛素。只表明了部分SOD前导序列。图2：通过酶促裂解表达质粒pBAST-LAT或质粒p入BAST-LAT而产生的折叠的、二硫键结合的胰岛素原杂种多肽，从而得到人胰岛素。只表明了部分SOD前导序列。图3：质粒pBAST-R的结构，编码SOD-胰岛素原杂种多肽的表达质粒，保藏号为ATCC69362。图4：质粒pDBAST-LAT的结构，编码SOD-胰岛素原杂种多肽的表达质粒，保藏号为ATCC69361。图5：质粒p入BAST-LAT的结构，编码SOD-胰岛素原杂种多肽的表达质粒，保藏号为ATCC69363。图6：用质粒pBAST-R表达的SOD-胰岛素原杂种多肽的氨基酸序列和相应的DNA核苷酸序列。图7：用质粒pDBAST-LAT和p入BAST-LAT表达的SOD-胰岛素原杂种多肽的氨基酸序列和相应的DNA核苷酸序列。图8：人胰岛素生产，来自用质粒pDBAST-LAT表达的胰岛素原杂种多肽，作为折叠混合物pH的函数。在4°C，经16小时，用1mg/ml或0.5mg/ml杂种多肽，在100mM甘油中，于不同pH完成胰岛素原杂种多肽的折叠(按实施例2所述生产的)。37C，pH9用(胰蛋白酶1:500w/w)(Sigma)和羧肽酶B(CPB，Sigma，1:200w/w)将折叠材料处理30分钟，然后通过利用1251-胰岛素(Amersham)和人重组胰岛素(Calbiochem)为标准的放射性免疫检测法检测免疫反应性(IR)。图9：用质粒pDBAST-LAT表达的胰岛素原杂种多肽生产人胰岛素将胰岛素原杂种多肽(按实施例2所述生产的)溶解在8M脲，浓度为约30mg/ml的5mMHCl，然后用100mM甘油-NaOH稀释1mg/ml，pH11.0中。在22C(室温)折叠20小时。然后用HCl将pH调到8.8。加入羧肽酶B(1:1000w/w，Sigma)和胰蛋白酶(1：2000w/w，Sigma)在37C将反应混合物保温60分钟。在用10mMHCl稀释前，将消化混合物酸化到pH3。在250X4mm，5pLichrosphere100RP-8柱(Merch)上，通过反相高压液体层析(RP-HPLC)分析150pl的样品，所述柱用含31.5%(v/v)乙月青的50mM磷酸四乙胺，162mMNacl4,pH3平衡。用31.5%-40.5%乙青的现象梯度，在75分钟内，以1ml/分的流速使该柱展开。检测在220nm的吸收值。A：5ug标准胰岛素(Boehringer-Mannheim)；B：酶促处理后产生的重组人胰岛素；C：折叠的SOD-胰岛素原杂种多肽。图10：质粒pDBAST-LAT表达的胰岛素原杂种多肽生产人胰岛素作为折叠混合物中pH的函数将胰岛素原杂种多肽(按实施例2中所述生产的)用有标明pH值的100mM甘油-NaOH缓冲液稀释到1mg/ml，然后在22C折叠16小时。按图9所述完成酶处理和RP-HPLC分析。根据与标准胰岛素有相同滞留时间的峰的面积计算从杂种多肽产生的重组人胰岛素的量。图11：质粒pDBAST-LAT表达的胰岛素原杂种多肽生产人胰岛素作为折叠混合物中抗坏血酸浓度的函数存在标明抗坏血酸浓度的条件下，在100mM甘油-NaOH，pH11.2中，于22C以1mg/ml折叠SOD-胰岛素原杂种多肽(按实施例2所述生产的)。在5和25小时的折叠过程后，用胰蛋白酶和羧肽酶B(按图9)处理样品。在RP-HPLC(按图9)上分析重组人胰岛素产品。图12：从质粒pDBAST-LAT表达的胰岛素原杂种多肽生产的人胰岛素的可靠性22°C,,在100mM甘油-NaOH,pH11.2和1.2mM抗坏血酸中，22°C以1mg/ml折叠SOD-胰岛素原杂种多肽16小时。酶处理后（按图9）,在用20mMTris-HCl,pH8平衡的DEAE-Sepharose柱上层析分析所述混合物。用在20mMTris-HCl,pH8中0-0.4M的NaCl现象梯度洗脱重组人胰岛素。收集峰部分，然后用HCl酸化到pH3。再按图9所述，用RP-HPLC从胰岛素样分子进一步纯化重组人胰岛素。收集主峰，用0.25M乙酸在SephadexG-25柱上脱盐，然后冻干。用制备于10mMHCl中的样品（5ug重组人胰岛素），在相同的条件下用RP-HPLC分析。A：标准胰岛素；B：HPLC纯化的重组人胰岛素；C：HPLC纯化的重组人胰岛素和标准胰岛素的组合样品。图13：从质粒pDBAST-LAT表达的胰岛素原杂种多肽生产的人胰岛素作为蛋白质浓度的函数在100mM甘油-NaOH，pH11.2中，按标明的0.5mg/ml-10mg/ml的终蛋白质浓度，折叠SOD-胰岛素原杂种多肽（按照实施例2所述生产的）。用每molSH基2.5mol抗坏血酸补充各折叠混合物。24C（室温）折叠16小时。按照图9中的描述完成酶促处理和RP-HPLC分析。图14：用质粒pDBAST-LAT表达的，来自粗细胞内沉淀的胰岛素原杂种多肽生产的人胰岛素，作为折叠时间的函数以每ml约2.6A280的浓度，将细胞内沉淀溶解在20mM甘油-NaOH，33uMEDTA，pH11.2中。用10N氢氧化钠将pH调到12。将溶液放置并搅拌10分钟。用浓缩的盐酸将pH滴到11.2。加入活化的活性炭（酸洗涤的，Sigma）到0.1%w/v的终浓度，然后将混合物搅拌30分钟。澄清上清液的A280为约2.15。补充抗坏血酸达到3mM终浓度。在室温（22-23C）剧烈搅拌，按所示折叠胰岛素原杂种多肽。在试验的不同时间点（从溶解开始），依次取10ml样品，滴到pH8.8,然后存在50uMZnCl2的条件下，用羧肽酶B（1:1000w/w）和胰蛋白酶（1：2000w/w）消化。按图9所述，用RP-HPLC分析确定各消化样品中的胰岛素含量。根据胰岛素的增加（消化后），游离SH基降低的水平确定折叠反应的进展，用Ellman反应（16）检测后者。本发明概述本发明提供了生产人胰岛素的方法，包括在允许正确二硫键形成的条件下，折叠含胰岛素原的杂种多肽，使折叠的，二硫键结合的杂种多肽经酶促裂解产生活性人胰岛素，然后纯化活性人胰岛素。本发明还提供了含胰岛素原以及与所述胰岛素原N-末端相连的前导肽的多肽，其中所述多肽被折叠，并含有正确的二硫键。本发明的详细描述按照并符合布达佩斯条约对用于质粒目的的微生物保藏之国际承认的要求，将在大肠杆菌中的质粒pBAST-R,pDBAST-LAT,p久BAST-LAT于1993年7月26日保藏在美国典型培养物收集中心（ATCC）（12301ParklawnDrive,Rochville,Maryland20852）保藏号分别为69362,69361和69363。如本文所用的，杂种多肽含有与所需多肽共价相连的前导肽。本发明的杂种多肽含有胰岛素原，优选含有作为前导肽的SOD。如本文所用的，折叠包括折叠杂种多肽，所述杂种多肽含有在折叠前，未用CNBr裂解，而且在折叠前未进行亚硫酸水解以保护SH基团的胰岛素原，其中折叠可以使得在所述杂种多肽中形成正确的二硫键。如本文所用的，杂种多肽形成正确的二硫键包括在胰岛素的CysB7-CysA20，CysB19-CysA20和CysA6-CysA11之间形成三个二硫键（按照成熟胰岛素中的编号标注Cys残基）。如本文所用的，胰岛素原含有包括胰岛素B,C和A链，从N-末端到C-末端的多肽。如本文所用的，胰岛素的C-链肽含有天然产生的C-肽和任何其它可以通过胰蛋白酶和羧肽酶B裂解的寡肽，二肽或单氨基酸。如本文所用的，前导肽含有与胰岛素B链共价相连的任何肽或多肽，所述前导肽使得可以进行折叠并形成二硫键，而且可以用胰蛋白酶裂解。前导肽优选是SOD。如本文所用的，SOD包括任何实质部分的CuZnSOD或MnSOD的氨基酸序列，而且所述部分不必有SOD的生物学活性，与天然产生的SOD的氨基酸序列相比，所述部分也不必有相同的氨基酸序列。用本领域已知的方法，如Bauer等人(1985)，Gene，37：73-81可以突变编码SOD的DNA。前导肽除SOD夕卜，可包括任何其它肽，多肽或蛋白质或任何所述肽，多肽或蛋白质之任何实质部分的氨基酸序列，其中所述部分既不必有是肽，多肽或蛋白质的生物学活性，与天然产生的肽，多肽或蛋白质相比，所述部分也不必有相同的氨基酸序列；然而，前导肽必须允许杂种多肽折叠并形成正确的二硫键。如本文所用的，胰岛素可以包括天然胰岛素的同系物。如本文所用的，胰岛素原可以包括天然胰岛素原的同系物。如本文所用的，与用本发明方法生产的胰岛素多肽有关的术语“同系物”指与胰岛素有基本上相同的氨基酸序列和基本上相同的生物学活性的多肽。因此，同系物可以因一个或多个非必需氨基酸残基的增加，缺失或取代而不同于用本发明方法生产的胰岛素多肽，只要所得的多肽保留了胰岛素的生物学活性。本领域技术人员用熟知的方法，包括，例如用于设计制备DNA序列的常规方法，所述DNA序列用于细菌表达多肽之多肽同系物，通过定点诱变技术修饰cDNA和基因组序列，构建重组蛋白质和表达载体，细菌表达多肽以及用常规生物化学方法检测多肽的生物化学活性，很容易确定可以增加，缺失或取代哪个氨基酸(包括可以用哪个氨基酸进行取代)。胰岛素同系物的上述定义等同用于胰岛素原的同系物。用本发明方法生产的胰岛素同系物的实例是含有少于天然胰岛素之所有残基的缺失同系物，其中一个或多个特定残基由其它残基取代的取代同系物以及其中一个或多个氨基酸残基增加到所述胰岛素多肽末端或中间部分的增加同系物，所有这些均有胰岛素的生物学活性。同系物的实例是在EPO专利申请EP384472中公开的类似物以及在“EliLillyandCompanyReporttoShareholder1992”中公开的EliLilly的胰岛素类似物“Humalog”。本文将基本上相同的氨基酸序列定义为包括氨基酸序列中的取代和/或缺失和/或增加，而且根据例如由AlbertL.Lehninger，Biochemistry，第二版，WorthPublishersInc.(1975),第4章；Creighton，蛋白质结构，实践方法，IPLPressatOxfordUniversityPress,Oxford，England(1989)；和MargaretO.Dayhoff，AtlasofProteinSequenceandStructure,Vol.5,TheNationalBiomedicalResearchFoundation(1972)，Chapter9描述的同源或等同基团，可包括最多达10个残基。所述取代是本领域专业人员熟知的。用本领域专业人员熟知的方法，例如Baueretal.，(1985)，Gene37：73-81可以突变编码胰岛素多肽的DNA。胺本文所述，可以将突变序列插入到适宜的表达载体中，再将所述载体导入到然后再处理的细胞中，以便突变的DNA表达多肽同系物。含有编码含胰岛素原之杂种多肽的序列的本发明质粒可以在细菌，酵母，真菌或哺乳动物细胞如CHO,鸡胚胎，成纤维母细胞或其它已知的细胞系中表达，它们通常还含有在细菌，酵母，真菌或哺乳动物细胞中表达克隆基因所必需的调节元件，随编码杂种多肽的核酸这样定位，以便使其进行表达。表达所需的调节元件包括与RAN聚合酶结合的启动子序列和与核糖体结合的核糖体结合位点。本发明的质粒表达含胰岛素原的杂种多肽。本发明的专业人员可以理解：用已知技术(如通过定点诱变或插入接头)可以很容易改变与本申请有关的保藏的质粒以表达同源多肽。在例如SambrookJ.，Fritsch，E.F.andManiatis,T.(1989)分子克隆：实验室操作手册，第二版，冷泉港实验室出版社中描述了所述技术。适宜的调节元件位于与编码含胰岛素原之多肽的DNA有关的质粒内，以便在适宜的宿主细胞中影响所述杂种多肽的表达。在本发明优选的实施方案中，调节元件位于编码杂种多肽之DNA的附近和上游。本发明还包括各种核糖体结合位点（RBS），用于提供从编码含胰岛素原之杂种多肽的DNA转录的mRNA，以便结合宿主细胞内的核糖体，如deoRBS。本发明的质粒还含有ATG起始密码子。编码含胰岛素原之杂种多肽的DNA与ATG起始密码子同相。本发明的质粒还包括含复制源点的DNA序列，它们来自细菌质粒，能够在宿主细胞中自主复制。可以从各种来源得到适宜的复制源点，如从质粒pBR322（ATCCNo.37016）中得到。本发明质粒含包括含与可选择或可鉴定表型特征相关之基因的DNA序列，如药物抗性基因，如氨苄青霉素抗性，氯霉素或青霉素抗性，当质粒存在于宿主中时，所述表型特征就会显出。可用于表达编码杂种多肽（含胰岛素原）的载体的实例是病毒，如细菌病毒，如噬菌体（如入噬菌体），粘粒，质粒和其它载体。用本领域熟知的方法，将编码含胰岛素原之杂种多肽的基因插入到适宜的载体中。例如用常规的限制核酸内切酶位点，可以裂解插入片段和载体DNA以产生剪接配对的互补末端，然后用DNA连接酶连在一起。另外，可以将含与载体DNA中的限制位点互补之碱基序列的合成接头与插入DNA相连，然后用在给位点切割的限制酶消化。也可以施用其它方法。优选的细菌宿主细胞是大肠杆菌细胞。适宜大肠杆菌细胞的适宜是菌株S^733（cytRstrA）或4300，但也可以用其它大肠杆菌菌株和其它细菌作为质粒的宿主。作为宿主的细菌可以是任何菌株，包括营养缺陷型（如A1645），原养型（如A4255）和裂解菌株；F+和F-菌株；含入原噬菌体之CI857阻遏物序列的菌株（如A1645和A4255）以及没有deo阻遏物和/或deo基因的菌株（参见欧洲专利申请公开030972，1989年2月22日公开）。已经将大肠杆菌菌株中733和大肠杆菌菌株4300保藏在ATCC，保藏号分别为69361和69363。用本领域熟知的方法，如R.PNovick（Bacteriol.Review33,210（1969））所述的，所有上述大肠杆菌宿主菌株都可能是它们所携带质粒的“cured”。本发明提供了生产胰岛素的方法，包括在允许形成正确二硫键的条件下折叠含胰岛素原的杂种多肽，使（处理）折叠的、二硫键键合的杂种多肽经酶促裂解以产生胰岛素，然后纯化胰岛素。所述胰岛素具有市售人胰岛素的活性和特性。在优选的实施方案中，折叠包括在4-37°C，将杂种多肽在约pH8.5-12.0保温约1-30小时。在另一优选的实施方案中，折叠包括在存在抗坏血酸的条件下，在4-37C，将杂种多肽在约pH8.5-12.0保温约1-30小时。在特别优选的实施方案中，折叠期间的pH为11.0-11.25。在另一特别优选的实施方案中，折叠混合物中抗坏血酸的浓度为约每摩尔SH基团约2摩尔抗坏血酸。在另一实施方案中，保温时间为约5小时。在另一实施方案中，处理包括将pH调整到约8.8-9.0,然后在16-37C，用胰蛋白酶和羧肽酶B将杂种多肽裂解约30分钟到16小时。在另一实施方案中，纯化包括DEAE-Sepharose层析和RP-HPLC。在另一实施方案中，纯化还包括超滤和CM-Sepharose层析。在一特别优选的实施方案中，纯化还包括DEAE-Sepharose层析和Phenyl-Sepharose层析。在一特别优选的实施方案中，用保藏于ATCC，保藏号为69361的质粒pDBAST-LAT表达杂种多肽。在一优选的实施方案中，用保藏于ATCC，保藏号为69363的质粒p入DBAST-LAT表达杂种多肽。在一优选的实施方案中，用保藏于ATCC,保藏号为69362的质粒pBAST-LAT表达杂种多肽。在一优选的实施方案中，通过处理含编码杂种多肽之DNA的细菌细胞以便DNA指导其表达然后从所述细胞中回收杂种多肽，从而得到杂种多肽。设想处理包括存在葡萄糖，甘油或半乳糖的条件下发酵。进一步设想从细胞中回收杂种多肽，包括破坏细菌细胞的细胞壁或其片段以产生溶胞产物，通过离心从溶胞产物中分离细胞内沉淀，溶解沉淀，可选的用层折或超滤纯化杂种多肽。本发明还提供含胰岛素原和连于所述胰岛素原N-末端之前导肽的多肽，其中所述多肽被折叠并含有正确的二硫键。在优选的实施方案中，前导肽衍生于CuZnSOD的N-末端。在特别优选的实施方案中，前导肽含62个氨基酸，其前为Met，其后为Arg残基。在优选的实施方案中，胰岛素原含通过单个Arg残基，与胰岛素A链相连的胰岛素B-链。在另一实施方案中，胰岛素原含通过二肽Lys-Arg与胰岛素A链相连的胰岛素B链。将所述两种胰岛素原分子作为杂种蛋白质生产，否则表达水平极低而且没有商业显著性。在所有优选的实施方案中，用Ser残基取代前导肽的Cys残基。实施例下列实施例是为了有助于理解本发明，但不打算也不应当以任何方式限制其范围。实施例不包括构建载体，将编码所述多肽之基因插入所述载体或将所得质粒导入宿主中所用常规方法的详细描述。所述实施例也不包括检测用所述宿主载体系统生产之多肽所用的常规方法详细描述。所述方法是本领域专业人员熟知的，而且在包括下列实例的大量文献中作了描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.andManiatis，T.(1989)MolecularCloning：ALaboratoryManual，2ndedition，ColdSpringHarborLaboratoryPress.实施例1构建表达SOD-胰岛素原杂种多肽的生产质粒pBAST-R，pBAST-LAT和p入BAST-LAT构建在deoP1P2或入PL启动子控制下的细菌表达载体，它们在大肠杆菌中过是生产杂种蛋白质。将胰岛素原生产成杂种蛋白质，因为发现含编码胰岛素B-链-Lys-Arg-胰岛素A-链之表达载体的细菌生产不出可检测的多肽。杂种蛋白质含有一个衍生于CuZnSOD(11)的N-末端的62个氨基酸长的前导肽，在该前导肽N-末端前为Met残基，C-末端后为Arg残基，该Arg残基使其与胰岛素B链相连。胰岛素B链通过由Lys-Arg或Arg组成的短C链肽与胰岛素A链相连。原存于SOD的两个Cys由Ser残基取代。A质粒pBAST-R构建一系列的质粒得到pBAST-R，在转化了适当的大肠杆菌宿主细胞后，能够指导有效表达用于人胰岛素生产的胰岛素原杂种多肽。在图3中列出了质粒pBAST-R的结构，该质粒编码SOD-胰岛素B-链-Lys-Arg-胰岛素A链杂种多肽；图6中列出了所述杂种多肽的DNA序列和相应的氨基酸序列。质粒pBAST-R约4380bp长，含有下列元件(以逆时针方向)：1521bp长的DNA片段，跨pBR322上的AatII-MscI位点，包括四环素抗性基因。1497bp长的DNA片段，跨pBR322上的scaI-HaeII位点，包括截断的氨苄青霉素抗性基因和DNA复制源。930bp长的DNA片段，跨大肠杆菌上的AvaII-PpuMI位点，包括deoP1P2启动子和核糖体结合位点(RBS)(13)。188bp长的DNA片段，跨人CuAnSODcDNA的NdrI-PpuMI位点。通过寡核苷酸定点诱变(12)用Ser参见取代成熟SOD6位和57位的Cys。172bp长的合成DNA片段，有PpuMI和BamHI末端。该区编码Arg-胰岛素B链-Lys-Arg-胰岛素A链。6合成的36bp的多克隆位点多接头，有BamHI和Hindlll末端。7合成的44bp寡核苷酸，含TrpA转录终止子，有Hindlll和Aatll末端(10)。将赋予四环素抗性并编码SOD-胰岛素B链-Lys-Arg-胰岛素A链杂种多肽的质粒pBAST-R导入到大肠杆菌菌株S^733(cytRstrA)中，然后于1993年7月26日保藏在ATCC，保藏号为ATCC69362。B质粒pDBAST-LAT构建另一系列的质粒，得到质粒pDBAST-LAT，在转化适当的大肠杆菌宿主细胞后，能够指导有效高水平表达用于人胰岛素生产的胰岛素原杂种多肽。图4中列出了编码SOD-胰岛素B链-Arg-胰岛素A链杂种多肽的质粒pDBAST-LAT的结构；图7中列出了所述杂种多肽的DNA序列和相应的氨基酸序列。质粒pDBAST-LAT约4377bp长，含下列元件(以逆时针方向)：1.1521bp长的DNA片段，跨pBR322上的Aatll-MscI位点，包括四环素抗性基因。2.1497bp长的DNA片段，跨pBR322上的Scal-Haell位点，包括截断的氨苄青霉素抗性基因和DNA复制源。3.930bp长的DNA片段，跨大肠杆菌上的Avall-PpuMI位点，包括deoP1P2启动子和核糖体结合位点(RBS)(13)。4.188bp长的DNA片段，跨人CuAnSODeDNA的Ndrl-PpuMI位点。通过寡核苷酸定点诱变(12)用Ser参见取代成熟SOD6位57位的Cys，该片段的GC含量降到38%。5.169bp长的合成DNA片段，有PpuMI和BamHI末端。该区编码Arg-胰岛素B链-Lys-Arg-胰岛素A链。合成的36bp的多克隆位点多接头，有BamHI和Hindlll末端。合成的44bp寡核苷酸，含TrpA转录终止子，有Hindlll和Aatll末端(10)。将赋予四环素抗性并编码SOD-胰岛素B链-Lys-Arg-胰岛素A链杂种多肽的质粒pDBAST-LAT导入到大肠杆菌菌株S^733(cytRstrA冲，然后于1993年7月26日保藏在ATCC，保藏号为ATCC69361。C质粒p入BAST-LAT构建另一系列的质粒，得到质粒p入BAST-LAT，在转化适当的大肠杆菌宿主细胞(含cI1857阻遏物)后，能够指导有效高水平表达用于人胰岛素生产的胰岛素原杂种多肽。图5中列出了编码SOD-胰岛素B链-Arg-胰岛素A链杂种多肽的质粒p入BAST-LAT的结构。图7中列出了所述杂种多肽的DNA序列和相应的氨基酸序列。质粒p入BAST-LAT约3777bp长，含下列元件(以逆时针方向)：1.1521bp长的DNA片段，跨pBR322上的Aatll-MscI位点，包括四环素抗性基因。2.1497bp长的DNA片段，跨pBR322上的Scal-Haell位点，包括截断的氨苄青霉素抗性基因和DNA复制源。3.330bp长的DNA片段，跨质粒pSOFa13(14)上的BamHI-EcoRI位点，包括入PL启动子和和一Avrll-Ndel30个碱基对长的deo核糖体结合位点。4.188bp长的DNA片段，跨人CuAnSODcDNA的Ndrl-PpuMI位点。通过寡核苷酸定点诱变(12)用Ser参见取代成熟SOD6位57位的Cys，该片段的GC含量降到38%。5.169bp长的合成DNA片段，有PpuMI和BamHI末端。该区编码Arg-胰岛素B链-Lys-Arg-胰岛素A链。合成的36bp的多克隆位点多接头，有BamHI和Hindlll末端。合成的44bp寡核苷酸，含TrpA转录终止子，有Hindlll和Aatll末端(10)。将赋予四环素抗性并编码SOD-胰岛素B链-Lys-Arg-胰岛素A链杂种多肽的质粒p入BAST-LAT导入到大肠杆菌菌株4300(F-,bio,cI857)中，然后于1993年7月26日保藏在ATCC，保藏号为ATCC69363。30^繁殖细菌细胞。在温度升高到42r后，诱导杂种多肽的生产。实施例2SOD-胰岛素原杂种多肽的发酵，生长条件和纯化I原种培养物使含质粒pDBAST-LAT(或pBAST-R)的大肠杆菌菌株S°733的原培养物在用时速(10mg/ml)补充的酪蛋白培养基(20gr/L酪蛋白水解产物，10gr/酵母提取物和5gr/LNaCl)中生长。然后用冷冻培养基将培养物稀释两倍，然后于-80r贮存。冷冻培养基：K2HPO46.3grKH2PO41.8gr柠檬酸钠0.45grMgSO4・7H2O0.09gr(NH4)2SO40.9gr甘油44gr每500mlII接种物使接种物在生产培养基(见下文)中生长。从原培养物中接种在振荡烧瓶中的灭菌培养基，然后37r，200rpm保温15小时。如果需要，在搅拌的通气发酵罐中完成接种物繁殖的随后阶段。用2-10%烧瓶培养物接种灭菌培养基，然后37r，pH7±0.5,同时搅拌并通气的条件下培养15小时以保持溶解氧的水平在20%的空气饱和度以上。III生产生产培养基：K2HPO48gr/LKH2PO42gr/L柠檬酸钠2gr/LNH4Cl3gr/LK2SO40.6gr/LFeSO4・7H2O0.04gr/LMgSO4・7H2O0.4gr/LCaCl2・2H2O0.02gr/L痕量元素溶液3ml/L四环素0.01gr/L葡萄糖2gr/L甘油1ml/L痕量元素溶液：MnSO4・H2O1gr/LZnSO4・7H2O2.78gr/LCoCl2・7H2O2gr/LNa2MoO4・2H2O2gr/LCaCl2・2H2O3gr/LCuSO4・5H2O1.85gr/LH3BO30.5gr/LHCl(32%)100ml/L用0.5-10%接种培养物接种生产培养基，然后在37r培养。设定搅拌-通气率以使溶解氧的水平保持了约20%的空气饱和度上。用NH3将pH保持在7±0.2。输入50%葡萄糖和30%甘油的灭菌溶液以补充能量和碳源。在细胞浓度达到OD660为25时，输入10%葡萄糖和30%甘油的灭菌溶液，然后继续生长约5小时，直到细胞浓度达到约OD660为60。然后猝冷培养物，并通过离心回收细胞。存在葡萄糖，甘油，半乳糖中的任何一种或其组合作为碳源的条件下，反击大肠杆菌，有利于表达SOD-胰岛素原杂种多肽。IV纯化由质粒pBAST-R和pDBAST-LAT表达的SOD-胰岛素原杂种多肽在细胞内沉淀物中积累，用下列方法分离所述沉淀物：将1gr(净重)的细菌饼悬浮在10ml含50mMTris-HCl，pH8，10mMEDTA的缓冲液中，37r用溶菌酶(Merck，2500u/ml)处理2小时。然后声处理该混合物，加入Nonidet-P-40(Sigma)或TritonX100达到2%的终浓度，然后在室温搅拌2小时。通过离心沉淀沉淀物，然后用水洗涤。按如下用阴离子交换层析纯化杂种多肽至接近均一。将沉淀物溶解在8M脲，20mMTris-HCl，200mMP-巯基乙醇，pH8.2中。离心澄清溶液，然后在用8M脲Tris-HCl，200mMP-巯基乙醇，pH8.2中预平衡的20DEAE-SepharoseFast-Flow柱(PharmaciaLKB)上层析。收集流出物，用40%饱和度的(NH4)SO4沉淀所述杂种蛋白质，或通过在10K膜上超滤，然后用100mMGlycine-HCl，pH3.1透滤来浓缩。另外，通过溶解在8M脲，20mM二硫苏糖醇，50mM醋酸钠，pH5中，然后通过100kD和50kD膜(Filtron)系列膜而将质粒pBAST-R表达的SOD-胰岛素原杂种多肽纯化至均一。在10kD膜上浓缩杂种多肽，然后用40%饱和度的(NH4)SO4沉淀。实施例3SOD-胰岛素原杂种多肽的折叠和酶促裂解将通过(NH4)SO4沉淀或通过超滤(实施例2)得到的胰岛素原杂种多肽溶解在8M脲，5mMHcl中，然后稀释到100mM甘油冲液，pH8.5-12.0中，终浓度为约1mg/ml。A在约4-37r，约1-24小时的时间内折叠质粒pBAST-R表达的SOD-胰岛素原杂种多肽以便形成正确的二硫键。将含折叠的二硫键键合的杂种多肽之溶液的pH用HCl调到约8.8-9.0,在16-37r用胰蛋白酶和羧肽酶B将所述蛋白质处理30-120分钟。在许多试验后，发现最佳条件如下：将质粒pBAST-R表达的杂种多肽溶解在8M脲，5mMHCl中，然后稀释到100mM甘油缓冲液，pH11.0(图8)，终浓度为约1mg/ml，此后，在25r将杂种多肽折叠6-16小时，其后，在37r，用胰蛋白酶(1：500w/w)和羧肽酶B(1:200w/w)将折叠的二硫键键合的杂种多肽裂解30-60分钟。图1中图示说明了酶促裂解质粒pBAST-R表达的，折叠的二硫键键合的胰岛素原杂种多肽，从而产生胰岛素。B在约7-31r，约5-30小时的时间内折叠质粒pBAST-LAT表达的SOD-胰岛素原杂种多肽以便形成正确的二硫键。将含折叠的二硫键键合的杂种多肽之溶液的pH用HCl调到约8.8-9.0,在22-37r用胰蛋白酶和羧肽酶B将所述蛋白质处理16小时。在许多试验后，发现最佳条件如下:将质粒pBAST-LAT表达的杂种多肽溶解在8M脲，5mMHCl中，然后稀释到100mM甘油缓冲液，pH11.0-11.25(图8)，终浓度为约1mg/ml，此后，在25将杂种多肽折叠6-16小时，其后，在25r，用胰蛋白酶(1：15.00w/w)和羧肽酶B(1:10.00w/w)将折叠的二硫键键合的杂种多肽裂解16小时。图2中图示说明了酶促裂解质粒pBAST-LAT表达的，折叠的二硫键键合的胰岛素原杂种多肽，从而产生胰岛素。在图8-14的图注中详细说明了上述A和B的特定条件。实施例4对从质粒pBAST-R表达的SOD-胰岛素原杂种多肽得到的人胰岛素进行蛋白质分析和纯化用市售的人胰岛素为标准（Calbiochem），用放射性免疫检测和RP-HPLC确定从质粒pBAST-R表达的SOD-胰岛素原杂种多肽得到的人胰岛素。根据胰岛素原的氨基酸序列计算的重组人胰岛素的理论产率为45.6%。从图8看出，最佳折叠在pH11。在该pH,胰岛素的生产达理论产率的约80%（相当于输入杂种多肽的约40%）。用RP-HPLC检测从质粒pBAST-R表达的胰岛素原杂种多肽生产的胰岛素。室温使用Vydac218TP54,250X4.6mmI.D（Separationgroup）,5um,300A孔大小柱，流速为1ml/分钟。用0.1%三氟乙酸（TFA）水溶液作为洗脱剂A。用在乙月青中的0.08%TFA作为洗脱剂B。用平衡缓冲液（25%洗脱剂B）将柱洗涤5分钟，然后在37.5分钟内用洗脱剂B25-50%的线性梯度。检测在220nm或280nm的吸收值。用反相高压液体层析分析酶促消化折叠的、二硫键键合的杂种多肽后的人胰岛素表明主峰与标准人胰岛素有相同的滞留时间。制备两小批次，分别得到26mgh和13mg人胰岛素。在3K或5K膜（Filtron）上通过超滤，然后用CM-Sepharose层析（柠檬酸盐缓冲液，pH3）从酶处理的溶液（pH9）中纯化人胰岛素。将峰馏分脱盐，冻干，然后进行N-末端测序和氨基酸分析。这两批次的重组人胰岛素的氨基酸组成与天然人胰岛素的基本相同（参见表1，制剂1）。用Edamn降解法确定胰岛素制剂氨基末端5个氨基酸的序列。发现与人胰岛素A和B链的NH2-末端的相同，这确定了体外产物的可靠性。然而，测序结果表明约25%的分子在第一个位置有一额外的Arg。该结果与在Lys和Arg（在接头序列Lys-Arg内）之间的胰蛋白酶裂解相符，裂解后在A链的氨基末端剩下Arg残基。发现在pH11完成反应可以用在胰蛋白酶在Arg的C-末端进行特异性水解。在该升高的pH，大部分Lys的8-氨基不带电（pK=10.3），因此能够进行选择性裂解。通过在pH11完成胰蛋白酶步骤（参见表1，制剂2），然后在pH8.5用羧肽酶B消化，这两批次分别得到1mg和6.5mg纯化的胰岛素。N-末端测序表明含额外Arg的胰岛素的量降低到约5%。表1重组人胰岛素的氨基酸组成氨基酸残基数目理论值标准胰岛素制剂1制剂2Asx33.203.383.26Thr32.982.832.68Ser32.842.532.77Glx77.157.737.23Pro11.281.131.09Gly44.244.394.25Ala11.001.281.04Cys65.885.115.79Val43.824.583.88Ile22.041.961.96Leu65.876.105.99Tyr43.803.803.87Phe33.153.563.03His22.042.052.08Lys11.011.051.02Arg10.961.301.18制剂1和2表示从质粒pBAST-R表达的胰岛素原杂种多肽生产的重组人胰岛素的氨基酸组成。在pH9（制剂1）或pH11（制剂2）完成胰蛋白酶裂解。过甲酸氧化和气相水解纯化的胰岛素制剂后，进行氨基酸分析。实施例5肽分析从质粒pBAST-R表达之SOD-胰岛素原杂种多肽生产的纯化人胰岛素用内蛋白酶Glu-C（Sigma）（该酶水解在谷氨酰基羧基侧的肽键）使按上述实施例生产的纯化人胰岛素经肽分析。更详细地说，在37°C，100ul0.1MTris-Hcl，pH7.8中，用5ugGlu-C将胰岛素样品消化6小时，所述样品是通过裂解质粒pBAST-R表达的折叠的、二硫键键合的胰岛素原杂种多肽而生产的。完成HPLC分析：将市售（对照）胰岛素和通过裂解质粒pBAST-R表达的折叠的、二硫键键合的胰岛素原杂种多肽而生产的胰岛素样品酸化到约pH3,然后用RP-HPLC分离。使用Vydac218TP54,250X4.6mmI.D（Separationgroup）,5um,300A孔大小柱。用含31.5%（v/v）乙月青的50mM磷酸四乙胺，162mMNaClO4,pH3平衡该柱，然后在75分钟内，以1ml/分钟的流速，用35-45%乙青的线性梯度显色。在220nm测量吸收值。按照对照反应产生了所有预期的肽，甚至在峰后相当于片段之一的小肩可能相当于des-Thr（B30）胰岛素样分子（15）。实施例4和5表明质粒pBAST-R表达的重组多肽含有天然人胰岛素序列。生产的小部分重组蛋白质包括Arg（Ao），desamido-或des-Thr（B30）胰岛素样分子形式。用层析方法，如上述的RP-HPLC可以除去这些不想要的副产物。实施例6对从质粒pBAST-R表达的SOD-胰岛素原杂种多肽得到的人胰岛素进行蛋白质分析和纯化为了避免产生Arg（Ao）胰岛素副产物（实施例4和5），修饰表达质粒pBAST-R以得到只含有编码胰岛素原杂种多肽AB链之间的Arg残基的DNA，这与编码Lys-Arg的DNA，Lys-Arg位于质粒pBAST-R表达的胰岛素原杂种多肽AB链之间。得到表达质粒pDBAST-LAT（实施例1B）和p久BAST-LAT（实施例1C）。折叠并用胰蛋白酶和CPB酶促处理由新表达质粒pDBAST-LAT表达的折叠的、二硫键键合的胰岛素原杂种多肽后，有效生产胰岛素。存在的胰岛素样污染物少（图9）。最佳折叠在pH11.25（图10），在反应混合物中，每摩尔SH基团存在约2摩尔抗坏血酸的条件下，折叠显著增加（图11）。在其它最佳折叠条件下，用系列反应确定蛋白质浓度对从胰岛素原杂种多肽生产的胰岛素的影响。蛋白质浓度不超过1.5mg/ml时，产率最佳（图13）。用DEAE-Sepharose层析，然后用RP-HPLC（如图9所述）纯化胰岛素。正如从图12中所看到的，生产的重组人胰岛素与标准（市售）人胰岛素有相同的滞留时间。纯化的重组人胰岛素制剂的氨基酸组成与标准胰岛素的相同（参见表2）。表2表明从质粒pDBAST-LAT表达的胰岛素原杂种多肽生产的胰岛素没有如实施例4所述的，粘附于胰岛素A链的额外Arg（Arg（Ao）胰岛素）。因此生产胰岛素的优选质粒是质粒pDBAST-LAT，图7中列出了胰岛素原杂种多肽的优选序列。表2重组人胰岛素的氨基酸组成氨基酸残基的数目理论值标准胰岛素重组胰岛素Asx33.203.32Thr32.982.73Ser32.842.71Glx77.157.41Pro11.281.02Gly44.244.46Ala11.001.09Cys65.885.28Val43.824.00Ile22.041.91Leu65.876.34Tyr43.803.64Phe33.153.06His22.042.18Lys11.011.02Arg10.961.07表明了标准人胰岛素和从质粒pDBAST-LAT表达的胰岛素原杂种多肽生产的重组人胰岛素的氨基酸组成。在过甲酸氧化和气相水解纯化的胰岛素制剂后，完成氨基酸分析。实施例7从粗细胞内沉淀物生产来自质粒pDBAST-LAT表达的胰岛素原杂种多肽的人胰岛素使用粗细胞内沉淀物，删去实施例2中的起始纯化步骤，部分IV，可以完成折叠并将胰岛素原杂种多肽转变成胰岛素的改进后的方法。胰岛素的有效生产是在用胰蛋白酶和羧肽酶B（图14和表3）酶促裂解折叠的，二硫键键合的胰岛素原杂种多肽后。将胰岛素产率计算为在pH12，沉淀物溶解步骤确定的起始蛋白质浓度(A280)(图14)。表明从粗细胞内沉淀物折叠SOD-胰岛素原杂种多肽是在从开始试验的约4.5小时(图14)。表3总结了从质粒pBAST-LAT表达的胰岛素原杂种多肽部分纯化胰岛素的情况，所述多肽来自从O.D.660=45的一升发酵培养物质粒的粗细胞内沉淀物。按图14所述完成溶解和折叠。在开始后的4.5小时，用浓缩的盐酸将含折叠的、二硫键键合的胰岛素原杂种多肽的折叠的堆积溶解滴定到pH8.8。加入znCl2(到50uM的终浓度)，羧肽酶B(1:4000w/w)和胰蛋白酶(1:6000w/w)。37°C消化3小时，然后通过加入苯基甲基磺基氟化物(PMSF)到0.5mM的终浓度而终止消化。用HPLC分析(如图9所述)表明，胰岛素的产率为169mg。通过连续的阴离子交换和疏水层析步骤纯化胰岛素。以约每ml树脂50A280单位将消化的折叠混合物负载到用20mMTris-HCl，10mMNaClpH8缓冲液预平衡的DEAESepharoseFastFlow(Pharmacia)柱上。用20mMTris-HCl，100mMNaClpH8缓冲液洗涤结合的物质，然后用在相同的缓冲液中的250mMNaCl洗脱。含胰岛素的池馏分代表20%的负载蛋白质，纯度为37.1%。将硫酸铵加到DEAE洗脱池中达到410mM的浓度，然后以约每ml树脂12A280单位负载到用20mMTrisHCl，540mM硫酸铵预平衡的苯基-SepharoseFastFlow柱上。用平衡缓冲液洗涤结合的物质，用20mMTrisHCl，220mM硫酸铵，pH8缓冲液洗脱胰岛素。含胰岛素的馏分表示负载蛋白质的42.3%，纯度为74.1%。该部分纯化步骤的结果是生产的120mg(等于标准胰岛素)，胰岛素的产率为5.16%。用领域已知的方法，如凝胶过滤，RP-HPLC和结晶(17)可以进行进一步纯化。表3溶解粗细胞内沉淀物，折叠并用胰蛋白酶和羧肽酶B酶促处理后，纯化从质粒pDBAST-LAT表达的胰岛素原杂种多肽生产的重组人胰岛素纯化步骤A280minimumamountofTOC\o"1-5"\h\zinsulinbyHPLC-inmg%purity沉淀物溶解2326--活性炭处理1915--折叠和酶促处理19151698.8DEAE-Sepharose池38314237.1苯基Sepharose池16212074.1A280表示各纯化步骤，在280nm的总吸收值。按照图9所述，参照标准胰岛素，用HPLC确定胰岛素的存在，并对应于标准胰岛素的主胰岛素峰。参考文献：Cousens，L.S.，Shuster，J.R.，Gallegos，C.，Ku，L.，Stempien，M.M.，Urdea，M.S.，Sanchez-Pescador，R.，Taylor，A.andTeKamp0Olson,P.，基因61：265-275，1987。Davidson，H.W.，Rhodes，C.J.andHutton，J.C.，自然333：93-96，1988。Ellman，G.L.，Arch.Biochem.Biophys.82：70-77，1959。Fischer，M.，Fytlovitch，S.，Amit，B.，Wortzel，A.andBeck，Y.，应用微生物生物技术(Appl.Microbio.Biotechnol.)33：424-428，1990。Frank，B.H.andChance，R.E.(1985)，Frank，B.H.andChance，R.E.(1985)，制备并表征人胰岛素的重组DNA源，用于通过遗传工程生产的治疗药物(ThepreparationandcharacterizationofhumaninsulinofrecombinantDNAorigin，inTherapeuticagentsproducedbygeneticengineering，)，QuoVadissymposium，sanofigroup，1985年5月29-30，Toulouse-Labege，法国，pp：137-146。Goeddel，D.V.，Kleid，D.G.，Bolivar，F.，Heyneker，H.L.，Yansura，D.G.，Crea，R.，Hirose，T.，Kraszewski，a.，Itakura，K.andRiggs，A.D.，Proc.Natl.，Acad.Sci.76：106-110.1979.Grau，U.，糖尿病(Diabetes)34：1174-1180，1985.Hartman等人，美国专利5143836，1992年9月1日。Kemmler，W.，Peterson，J.D.andSteiner，D.f.，生物化学期刊(J.Biol.Chem)246：6786-6791，1971.Morinaga,Y.,Franceschini,T.,Inouye,S.andInouye,M.,生物技术2：636-639,1984。Panayotis,G.,Katsoyannis,G.andTometsko,A.,Proc.Natl.,Acad.Sci.U.S.A.55：1554-1561.1966.Schlichtkrull,J.,ActaChem.Scand.10：1459-1464,1956.Sherman,L.,Dafni,L.,Liehman-Hurwitz,J.andGroner,Y,Proc.Natl.,Acad.Sci.80：5465-5469,1983.Steiner，D.F.andClark，J.L.，Proc.Natl.，Acad.Sci.60：622-629，1968.Thim,L.,Hansen,M.T.,Norris,K.,Hoegh,I.,Boel,E.,Forstrom,J.,ammerer,G.andFiil,N.P.,Proc.Natl.,Acad.Sci.美国，83：6766-6770,1986.Wetzel,R.,Kleid,D.G.,Crea,R.,Heyneker,H.L.,Yansura,D.G.,Hirose,T.,Kraszewski,A.,Riggs,A.D.,Itakura,K.andGoeddel,D.V.,基因16：63-71,1981.Yanofsky,C.,Platt,T.,Crawford,I.P.,Nichols,B.P.,Christie,G.E.,Horowitz,H.,VanCleemput,M.andWu,A.M.,核酸研究.9：6647-6668,1981CN1231259C［中文］发明名称--生产人胰岛素出】主n申请号CN94195231申请日1994.12.29公开（公告）号CN1231259C公开（公告）日2005.12.14IPC分类号A61K38/28;C12N15/17

申请（专利权）人萨文特医药公司；发明人J・R•哈特曼;S・口德罗维茨;M•戈雷基；优先权号优先权日申请人地址美国新泽西州；摘要［支持框选翻译］简体中文-＞英文英文-＞简体中文其他语种提供了改进且有效的通过折叠胰岛素原杂交多肽来生产重组人胰岛素的方法。摘要附图发明名称--Generationofhumaninsulin出】主n申请号CN94195231申请日1994.12.29公开（公告）号CN1231259C公开（公告）日2005.12.14IPC分类号A61K38/28;C12N15/17;C12N15/16申请（专利权）人SAWENTEMEDICALINC;发明人GORESKIJRHARTMANSMENDELOV;优先权号CN94195231优先权日1994.12.29摘要［支持框选翻译］简体中文-＞英文英文-＞简体中文其他语种Abstract：Animprovedandefficientprocessfortheproductionofrecombinanthumaninsulinbyfoldingofaproinsulinhybridpolypeptideisprovided.摘要附图权利要求书生产胰岛素的方法，包括：通过处理含编码杂种多肽之DNA的细菌细胞，以便表达并且从细胞回收杂种多肽，从而获得含胰岛素原的杂种多肽；在允许形成正确二硫键的条件下，折叠含胰岛素原的杂种多肽，而未经亚硫酸盐解该杂种多肽；使折叠的、二硫键键合的杂种多肽经酶促裂解以产生胰岛素；纯化胰岛素。根据权利要求1的方法，其中步骤(b)还包括将杂种多肽保温。根据权利要求2的方法，其中在4-37^的温度下进行保温。根据权利要求2的方法，其中保温进行1-30小时。根据权利要求2的方法，其中在pH8.5-12.0下进行保温。根据权利要求2的方法，其中在存在抗坏血酸的条件下进行保温。根据权利要求6的方法，其中在折叠混合物中，抗坏血酸的浓度为每摩尔SH基1-10摩尔抗坏血酸。根据权利要求5的方法，其中pH为11.0-11.25。根据权利要求6的方法，其中pH为11.0-11.25。根据权利要求1的方法，其中步骤(c)还包括：(I)将pH调到8.8-9.0；和(ii)在16-37^用胰蛋白酶和羧肽酶B裂解杂种多肽30分钟-16小时。根据权利要求1的方法，其中步骤(d)还包括用DEAE-Sepharose层析和RP-HPLC纯化。根据权利要求1的方法，其中步骤(d)还包括用超滤和CM-Sepharose层析纯化。根据权利要求1的方法，其中步骤d)还包括用DEAE-Sepharose层析和苯基-Sepharose层析。根据权利要求1的方法，其中用ATCC保藏号为69361的质粒pDBAST-LAT表达胰岛素原杂种多肽。根据权利要求1的方法，其中用ATCC保藏号为69363的质粒pABAST-LAT表达胰岛素原杂种多肽。根据权利要求1的方法，其中用ATCC保藏号为69362的质粒pBAST-R表达胰岛素原杂种多肽。根据权利要求1的方法，其中所述处理包括存在葡萄糖，甘油或半乳糖的条件下发酵。根据权利要求1的方法，其中所述回收包括：(I)破坏所述细菌细胞的细胞壁或其片段以产生溶胞产物；通过离心从溶胞产物中分离细胞内沉淀物；和溶解所述沉淀物。说明书生产人胰岛素发明背景在本发明说明书中，用括号内的阿拉伯数字列出了各种文献。在说明书后，权利要求前可以找到这些参考文献的所有引述。将这些文献公开的所有内容均引入本说明书作为参考以便更全面地描述本发明所涉及的现有技术的状态。胰岛素是控制葡萄糖代谢所必需的多肽激素，每天施用给患糖尿病的患者，糖尿病是胰岛素供应不足而引起的代谢紊乱。体内，首先将该激素合成成长前体分子，随后加工成由A和B链组成的其生物活性形式。更详细地说，在内分泌胰腺的0细胞内，将前原胰岛素的基因转录成mRNA前体，然后剪接生产成熟mRNA。将所述mRNA翻译成前原胰岛素(NH2-前区-B链-C肽-A链-COOH)，接着再加工成胰岛素原并最终加工成胰岛素。该过程的第一步就是蛋白水解除去前区，该区是通过内质网的微粒体膜来转移新链的疏水信号序列。在人前原胰岛素中，前区的长度是24个氨基酸。在胰岛素原中，将变成成熟胰岛素的多肽链的两个区，B-和A链通过C肽(或C-链)彼此相连，所述C肽在N和C末端含有两对碱性氨基酸。在大多数C肽中，这些配对是Arg-Arg和Lys-Arg。人C肽，包括两个侧对的碱性氨基酸，含有35个氨基酸。C肽与所述多肽的两个部分相连以便有助于在B和A片段之间形成二硫键。因此，C肽的作用很大程度上不依赖其结构。事实上，用较短的合成桥键代替仍能适当地折叠胰岛素原分子(1，2)。胰岛素原折叠，同时发生两个链间二硫键和一个A链二硫键的氧化。在成熟化的最后阶段，蛋白水解酶在碱性氨基酸处裂解以释放C肽并形成成熟胰岛素(3)。在人胰岛素中，A链有21个氨基酸，B链有30个氨基酸。世界上每年胰岛素的需求超过数吨，而且严重供不应求。传统上，胰岛素是从有限的动物源中生产的，主要是牛和猪胰腺制品，它们不同于人胰岛素，因此会引发有害的免疫反应。在六十年代完成的研究表明，可以体外生产胰岛素。通过用其S-磺化形式(4)将A和B链结合或通过自发再氧化还原的胰岛素原(5)来合成胰岛素。后一种方法由于在氧化混合物中蛋白质浓度很低，不能用于大规模生产胰岛素。在用胰蛋白酶和羧肽酶B处理后(6)，可以回收胰岛素。最近半合成和生物合成的(重组)人胰岛素也可以得到。半合成的人胰岛素是通过胰蛋白酶催化B链30位的Ala换成Thr(是猪胰岛素和人胰岛素之间的唯一不同)而从猪胰岛素生产的。在大肠杆菌或酵母中生产的重组人胰岛素最终将取代所有其它生产途径。现在通过两种途径制备半合成重组人胰岛素：在大肠杆菌中分开生产A和B链，然后将其结合在一起(7,8)，或酶促转变在大肠杆菌(1，8)或酵母(2,9冲表达的胰岛素原等多肽。在大多数情况下，胰岛素原是作为杂种蛋白质而生产的，以细胞内沉淀蛋白质的形式积累。正常纯化所述杂交物，然后用CNBr裂解以释放胰岛素原多肽。后者再通过氧化亚硫酸盐解(sulfitolysis)修饰得到胰岛素原S-磺酸盐。然后在还原条件下纯化并折叠胰岛素原S-磺酸盐，得到胰岛素原(8).通过胰蛋白酶和羧肽酶B(6)的联合作用将胰岛素原转变成胰岛素。专利公开EP195691(NovoNordiskA/B)描述了分子式为B-Lys-Arg-A的胰岛素原以及其用于在酵母中制备胰岛素的用途。专利公开EP196056B1(ChironCorp.,)描述了用酵母生产的hSOD-胰岛素原蛋白质。在折叠前，使hSOD-胰岛素原蛋白质经漠化氰裂解和亚硫酸盐解。Hoechst在EPO379162中描述了可以将〃胰岛素前体的错重组体〃(即，有不正确或部分不正确分子间二硫键的重组胰岛素产物不通过亚硫酸盐解，而是在有机氧化还原系统的存在的条件下，在含水介质中通过将错重组体与过量硫醇反应而转变成正确的胰岛素产物。在氨基酸或肽基从融合多肽裂解后(化学或酶促)(发生在宿主细胞溶解后)进行源(original)亚硫酸盐解(sulfitolysis)步骤，因为然后要将胰岛素前体的6个半胱氨酸转变成其S-磺酸盐。在随后的复性步骤中，通过形成三个正确的二硫键而从所述胰岛素原S-磺酸盐生产天然胰岛素原。在该复性步骤，产生了所谓“错重组体”。Hoechst在PCTWO91/03550中还公开了制备含所需蛋白质(如胰岛素原)和“平衡组分”的方法。亚硫酸盐解在折叠前完成，而在折叠后，与胰岛素原的C-链同时裂解掉“平衡组分”。另外，Hoechst在EP347781B1中描述了“小胰岛素原”(B-Arg-A)和其用于致病单-Arg胰岛素和胰岛素的用途。他们还描述了含有B-Arg-A和“平衡组分”的融合蛋白质。在折叠多肽前，用漠化氰裂解“平衡组分”并完成亚硫酸盐解。本发明公开了用改进并有效的方法生产重组人胰岛素。在大肠杆菌中合成含有前导序列的重组胰岛素原杂种多肽。部分纯化后，在可以进行之前折叠的条件下，将其折叠，但仍连接着前导肽。然后通过用胰蛋白酶和羧肽酶B结合处理而产生有生物活性的人胰岛素，其中这些酶同时裂解掉了前导肽和C链。因此生产的纯化人胰岛素与天然产生的人胰岛素相同。在杂种多肽的CNBr裂解和用于保护丰富SH基团的亚硫酸盐解中所涉及的有害和麻烦的过程在所述新方法中除去了，因为可以将完整的胰岛素原杂种多肽有效折叠成其天然结构，甚至是在存在前导肽和未保护的半胱氨酸的情况下。通过酶促裂解释放活性重组人胰岛素，然后将其纯化。附图的简要描述在附图3-5中所列三个质粒的限制图谱中，并未鉴定出在这些质粒上的所有限制位点。但是，列出了完全理解本发明所必需的那些限制位点。图1：通过酶促裂解表达质粒pBAST-R而产生的折叠的、二硫键结合的胰岛素原杂种多肽，从而得到人胰岛素。只表明了部分SOD前导序列。图2：通过酶促裂解表达质粒pBAST-LAT或质粒p入BAST-LAT而产生的折叠的、二硫键结合的胰岛素原杂种多肽，从而得到人胰岛素。只表明了部分SOD前导序列。图3：质粒pBAST-R的结构，编码SOD-胰岛素原杂种多肽的表达质粒，保藏号为ATCC69362。图4：质粒pDBAST-LAT的结构，编码SOD-胰岛素原杂种多肽的表达质粒，保藏号为ATCC69361。图5：质粒p入BAST-LAT的结构，编码SOD-胰岛素原杂种多肽的表达质粒，保藏号为ATCC69363。图6：用质粒pBAST-R表达的SOD-胰岛素原杂种多肽的氨基酸序列和相应的DNA核苷酸序列。图7：用质粒pDBAST-LAT和p入BAST-LAT表达的SOD-胰岛素原杂种多肽的氨基酸序列和相应的DNA核苷酸序列。图8：人胰岛素生产，来自用质粒pDBAST-LAT表达的胰岛素原杂种多肽，作为折叠混合物pH的函数。在4°C，经16小时，用1mg/ml或0.5mg/ml杂种多肽，在100mM甘油中，于不同pH完成胰岛素原杂种多肽的折叠(按实施例2所述生产的)。37C，pH9用(胰蛋白酶1:500w/w)(Sigma)和羧肽酶B(CPB，Sigma，1:200w/w)将折叠材料处理30分钟，然后通过利用125I-胰岛素(Amersham)和人重组胰岛素(Calbiochem)为标准的放射性免疫检测法检测免疫反应性(IR)。图9：用质粒pDBAST-LAT表达的胰岛素原杂种多肽生产人胰岛素将胰岛素原杂种多肽（按实施例2所述生产的）溶解在8M脲，浓度为约30mg/ml的5mMHCl,然后用100mM甘油-NaOH稀释1mg/ml，pH11.0中。在22°C（室温）折叠20小时。然后用HCl将pH调到8.8。加入羧肽酶B（1：1000w/w,Sigma）和胰蛋白酶（1：2000w/w,Sigma）在37C将反应混合物保温60分钟。在用10mMHCl稀释前，将消化混合物酸化到pH3。在250X4mm,5pLichrosphere100RP-8柱（Merch）上，通过反相高压液体层析（RP-HPLC）分析150pl的样品，所述柱用含31.5%（v/v）乙月青的50mM磷酸四乙胺，162mMNacl4,pH3平衡。用31.5%-40.5%乙青的现象梯度，在75分钟内，以1ml/分的流速使该柱展开。检测在220nm的吸收值。A：5ug标准胰岛素（Boehringer-Mannheim）；B：酶促处理后产生的重组人胰岛素；C：折叠的SOD-胰岛素原杂种多肽。图10：质粒pDBAST-LAT表达的胰岛素原杂种多肽生产人胰